全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 469
采用RNA干扰技术分析拟南芥Ca2+泵基因ECA1的功能
朱炜 1,2，黄丛林 1，张秀海 1，王永勤 1，魏建民 2，于荣 3，吴忠义 1,*
1北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心，北京 100097；2内蒙古农业大学生物工程学院，呼和浩特 010018；
3首都师范大学生命科学学院，北京 100037
提要：构建了含拟南芥 Ca2+泵基因 ECA1特异片段反向重复结构的 RNA干扰(RNAi)载体，以根癌农杆菌介导转化拟南
芥，用卡那霉素筛选和PCR检测，获得了11个T3代纯合体转基因株系；半定量RT-PCR方法检测ECA1在转基因株系中
转录的结果表明，其转录产物比野生型(WT)明显低，且转基因株系之间差异明显，表达水平有一个梯度关系；在1/2MS
培养基上转基因株系与野生型的差异不明显，相对于野生型而言，在相对低Ca2+ (0.2 mmol·L-1)或相对高Mn2+ (0.5 mmol·L-1)
的培养基上的转基因株系生长受到不同程度的抑制，ECA1转录量越低，生长受到的抑制越大。据此认为：ECA1对植物的
生长发育和抵御逆境胁迫有作用。
关键词：Ca2+泵；RNA干扰(RNAi) ；转录后基因沉默
Analysis of ECA1 Function by RNA Interference in Arabidopsis thaliana
ZHU Wei1,2, HUANG Cong-Lin1, ZHANG Xiu-Hai1, WANG Yong-Qin1, WEI Jian-Min2, YU Rong3, WU Zhong-Yi1,*
1Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097, China;
2College of Biology Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 3College of Life Sciences, Capital
Normal University, Beijing 100037, China
Abstract: The RNA interference (RNAi) vector containing ECA1 (endoplasmic reticulum-type calcium-trans-
porting ATPase 1) gene-specific sequences in the sense and antisense orientations was constructed and trans-
formed into Arabidopsis thaliana plant by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, and 11 ho-
mozygous transgenic lines were obtained through kanamycin screening and PCR assays. The transcriptional
product of ECA1 in transgenic lines was obviously reduced comparing with that of wild type (WT) by semi-
quantity RT-PCR analysis. In addition, there were some remarkable differences in ECA1 mRNA products be-
tween transgenic lines. But there was no significant difference between transgenic lines and wild type growing
on 1/2MS medium. However, the growth of transgenic lines was inhibited on media containing low Ca2+ (0.2
mmol·L-1) or high Mn2+ (0.5 mmol·L-1) as comparison with that of wild type. The tolerances to low Ca2+ or high
Mn2+ were consistent with the mRNA level of ECA1. Therefore, we propose that ECA1 plays an important role
in plant growth and stress tolerance.
Key words: calcium pump; RNAi; post-transcriptional gene silencing
收稿 2008-03-19 修定 2008-05-20
资助 国家自然科学基金(30400228、30600318)和北京市自
然科学基金(5 0 6 2 0 1 2 )。
* 通讯作者(E-mai l：zwu2 2@126 .com)。
Ca2+对植物的生长发育至关重要，它不仅是
细胞中的营养离子，还是植物细胞中普遍存在的
信号物质(Bush 1995)。Ca2+作为营养成分，是植
物细胞壁的组成成分和一些酶类的活化剂(如ATP
酶、琥珀酸脱氢酶等)，参与光合放氧，可提高
细胞膜的稳定性。Ca2+作为胞内的第二信使，它
