全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 2期，2005年 4月 215
RNA 干涉及其在植物功能基因组学研究中的应用
杨坤 王琦 李艳红*
首都师范大学生命科学学院，北京100037
RNA Interference and Its Application in Researches of Plant Functional Genomics
YANG Kun, WANG Qi, LI Yan-Hong*
College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037
提要 介绍了 RNA 干涉(RNA interference)过程中所涉及到的一些关键因子以及其在植物基因功能和抗病毒研究中的最新
研究进展。
关键词 RNA 干涉；双链 RNA；植物基因功能
收稿 2004-04-19 修定 　 2004-12-27
资助　 北京市科技新星计划项目(H013610020112)。
*通讯作者(E-mail: liyhzx@ceh.ac.uk, Tel: 010-68901692)。
1998 年，Fire 等[1]首次在秀丽新小杆线虫
(Caenorhabditi elegans)中发现，将体外转录得到
的单链 RNA 经纯化后注射入线虫，基因抑制效应
即变得十分微弱，而经过纯化的双链 RNA 则能高
效特异性地阻断相应基因的表达，这一现象称为
RNA 干涉(RNA interference，RNAi)。在随后的
2 年内，人们相继发现 RNA 干涉现象广泛存在于
植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大
鼠、小鼠、猴等几乎所有的真核生物中[ 2 ]。迄
今，RNAi 发生机制的研究已取得了一定的进展，
现对这一现象的研究概况作一些介绍。
1 RNAi涉及的因子
1.1 双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA) 在
R N A i 过程中，d s R N A 起了至关重要的作用。
dsRN A 可因 RN A 病毒的入侵、转座子转录、基
因组中反向重复序列转录而产生。它既可以是分
开的 2 个 RNA 分子互补形成分子间双链，也可以
是一个 R N A 分子回折，自身互补，形成分子内
双链。RNAi 的触发依赖于 dsRNA 的产生，然后
dsRNA 与细胞中的特定蛋白质复合物结合，启动
相关蛋白质结合到 dsRN A 分子上，再在依赖于
RNA 的 RNA 聚合酶的作用下，引发 dsRNA 分子
的扩增效应，产生更多的dsRNA。同时，RNase III
特异地识别dsRNA，将其降解成21~25 nt双链小
RNA。这些带有21~25 nt 双链小 RNA 的蛋白复合
物结合到 mRNA 分子上去，双链小 RNA 可以识别
与其同源的 mRN A，如果 mRNA 序列可以与双链
小 RN A 互补，则双链小 RN A 与 mR N A 序列发生
链交换，结合在蛋白质复合物上的RNase III将与
小 RNA 反义链配对的 mRNA 切断，最终导致 RNA
干涉的发生。这些说明双链 RNA 在整个 RNAi 发
生过程中的作用非常重要。
1.2 小的干涉RNA(small interferenced RNA, siRNA)
　不同情况 siRNAs 诱导 RNAi 的效率不同，最有
效的siRNA是21个碱基大小，3端有两个碱基突
出的双链 RNA，它能使靶 RNA 和蛋白水平降低
90 % 以上。si R N A 对靶序列专一性要求非常严
格，与靶 mRNA 之间的 1 个碱基错配都会显著削
弱基因沉默的效果。
修饰或错配的核糖核酸多集中在5内部位置
或距siRNA双链 3端一半的位置。研究表明，5
端的完整性相对于siRNA距3一半的位置对RNAi
的发生更加重要[3,4]。这也说明siRNA结构的不对
称性是诱发RNAi发生所必需的，5端的完整性对
于RNAi 的发生是不可缺少的，但它也会因 3 端
的修饰而有所减弱。
有人用体外培养的哺乳动物细胞研究发现，
siRNA的两条链在诱导产生RNAi 过程中的作用不
同[5]。发生在其反义链的唯一的1个碱基错配就会
导致 RNAi 的明显降低，而如果正义链上出现这
信息与资料 Imformation and Data
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种错配就不会干扰RNAi的发生；而且发生在反义
链而不是正义链的3端2-羟乙基磷酸盐的替换也
会阻止RNAi现象，当用2-O,4-C-乙烯胸苷修饰
siRNA的 3 末端时，不论是正义链还是反义链均
会完全消除RNAi。这进一步说明化学修饰的性质
不同也会导致siRNA的两条链对RNAi有不同的影
响[3]。
1.3 stRNA(small temporal RNA) 最近，发现有
一组小分子 RNA(stRNA)，它们是 70 nt 的单链
RNA 折叠成茎环结构后形成的，也是由 Dicer 酶
加工而成的。这些RNA包括22 nt的lin-4和let-7
RNA，stRNA 可与目标 mRNA 的 3 非翻译区结合，
阻止靶 mRNA 的翻译，进而在生物发育过程中起
短暂的调节作用。
1.4 MicroRNA(miRNA) miRNA存在于各种不同
生物中，包括植物、果蝇甚至人等。一般
