全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第5期，2005年10月652
拟南芥细胞壁关联蛋白激酶融合表达及多克隆抗体的制备
李少琼1 徐朗莱1 陈伟华2 谢静红1 凌永贞1 杨志敏1,*
南京农业大学1生命科学学院, 2动物医学院, 南京210095
Fusion Expression of Cell Wall-associated Kinase 1 and Its Polyclonal Anti-
body Preparation of Arabidopsis thaliana
LI Shao-Qiong1, XU Lang-Lai1, CHEN Wei-Hua2, XIE Jing-Hong1, LING Yong-Zhen1, YANG Zhi-Min1,*
1College of Life Science, 2College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
提要 为了研究拟南芥中细胞壁关联蛋白激酶 1 (WAK1)基因功能，通过 RT-PCR 得到 WAK1 cDNA 片段，将其亚克隆至
pET28a 表达载体中进行表达，获得融合蛋白。用纯化的融合蛋白 pET28a WAK1 免疫家兔，得到抗 WAK1 抗体。Western blot
结果显示该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原，抗 WAK1 的抗体对拟南芥中的 WAK1 蛋白具有高度的特异性。
关键词 WAK1 基因；拟南芥；原核表达；多克隆抗体
收稿 2005-01-11 修定 　2005-04-07
资助 国家自然科学基金(30070447)。
*通讯作者(E-mail: zmyang@njau.edu.cn, Tel: 025-
84395057)。
细胞壁关联蛋白激酶(cell wall-associated
kinase，WAK)是近年来新发现的一种类受体蛋白
激酶[1,2]。已知在拟南芥细胞中被鉴定的 WAK 胞
质外结构域具有类似于哺乳动物表皮生长因子的重
复序列，它们能与细胞壁内果胶组分紧密结合[3]。
WAK 分子除上述特征结构外，还含有一个与细胞
质膜连接的跨膜区，以及定位于胞质内一个Ser/
Thr 激酶活性的结构域[4]。此外，有报道认为，
WAK 蛋白结构域在细胞壁中还能与一组富含有甘
氨酸残基的蛋白质相结合，后者能启动胞质内其
它蛋白激酶的活性[5]。因此，WAK 分子的这种结
构与受体蛋白激酶很相似。
目前，在拟南芥中被鉴定出来的 W A K 基因
有 5个成员(WAK 1~5)[3,6~8]。此外，还有21 个成
员的基因结构类似于 W A K 家族，因此被称为
WAK-like (WAKL)基因[5]。研究表明，WAK 主要
参与根的伸长和形态发生[9]，WAK 基因参与植物
对病原菌和机械伤害的反应[ 7 ]。同时还发现，
WAK1表达能保护植物遭受由病原菌生物胁迫诱导
的高水平内源水杨酸所引起的伤害，表明它是一
个病程相关基因。最近，Sivaguru等[5]发现在拟
南芥中，W A K 1 基因表达可以被铝胁迫所诱导。
我们在拟南芥中也发现10 mmol·L-1 Cu2+能迅速诱导
根系 WA K 1 m R N A 和蛋白质的大量表达，表明
WAK1 能介导从胞外到细胞质的信号转导。由于
WAK 及相关基因是一个新发现的蛋白质和基因家
族，迄今为止，人们对 W A K 蛋白的结构和功能
及相关基因特性还缺乏足够的了解[5]。为了深入
研究其功能，我们将 WAK1 基因片段在大肠杆菌
中进行了表达，表达蛋白经电泳纯化后作为抗原
免疫新西兰白兔，制备出了相应的多克隆抗体。
这些结果可供进一步研究 WAK 和相关基因的功能
时参考。
材料与方法
1 试剂和材料
大肠杆菌DH5a、BL21 (DE3)和质粒 pET28a
由本实验室保存。Trizol购自Invitrogen，限制性
内切酶购自Takara公司，反转录酶购自Promega
公司，T4 DNA 连接酶购自 Takara 公司，HRP 标
记的羊抗兔二抗购自南京生兴公司。实验动物——
雄性新西兰家兔购自江苏省农业科学院。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子经0.5%