在植物转导各种逆境信号中起调控作用(Gilroy和
Trewavas 2001)。
植物细胞中的 Ca2+浓度是受严格控制的，植
物对细胞内 Ca2+浓度的调节依赖于定位在不同细
胞器和质膜上的 Ca2+通道(calcium channel)、Ca2+
泵(calcium pump)和 Ca2+/H+反转运子(calcium pro-
ton antiporter)的活性(Sze等 2000；Schumaker和
Sze 1986；Subbaiah和 Sachs 2000)。相比于 Ca2+
通道而言，Ca2+泵和Ca2+/H+反转运子的作用很少
受到重视，但是Ca2+泵和Ca2+/H+反转运子的作用
不容忽视。有证据表明，Ca2+泵和Ca2+/H+反转运
子可调控 Ca2+信号出现的幅度、频率和持续时间
(Berridge等 2000)。
钙离子泵(Ca2+-ATPase)属于 P-型ATPase家
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族，直接用 ATP 驱动离子转运。迄今为止，植
物中已发现数种 Ca2+泵，主要分为两类：内质网
型(ER-type calcium ATPase，ECAs)和自我抑制型
(autoinhibited calcium ATPase，ACAs) (Sze等
2000)。ECA1和ACA2两者都定位于内质网膜上
(Harper等 1998；Liang等 1997)，ACA2可以运输
Ca2+，ECA1可运输 Ca2+、Mn2+等二价阳离子(Wu
等2002)，但他们是如何分工与合作的？其生理功
能还不清楚。
近年来已证明，RNA干扰(RNA interference，
RNAi)技术是比较有效的抑制基因表达的方法之一
(Fire等 1998)。本文以构建的拟南芥 Ca2+泵基因
ECA1的 RNAi载体，通过根癌农杆菌转化拟南
芥，在转录水平上引起 Ca2+泵基因 ECA1特异降
解，并以之研究Ca2+泵基因的功能，同时用RNAi
转基因株系研究 ECA1的功能。
材料与方法
野生型(WT)拟南芥(Arabidopsis thaliana，
Columbia生态型)种子、根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens，GV3101)、中间载体 PUC18、双元
载体 pGreen0029、大肠杆菌DH5α均来自北京市
农林科学院北京农业生物技术研究中心花卉实验
室。
限制性内切酶、T4 DNA连接酶、去磷酸化
酶、EX Taq DNA聚合酶均为 Takara公司生产，
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为Amresco公司生
产，RNA提取试剂盒为 Invitrogen公司生产，胶
回收试剂盒由东胜创新公司生产，其他试剂购自
上海生工公司，引物合成由上海生工公司完成，
测序由三博公司完成。
CTAB法提取拟南芥基因组DNA (王关林和方
宏筠 2002)。设计针对钙泵基因 ECA1特异引物
ECA1-UP (5 GTTGGATCCGTGATGGGACTAAG-
GTTTC 3 )和 ECA1-LOW (5 ATTGGATCCGG-
TATCTTCCTCGTGTTGT 3 )，PCR扩增得到 350
bp外显子片段。先将此片段以正、反向分别连入
PUC18载体，并在正、反向片段之间连入绿色荧
光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因(725
bp)，然后用 BamHI和 PstI双酶切，回收此片段
(约 1 450 bp)，然后将此片段连入已经连有 35S启
动子、增强子、NOS终止子的 pGreen0029载体
上，构建成 RNAi载体 pGreen0029-ECA1-Sense-
GFP-ECA1-Antisense (E1-G-E1) (图 1)。将 E1-G-
E1转化DH5α感受态细胞，在卡那霉素平板上筛
选抗性克隆，用 BamHI和 PstI双酶切鉴定。然
后用单引物 ECA1-UP进行 PCR扩增，经鉴定确
认，ECA1-Sense和 ECA1-Anti Sense插入方向正
确后将样品送出测序，并用于后续实验。
将构建好的载体 E1-G-E1和辅助质粒 p-Soup
图 1 沉默 ECA1的RNAi载体
Fig.1 RNAi vector for ECA1 silence
同时转入根癌农杆菌GV3101，以空载体作对照，
在含 50 µg·mL-1卡那霉素、40 µg·mL-1庆大霉素、
20 µg·mL-1四环素和 50 µg·mL-1利福平的四抗平板
上筛选阳性菌株，挑单菌落，PCR鉴定为阳性。
挑取阳性农杆菌接种于液体四抗培养基上，
于 28 ℃、转速为 200 r·min-1条件下，过夜培养
至OD600达 0.8~1.5，离心收集菌体，用渗透培养
液重悬，OD600达 1.0~1.5为止。
将重悬后的农杆菌菌液倒在小烧杯里，静置
1 h后，将刚开花的拟南芥的培养皿倒扣于其上，
保证莲座以上部分浸没于菌液中，5 min后取出，
装入黑色塑料袋中，12 h后取出，4~5 d后再侵
染一次，待种子成熟后，收获种子(Clough和Bent
1998)。
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将种子消毒后播种于含50 µg·mL-1卡那霉素的
MS 培养基上，初步筛选出转基因苗。
CTAB法提取拟南芥基因组DNA，设计GFP
特异引物GFP-up (5 AGCAAGGGCGAGGAGCT-