miRNAs 具有以下特点：(1)miRNA 必须是 20~24
nt，用Northern blot可以观察到；(2)RNA具有与
侧翼基因组序列配对的潜力，含有成熟 miRNA 的
不完整的 R N A 的双链体，为转录加工过程必需
的。典型的 miR N A 是来自于基因组的片段，但
不是蛋白质翻译区[5~7]。大多数miRNA基因来自不
同的转录单元，它们的转录一般不是从他们自己
的起始子，而是从内含子开始[8~11]。miRNA 也可
通过Dicer加工形成，一些证据表明，22 nt未编
码的 RNA 分子在真核生物中作为基因表达的调节
因子起作用[11]。
1.5 RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced si-
lencing complex, RISC) RISC是一种核酸和蛋白
质的复合物(包括蛋白质和siRNA)，可以将同源的
mRNA 分解成 siRNA。RISC 已经在果蝇和人类细
胞中得到纯化，而且都含有Argonaute蛋白家族
的成员[12]，这种蛋白被认为是该复合物的核心成
分[13~15]。Tabara等[16]的研究表明Argonaute蛋白质
RDE-1、QDE2 和 AGO1 是 RNAi 过程中至关重要
的成分，其作用与蠕虫、果蝇和植物中的干涉过
程类似[16~18]。Argonaute及其同源蛋白质的分子量
大约有 100 kD，称为 PPD 蛋白质，均含有 PAZ
和 PiWi 结构域。PAZ结构域有一个很稳定的褶层
和一个b-桶状中心，侧旁的附属物能与长于5 nt
的单链 RNA 和双链 RNA 呈现很弱的结合[19~21]。由
于这种双重结合能力，所以Argonaute蛋白识别目
标 mRNA 之前或之后都能与 siRNA 结合。
1.6 siRNA、miRNA 与 RISC 的相互作用 siRNA
或 miRNA 双链与 RISC 结合的链几乎都是 5 末端
配对不太紧密的链[22,23]。判断双链中的哪条链与
RISC 结合得更好，可用动物实验进行观察，现
在也应用于植物的siRNA[23]和 miRNA 中。一些脊
椎动物和昆虫基因，它们的 miRN A 双链同时与
RISC 结合，因此推测 2 条链中有1 条或 2 条会起
作用[6,22,23]。miRNA或 siRNA可以通过两种转录后
基因沉默机制中的任意一种来指导RISC抑制基因
的表达：一种是通过降解目标 mRNA；另一种是
通过抑制 m R N A 的翻译。两种机制中选择哪一
种，是根据目标 mRN A 的特性确定的：当 mRN A
与细胞中的 RISC 结合时，如果 mRNA 的翻译区
与RISC 中的 miRNA 或 siRNA 有足够的互补区域，
则 mRNA 将被特异地降解；如果没有足够的互补
区，RISC 中的 miRNA 或 siRNA 则与 mRNA 的不翻
译区结合，特异性地抑制mRNA 的正常翻译[4,14]。
1.7 RNA诱导的转录后基因沉默起始复合物(RNA-
induced initiation of transcriptional gene silencing,
RITS) RITS是一种 RNAi的执行因子，裂殖酵母
异染色质的形成过程中需要RITS复合物。该复合
物包括Ago1(裂殖酵母Argonaute同源物)、Chp1
(一种与异染色质相关的染色质区域的蛋白)和Tas3
(一种新蛋白)，还包括通过Dicer核酸酶加工产生
的小RNA(这些小RNA 与着丝粒的拷贝同源，且与
异染色质中的 RITS 定位有关)[24]。
2 RNAi在植物研究中的应用
2.1 植物基因功能的研究 RNAi已成功地应用于单
个基因和基因家族中的多个成员的沉默[25~27]，植
物中运用转基因所形成的 RNAi 可以遗传到下一
代[28]，产生基因表达效应较低的转基因植物，导
致植物表现出相应的缺失表型，可用于研究基因
功能。
拟南芥是研究植物生长发育过程中基因功能
的重要模型植物，主要通过构建正义、反义 RNA
和 dsRNA 载体，采用农杆菌介导法来转化植物基
因，正义、反义 RNA 可产生弱的基因干涉功能。
dsRNA 在拟南芥中作用有如下特点：(1)在 dsRNA
植物亲代中，ap1 基因以孟德尔方式遗传，其效
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应可持续到子代，从而可提示 dsRNA 基因是否可
整合到植物基因组中；(2)dsRNA 能够非常特异地
只降解与之序列相应的单个内源基因的 mR N A；
(3)载体中两条链表达强度有差异，如果选用两个
强度相等的启动子则会产生共阻遏效应，从而影
响dsRNA 的干涉效应，因此必须选用强度不同的
两种强启动子才能产生强的dsRNA作用；(4)拟南
芥的组织对 dsRNA 耐受性不同。dsRNA 是研究拟
南芥生长及发育基因功能的有效手段。原位杂交
显示，ag mRNA 累计的下降与ag(RNAi)突变体严
格表现型的增加是相关的，因此通过该实验现象
可以推测内源 mRNA 是否是 dsRNA 介导的 RNAi 的
靶物质[29~31]。
运用RNAi技术生产咖啡因较低的咖啡豆已成
功在即。目前采用的除去咖啡豆中天然咖啡因的
技术既昂贵又会影响咖啡味道，日本奈良先端科
学技术大学基因教育研究中心植物细胞工学部门佐
野浩实验室，已发展出一个用RNAi的基因工程降
低咖啡豆中的咖啡因含量的技术(http://www.bioon.