NaClO 消毒后，用去离子水洗净，漂浮在 1/4 强
度的改良Hoagland 营养液塑料网上催芽生长。培养
条件为：温度(24±1)℃，光照强度100 mmol·m-2·
s-1，14 h·d-1 光照周期。30 d 后，收获叶片，液
氮速冻，于 -8 0℃中冰箱中贮存备用。
2 引物的设计与合成　
根据 GenBank 收录的WAK1基因核苷酸序列，
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设计1对引物: P1, 5 GGTGGTGAATTCGATCTTC-
TGAATCTGCGAAATGTCATGAGGTTCC 3; P2, 5
G G T G G T C T C G A G T A T T T G T A G C G A G A A A A G C A -
AATTGTTGGGACAC 3。引物由大连宝生物工程
有限公司合成。
3 WAK1 基因的 RT-PCR 扩增　
用Trizol试剂提取拟南芥叶片RNA (方法参照
产品说明书)。反转录总反应体系为 25 mL，取
11.3 mL DEPC 处理的去离子水、1 mL RNA (2
mg·mL-1)，加入1 mL Oligo(dT) (0.5 mg·mL-1)，置
于 70℃加热 5 min，立即冰浴5 min，加入 5 mL
5× 缓冲液、dNTP (2.5 mmol·L-1) 5 mL、RNasin
(40 U·mL-1) 0.7 mL、M-MLV (200 U·mL-1) 1 mL，
混匀，置 37℃下 60 min，95℃作用 5 min 灭活
反转录酶，冰浴 5 min。以上述反转录产物为模
板进行PCR。PCR反应条件为：95℃ 2 min；94℃
1 min，58℃ 1 min，72℃ 2 min，循环扩增25
次；最后 72℃延伸 5 min。扩增产物于 1% 琼脂
糖凝胶进行电泳分析。
4 重组质粒的构建和鉴定
RT-PCR 产物经 EcoRI 和 XhoI 双酶切，产物
经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，与经同样酶切的
pET28a 载体连接，构建重组质粒。连接产物转
化入大肠杆菌 DH5a，挑取阳性克隆，提取质粒
并测序鉴定。
5 融合蛋白的原核表达和包涵体的获得
重组质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，37℃
过夜培养。次日，以1∶100 的体积比接种至1 L
含卡那霉素(终浓度为50 mg·mL-1)的新鲜LB 液体
培养基中，37℃振荡培养至 OD600 约为 0.6，加
IPTG 至终浓度为0.1 mmo·L-1，继续在37℃下诱
导表达 3 h，离心收集菌体。菌体重悬于缓冲液
A (50 mmol·L-1 Tris-HCl，含100 mmol·L-1 NaCl、
0.5% TritonX-100，pH 8.0)中，超声裂解细菌，
离心收集包涵体，缓冲液A洗涤 3次后用1% SDS
溶解包涵体。
6 动物免疫及抗血清的制备
溶解的包涵体进行SDS-PAGE 电泳(分离胶浓
度为 12.5%)，考马斯亮蓝染色、脱色后，割取
重组 WAK1 蛋白条带(蛋白含量为 1 mg)，碾碎，
与 1 mL 弗氏完全佐剂混匀，按常规程序免疫家
兔，共免疫 4 次。心脏取血，4℃析出血清，分
离血清，加 0.02 % 叠氮钠，于 -2 0℃中保存。
7 Western印迹
含不同质粒的BL21 (DE3)细菌过夜振荡培养
后，以 1∶100 的体积比接种于新鲜液体培养基
中继续振荡培养，至细菌的 OD 600 值为 0.6，加
IPTG 诱导表达 3 h 后，取 50 mL 菌液离心，沉
淀溶于等体积1×上样缓冲液(SDS loading Buffer)，
煮沸 5 min，各管蛋白质等体积上样进行 SDS-
PAGE(分离胶浓度为12.5%)。5 mA·cm-2(膜)恒流
0.5 h，将蛋白转至硝酸纤维膜上，在封闭液(含
3% 脱脂奶粉的TBS)中 4℃封闭过夜，用含0.05%
Tween-20 的 TBS 洗膜 4 次，每次 10 min。以