GTTCA 3)和 GFP-low (5 GCTTCTCGTTGG-
GGTCTTTGCT 3)，转基因株系预期扩增出 623
b p 的片段。
对T0代具有卡那霉素抗性的转基因株系进行
PCR检测，分别收取 PCR检测为阳性的转基因株
系的种子(T1) ；将单株转基因拟南芥种子消毒后播
种在含 50 µg·mL-1卡那霉素的MS培养基上，由
于基因分离，未转入外源基因的幼苗会死去，将
存活的幼苗移栽在营养土中，种子成熟后，分别
收取单株种子(T2) ；再播种在含 50 µg·mL-1卡那霉
素的MS培养基上，由于基因分离，未转入外源
基因的幼苗会死去，将存活的幼苗移栽在营养土
中，种子成熟后，分别收取单株种子(T3) ；再播种
在含 50 µg·mL-1卡那霉素的MS培养基上，如果
其后代全部存活，即基因不发生分离，说明此 T3
种子为转基因纯合体，若还有分离，则继续按上
述方法筛选，直至获得纯合体。
按照 Invitrogen公司的Trizol试剂盒提供的方
法提取拟南芥叶片总 RNA，经过琼脂糖凝胶电泳
和紫外分光光度计检测确认无降解后，可进行反
转录。分别以野生型和转基因纯合体株系的
cDNA为模板，ECA1-UP和 ECA1-LOW为引物，
PCR扩增，预期得到 350 bp的条带。以拟南芥
延伸因子基因(EF-1α)为内参设计引物EF-1α-up (5
GTGACAATGGAACTGGAATGG 3)和EF-1α-low
(5 AGACGGAGGATAGCGTGAGG 3 )，PCR扩
增预期得到 545 bp的条带。比较转基因植株和野
生型 ECA1的转录量。
在低Ca2+处理时，将转基因株系T3代纯合体
和野生型播种于 1/2MS培养基上，于 23 ℃、16
h光照(光照强度为 100 µmol·m-2·s-1)和 8 h黑暗条
件下，培养 5 d后转移到含 0.2 mmol·L-1 CaCl2的
培养基上生长 10 d，拍照。实验重复 3 次。
在高Mn2+处理时，将转基因株系 T3代纯合
体和野生型播种于 1/2MS培养基上，于 23 ℃、16
h光照(光照强度为 100 µmol·m-2·s-1)和 8 h黑暗条
件下，培养 5 d后转移到含 0.5 mmol·L-1 MnSO4的
培养基上生长 10 d，拍照。实验重复 3 次。
结果与讨论
1 PCR扩增ECA1特异目的片段
以拟南芥基因组DNA为模板，ECA1-UP和
ECA1-LOW为引物，PCR扩增不含有内含子的特
异片段 E1，产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，可
见 350 bp的条带，与预计的片段大小相符(图 2)，
测序验证确认正确后，用于构建 RNAi载体。
图 2 PCR扩增产物 E1电泳图谱
Fig.2 Electrophoretogram of PCR product of E1
M：D L 2 0 0 0 M a r k e r；1 和 2：E 1。
2 RNAi载体E1-G-E1的构建
按照“材料与方法”中的载体构建方法构建
RNAi载体E1-G-E1，将载体用BamHI和PstI双酶
切，经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见大约 1 450
和 5 500 bp两条带，与预计的片段大小相符(图
3)。由于用单引物ECA1-UP进行PCR扩增可得到
预期 1 450 bp的条带(图 4，第 2泳道)，说明正
反方向插入的片段大小正确，经过测序，序列正
确，表明图 4第 2泳道的模板DNA符合图 1所示
图 3 E1-G-E1的酶切鉴定
Fig.3 Digestion of E1-G-E1 with restricted enzymes
M：DL2000+15000 Marker；1和 2：E1-G-E1经 BamHI/
Ps t I 双酶切。
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RNAi载体结构，将此DNA导入农杆菌GV3101，
用于拟南芥转化。
3 转基因株系T0代PCR检测
农杆菌介导 E1-G-E1转化拟南芥后，收取的
种子经过卡那霉素筛选得到 11株 T0代转基因株
系。分别以 11个 T0代转基因株系基因组 DNA、
1个野生型叶片基因组DNA、载体E1-G-E1 DNA
为模板，GFP-up和GFP-low为引物，PCR扩增，
经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，转基因株系和E1-G-
E1均可扩增出 623 bp的条带，而野生型植株未扩
增出相应条带，初步确定上述 11个转基因株系为
阳性株系(图 5)。这 11株 T0代转基因株系后代种
子可用于筛选转基因纯合体。
4 半定量RT-PCR
分别以11个T3代转基因纯合体株系和1个野
生型的 cDNA为模板，ECA1-UP和ECA1-LOW为
引物，PCR扩增，经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，
可扩增出 350 bp的条带(图 6-a)。电泳结果显示，
11个T3代转基因株系的ECA1基因的转录量比野生
型有不同程度的减少。说明RNAi载体E1-G-E1在
转录水平上对ECA1的干扰是有效的。其中ECA1
转录产物减少量较多的分别为 E1-5、E1-8和 E1-
11，转录产物减少量比较少的分别为 E1-2、E1-
3、E1-6和 E1-7，介于两者之间的分别为 E1-1、
E1-4、E1-9和 E1-10。另外，分别以 11个 T3代
