全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 701
拟南芥中一种AtBAG4蛋白的抗体制备和特异性检测
刘红，邓丽，刘贵明，李文双，杨万年 *
华中师范大学生命科学学院，武汉 430079
提要：以拟南芥 AtBAG4的全长 cDNA，构建 pET-51780重组质粒，转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，IPTG可诱导融合蛋白
高效表达，表达产物以可溶形式存在；经Ni-NTA层析柱分离纯化，可得到分子质量约为 49 kDa的PAGE纯蛋白。用纯
化的融合蛋白 pET-51780免疫家兔，可得到抗 AtBAG4抗体。Western blot结果显示该抗体能特异识别原核系统内表达
的抗原以及拟南芥自身的抗原。
关键词：拟南芥；AtBAG4基因；原核表达；多克隆抗体
Preparation and Identification of Antibody against the AtBAG4 Protein of
Arabidopsis thaliana
LIU Hong, DENG Li, LIU Gui-Ming, LI Wen- Shuang, YANG Wan- Nian*
College of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, China
Abstract: The full length cDNA sequence of Arabidopsis thaliana AtBAG4 gene was cloned into prokaryotic
expression plasmid pET32a(+) and then transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). A recombinant protein
was expressed effectively in the form of soluble inclusion bodies after IPTG induction. The recombinant
protein about 49 kDa was purifield by Ni-NTA affinity chromatography. Polyclonal antibody was prepared by
immuning rabbit. It is appeared that the antibody had high affinity with the antigen expressed in prokaryotic and
protein extracted from Arabidopsis thalina by Western-blot.
Key words: Arabidopsis thalina; AtBAG4 gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody
收稿 2007-04-05 修定 　2007-05-23
资助 国家自然科学基金(30 5 70 1 5 6)。
* 通讯作者(E-mail：yangwnwn@163.com；Tel：02 7-
6 7 8 6 3 0 9 8 )。
BAG结构域是人和动物BAG (Bcl-2介导的抗
细胞凋亡)蛋白家族成员的标志性结构域。动物和
人的BAG蛋白是HSC70/HSP70等分子伴侣活性的
调节者，通过其 BAG结构域与HSP70/HSC70的
ATP酶的结构域发生作用而促进后者的底物释放
(Takayama和 Reed 2001)。BAG蛋白在逆境胁迫
反应中能够抑制热激等诱导的细胞凋亡，在正常
条件下也具有抗凋亡活性。目前已在鼠(mouse)、
果蝇(fruit fly)、蚕(Bombyx mori)、啤酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)、非洲裂殖酿酒酵母
(Schizosaccharomyces pombe)、拟南芥(Arabidopsis
thaliana)以及水稻(rice)、棉花(cotton)、马铃薯
(potato)、番茄(tomato)和大豆(soybean)这些具有
经济价值的作物等动植物中发现。BAG结构域由
110~124个氨基酸残基组成，形成3个反向平行的
α螺旋，每个螺旋的长度大约为 30~40个残基。
第 1和第 2个螺旋能与 Raf-1上的丝氨酸 /苏氨酸
激酶作用，而第 2和第 3个螺旋是 BAG结构域与
Hsc70/Hsp70上的ATPase结构域发生作用的位点
(Doong等 2002)。Yan 等(2003) 的分析结果显示
拟南芥中有 8个基因含有编码BAG结构域的保守
序列。拟南芥中的BAG蛋白类家族可以根据含有
其他保守序列的情况分为3类。第1类包括AtBAG-
1、AtBAG-2、AtBAG-3和AtBAG-4，它们都带
有泛素类的结构域；这 4种蛋白在结构上与人类
的BAG-1相似，可能是BAG-1在植物中的直向同
源物。第 2类只有 1个成员，就是只含有 BAG结
构域而无其他保守基序的AtBAG-5。第 3类包括
AtBAG-6、AtBAG-7、AtBAG-8，这些蛋白都含
有钙调素结合结构域，可能受 Ca2+的调控。拟南
芥的 At3g51780基因位于第 3条染色体上，编码
AtBAG4，属于拟南芥 BAG蛋白家族的第 1类成
员，与哺乳动物中细胞凋亡的调节者同源。
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Doukhanina 等(2006)的研究表明，AtBAG4上的
BD结构域与人类BAG蛋白的BD结构域具有很高
的同源性。虽然拟南芥中BAG结构域结构的研究
已有报道，但尚未完全阐明含BAG结构域蛋白在
植物发育和适应环境过程中的作用和机制。本文