1∶5 000 的比例加入一抗，30℃孵育 1 h，用含
0.05% Tween-20 的 TBS 洗膜 4次，每次10 min。
以 1∶300的比例加入带有HRP标记的羊抗兔的二
抗，30℃孵育1 h ，用含0.05% Tween-20的 TBS
洗膜 4 次，每次 10 min，加 TMB 显色。
实验结果
1 原核表达载体的构建
RT-PCR 得到的 WAK1 cDNA 片段为 1.14 kb
(图 1)。双酶切后连入pET28a 载体。经双向测序
鉴定，构建的载体 pET28a WAK1 的阅读框正确。
WAK1 序列与 GenBank 上 WAK1 mRNA 序列同源
性达99.5% (数据未列出)。　　　
2 融合蛋白的诱导表达与纯化
将 pET2 8 a W A K 1 重组质粒转至大肠杆菌
BL21 (DE3)中，经 IPTG 诱导后收获菌体，破细
菌得到包涵体。对包涵体样品进行 SDS-PAGE，
结果如图2所示。与转化有空载体pET28a的大肠
杆菌 BL21 相比，含有重组质粒 pET28a WAK1 的
图1 通过 RT-PCR 获得的 WAK1 cDNA 部分片段
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大肠杆菌BL21 (DE3)经诱导后产生大量43 kD融
合表达产物，大小与预期的分子量相符。
3 抗体的特异性分析
从凝胶上切割与预期分子量相符的诱导表达
蛋白带，免疫兔子，得到多克隆抗血清，抗血
清效价为 1∶16。Western 印迹在原核表达体系
中的检测结果显示：以诱导空载pET28a质粒表达
产物作为对照的泳道未见条带(图3)，而含有诱导
重组质粒表达产物的泳道可见特异条带，表明该
抗体在原核体系中具有较高的特异性。
融合蛋白，但没有发表详细的抗体制备过程。
p G E X 表达系统是一种融合有谷胱甘肽转移酶
(GST)标签的原核表达系统，融合蛋白中的 GST
部分需通过蛋白酶切除，经诱导表达的融合蛋白
需用亲和层析法纯化，步骤较为复杂，费用较
高。本文详细报道了用 pET 表达系统，异源表达
WAK 1。在这一系统中，重组蛋白主要以包涵体
形式存在，经多次洗涤后重组蛋白占包涵体的
80%，甚至 90% 以上。在抗体制备过程中用制备
SDS-PAGE 来纯化重组 WAK1 蛋白，避免了包涵
体的变性和复性过程，得到纯度很高的重组蛋
白，直接切割凝胶作为抗原，1 次电泳得到大量
的蛋白即可满足免疫兔子的需要。此法可靠、简
便又经济。
本文成功地制备了特异性较高的 WAK1 多克
隆抗体，可用于Western 印迹分析和免疫细胞化
学研究，为今后WAK1 的表达和分布检测以及与其
它蛋白质相互作用等研究工作的开展奠定了基础。
参考文献
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图2 融合蛋白的原核表达与纯化
a：标准蛋白；b：转化有重组质粒 pET28 a WAK 1 的大
肠杆菌 BL21 (DE3)未经 IPTG 诱导表达的包涵体；c：转化有
重组质粒 pET28a WAK1 的大肠杆菌 BL21 (DE3)经 IPTG 诱导
3 h 后表达的包涵体；d：转化有重组质粒 pET28a WAK1 的
大肠杆菌 BL21 (DE3)经 IPTG 诱导 6 h 后表达的包涵体；e：
转化有空载质粒 pET28a 的大肠杆菌 BL21 (DE3)未经 IPTG 诱
导表达的包涵体；f：转化有空载质粒 p E T 2 8 a 的大肠杆菌
BL21(DE3)经 IPTG 诱导 6 h 后表达的包涵体。
图3 Western印迹法检测抗WAK1抗体在
原核表达体系中的特异性
a：转化有空载质粒 pET28a 的大肠杆菌 BL21 (DE3)经
IPTG 诱导后的表达结果；b：转化有重组质粒 pET28a WAK1
的大肠杆菌 BL21 (DE3)经 IPTG 诱导后表达结果。
讨 论
在过去20年中，采用各种载体系统在大肠杆
菌中已经表达了数百种重组蛋白，尤其是用表达
的重组蛋白免疫动物来制备抗体已成为一种行之有
效的方法。本文用的是膜蛋白，含量少，且不
易纯化，因此采用大肠杆菌表达 WAK1 重组蛋白
来制备抗体是一条切实可行的方案。
He 等[3]报道了用 pGEX 表达系统来表达 WAK