com)。咖啡树中的咖啡因是黄苷经过 3 个转甲基
酶逐步添加甲基后转变成的，该实验室用RNAi抑
制第二个转甲基酶——咖啡因合成酶(theobromine
synthase)基因的表达，阻断黄苷转变咖啡因的过
程后，结果生长 1 年的咖啡树叶子中咖啡因含量
降低 5~7 成。
通过RNAi技术寻找ABA受体已有了突破。细
胞生物学和电生理学的技术已经验证，植物保卫
细胞内外均有 ABA 受体，用 RNAi 技术将其转化
拟南芥，可形成几个突变体，其中一个对 ABA 不
敏感，实验证明此蛋白可能是 G 蛋白偶联 ABA 的
受体(http://www.bioon.com)。
2.2 植物抗病毒的研究 自然状态下，病毒在植物
体内不正常复制中断时会产生 dsRNA，引发植物
体的 RN A i，降解病毒基因组，因此，RNA i 系
统是植物天然的病毒防御系统。利用RNAi赋予植
物病毒抗性的原理在于：人为将与病毒同源的
dsRNA 导入植物体，基于植物体的 RNA 干扰机制
对病毒基因组进行特异性切割降解，阻止病毒的
复制扩散，从而保护植物体不受病毒危害。
通过各种方式利用 RNA 介导的干扰技术进行
植物抗病毒的研究中，应用方式最多的是用农杆
菌介导的转化使可表达dsRNA的 T-DNA 片段整合
到植物体基因组，然后检测转化体对病毒的抗
性；或者用农杆菌瞬时转化系统，在 dsR N A 瞬
时表达期间对植物体进行病毒感染检测，以确定
dsRNA介导的病毒抗性的有效性。Kalantidis等[32]
在转有黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus, CMV)
反向重复序列的再生烟草植株中，检测到一个完
全抗性的株系，并且发现烟草病毒抗性直接与
siRNA的产生相关。Wang等[33]利用含有大麦黄矮
病毒(barley yellow dwarf virus, BYDV)PAV株系的
复制酶基因片段，将其设计成可产生发夹结构的
反向重复序列，并将该外源序列导入大麦，在25
个转化系中，有 9 个转化系表现出强的抗性；稳
定遗传的2个株系后代中，ELISA(enzyme-linked
immunosorbent assay)检测不到接种病毒的存在。
Tenllado和Diaz-Ruiz[34]观察了以直接注射和农杆菌
介导转化两种方式将病毒基因序列来源的 dsRNA
导入植物叶片细胞后的效果，发现两种方式都可
成功干扰烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,
TMV)、马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY)和苜
蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)这3种病毒
的侵染过程。Pandolfini等[35]的实验结果表明，即
使导入烟草的李痘病毒(plumpox virus, PPV)病毒
基因组片段含有内含子序列，在转化体中也可以
检测到转化片段 siRNA 的存在，并表现出对 PPV
侵染的系统抗性。这一现象说明，诱导 RNAi 的
dsRNA 分子中含有可剪接的内含子不影响它的诱
导功能。
采用RNAi技术以工程化的手段赋予植物体病
毒抗性具有高度可行性，为植物抗病毒基因工程
研究提供了又一特异而高效的抗性手段。尽管在
R N A i 研究中还存在一些尚未明确的问题，如
RNAi 介导的异染色质化、系统性沉默、病毒编
码的沉默抑制蛋白等问题，可以在深入研究其机
制的同时开展一些RNAi介导的作物抗病毒育种研
究。这不但有助于进一步发现、解决 RNAi 研究
中的一些问题，也可为农业生产发展发挥一定的
作用。
3 结语
总之，RNAi技术的发现已经为我们深入了解
基因功能、疾病发生以及植物 - 病毒互作关系提
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供了一个简捷、高效的特异性手段。目前，采用
RNAi 技术进行植物体发育过程中基因功能的研
究，植物体内致病基因、细胞程序性死亡有关基
因的研究，动物的工程化抗病毒研究等还很少，
这也为 RNAi 技术更广泛的应用提供了广阔的空
间。
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