转基因纯合体株系和一个野生型的cDNA为模板，
EF-1α-up和 EF-1α-low为引物，PCR扩增，经
1%琼脂糖凝胶电泳检测，可扩增出 545 bp的条
带(图 6-b)。
5 1/2MS培养基上转基因株系的生长
将转基因株系T3代纯合体E1-1 (图 7-a)、E1-
2 (图 7-b)、E1-5 (图 7-c)和 E1-8 (图 7-d)分别播
图 4 E1-G-E1反向重复结构的 PCR鉴定
Fig.4 Identification of inverted repeat structure
in E1-G-E1 by PCR
M：D L 2 0 0 0 M a r k e r；1 和 2：E1 -G -E 1。
图 5 转基因株系 T0的 PCR检测
Fig.5 Detection of transgenic lines (T0) by PCR
M：DL2000 Marker；1~11：转基因株系E1-1~E1-11；12：野生型植株；13：E1-G-E1。
图 6 RNAi载体 E1-G-E1诱导 ECA1基因沉默的半定量RT-PCR分析
Fig.6 Semi-quantity RT-PCR analysis of E1-G-E1 induced ECA1 silencing
M：DL200 0 Ma rker；1~1 1：转基因株系 E1 -1~E1-1 1；12：野生型对照。a：用引物 ECA1 -UP和 ECA1-LOW RT-PCR
扩增得到 350 bp条带；b：用引物 EF-1α-up和 EF-1α-low RT-PCR 扩增得到 545 bp条带。
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种在含 1.5 mmol·L-1 CaCl2和 0.05 mmol·L-1 MnSO4
的 1/2MS培养基上，以野生型植株为对照，10 d
后，转基因株系与野生型植株根长区别不明显。
图 7 1/2MS培养基上的转基因株系和野生型株系生长比较
Fig.7 Comparison on growth of transgenic and nontransgenic plants grown in 1/2MS
a：E1 -1；b：E1 -2；c：E1 -5；d：E1 -8。
6 转基因株系对钙的反应
将转基因株系T3代纯合体E1-1 (图 8-a)、E1-
2 (图 8-b)、E1-5 (图 8-c)和 E1-8 (图 8-d)分别播种
图 8 仅含 0.2 mmol·L-1 CaCl2的 1/2MS培养基上转基因株系与野生型植株生长比较
Fig.8 Comparison on growth of transgenic and nontransgenic plants grown in 1/2MS contained only 0.2 mmol·L-1 CaCl2
a：E1-1；b：E1-2；c：E1-5；d：E1-8。
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在 1/2MS (1.5 mmol·L-1 CaCl2 )培养基上，以野生
型植株为对照，5 d后转移到含 0.2 mmol·L-1 CaCl2
的培养基上，生长 10 d后，转基因株系 E1-5和
E1-8的根长比野生型植株稍微短一些，而转基因
株系 E1-1和 E1-2的根长与野生型植株无明显差
别。
7 转基因株系对锰的反应
将转基因株系 T3代纯合体 E1-1、E1-2、E1-
5和E1-8分别播种在1/2MS (0.05 mmol·L-1 MnSO4)
培养基上，以野生型植株为对照，5 d后转移到
含 0.5 mmol·L-1 MnSO4的 1/2MS培养基上，生长
10 d后，转基因株系 E1-1 (图 9-a)、E1-5 (图 9-
c)和 E1-8 (图 9-d)比野生型植株叶片变黄程度大，
而且随着培养时间的延长，转基因株系叶片逐渐
枯萎，野生型植株的叶片虽然也出现黄化，但未
枯萎；而转基因株系 E1-2 (图 9-b)的叶片与野生
型叶片都略变黄，但是差异不明显。
总之，R N A i 技术已被证实具有快速、特
异、高效研究基因功能的特点 ( C h u a n g 和
Meyerowitz 2000)。本文采用 RNAi技术获得
ECA1表达受到干扰的转基因株系，其耐受相对
较低 Ca2+ (0.2 mmol·L-1 CaCl2)和相对较高Mn2+
(0.5 mmol·L-1 MnSO4)胁迫的能力降低。这与Wu
等(2002)以ECA1的T-DNA插入突变体得到的结
果一致。说明 RNAi技术用于研究钙离子泵功能
是有效而可行的。从半定量 RT-PCR结果可以看
出，11个转基因株系 ECA1的转录物比野生型植
株均有不同程度的下降，且转基因株系之间差异
明显，基本上呈现出梯度关系。这一方面表明
RNAi转基因株系的ECA1在转录水平上确实受到
不同程度的干扰；另一方面说明，RNAi转基因
株系间基因沉默效果存在差异。
图 9 添加 0.5 mmol·L-1 MnSO4的 1/2MS培养基上转基因株系与野生型植株生长比较
Fig.9 Comparison on growth of transgenic and nontransgenic plants grown in 1/2MS supplemented with 0.5 mmol·L-1 MnSO4
a：E1-1；b：E1-2；c：E1-5；d：E1-8。
参考文献
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