对一种含BAG结构域的拟南芥AtBAG4蛋白进行
原核表达、纯化、多克隆抗体制备并对其特异性
作了一些检测。
材料与方法
大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、BL21
(DE3)和质粒 pET32a(+)由我们实验室保存，含有
AtBAG4基因的完全编码序列 cDNA的重组质粒
BD-51780由我们实验室构建。 限制性内切酶 SalI
和 EcoRI购自 Takara 公司，T4 DNA 连接酶购自
Takara 公司，辣根过氧化物酶(HRP) 标记的羊抗兔
IgG购自北京天根生物公司。实验动物——新西兰
家兔由中科院武汉病毒所动物实验中心提供。
BD-51780质粒经过 SalI和EcoRI双酶切，产
物经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，与经过同样酶
切的 p E T 3 2 a ( + )载体连接，构建重组质粒
pET51780。连接产物转化到 E. coli DH5α，双
酶切法筛选阳性重组质粒，最后由上海基康生物
公司测序。
重组质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，于37℃
下过夜培养。次日，以 1:100的体积比接种至 10
mL含氨苄青霉素(终浓度为 60 µg·mL-1)的新鲜 LB
液体培养基中，37 ℃振荡培养至 OD600 为 0.5~
0.6，取出 1 mL培养物收集菌体备用。其余培养
物加 IPTG 至终浓度为 0.1 mmol·L-1，继续在 37
℃下诱导表达 4 h，每隔 1 h收集 1 mL菌体，待
收集完成后进行 SDS-PAGE检测融合蛋白表达情
况。
分离纯化融合蛋白时，收集大量诱导后菌
体，用结合缓冲液(50 mmol·L- 1 NaH2PO4，0.5
mol·L-1 NaCl，pH 8.0)重悬，冰上预冷，超声(功
率 300 W) 10 s，间歇 10 s破碎细胞。于 4 ℃ 18 500
×g离心 10 min，取上清液以备用，沉淀再用结
合缓冲液重悬。取上清液和重悬液进行 S D S -
PAGE，鉴定融合蛋白的溶解性。
收集裂解液，在天然条件下按照 Introvagen
manual上的操作方法用Ni-NTA亲和层析柱纯化融
合蛋白，SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果。
动物免疫和制备抗血清时，取纯化后获得的
融合蛋白(约 300 µg)，与等体积的弗氏佐剂混匀
后,按照常规程序免疫日本大耳白兔(Oryctolagus
cuniculus)，共免疫 4次。心脏取血，4 ℃下静
置过夜，后以低速离心分离出血清，于 −80℃中
保存。
提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株全蛋白
时，取拟南芥完整植株于液氮中迅速研磨成粉
末，加入提取液(0.15 mol·L-1 Tris，pH 8.0，25%
甘油，0.02 g·mL-1聚乙烯吡咯烷酮)在冰上静置 3
h，4 ℃下以 15 728×g离心 20 min，上清液即为
全蛋白。
Western印迹分析时，将纯化后获得的融合
蛋白或者提取的拟南芥全蛋白溶于等体积的上样缓
冲液中，煮沸 10 min后，进行 SDS-PAGE (分
离胶浓度 12%)。75 V恒压 2 h，将蛋白转移到
聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在封闭液(含 1% BSA的
1×Tris/Saline) 4 ℃封闭过夜，用 1×Tris/Saline洗
膜 4次，每次 10 min。以 1:1 000的体积比加入
一抗(pET51780兔抗血清抗体)，室温孵育 1 h，
用 1×Tris/Saline洗膜 4次，每次 10 min。加入以
1:10 000的体积比稀释的二抗(HRP标记的羊抗兔
IgG)，室温下孵育 30 min，用含有 1×Tris/Saline
洗膜 4次，每次 10 min，将膜放入显色液(0.06%
4-氯 -1-萘酚，0.012% H2O2)进行显色反应，直
至出现清晰带为止，用水冲洗终止反应。
实验结果
1 原核表达载体的构建
BD-51780提取质粒，用 EcoRI和 BamHI双
酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得 800
bp左右的DNA片段，然后克隆到原核表达载体
pET32a(+)中(图 1中箭头所示)。双酶切鉴定重组
质粒得到约 800 bp的外源插入片段(图 2中箭头所
示)，与预期大小相符。经上海基康生物公司测
序鉴定，重组质粒的外源插入片段序列正确，重
组命名为 pET51780。
2 融合蛋白的诱导表达和纯化
重组质粒转入大肠杆菌 BL21 (DE3)中，经
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IPTG诱导表达后收获细胞进行 SDS-PAGE，与转
化有空载体 pET32a(+)的大肠杆菌 BL21 (DE3)相
比，含有重组质粒 pET51780的大肠杆菌 BL21
(DE3)经诱导后产生大量49 kDa左右的融合蛋白产
物，大小与预期的分子量相符。pET51780融合
蛋白以可溶的形式存在于裂解后的上清液中。将
裂解获得的上清液，在天然条件下进行Ni-NTA亲
和层析柱纯化融合蛋白，得到 PAGE纯的融合蛋
白(图 3中箭头所示)。
3 Western检测抗体的特异性
用经过纯化后的融合蛋白免疫兔子，得到多
克隆的抗血清。Western印迹在原核表达体系(图
4中箭头所示)和拟南芥蛋白中的检测(图 5中箭头
图 1 重组质粒 pET51780
Fig.1 Recombinant plasmid pET51780
A：D N A 分子量标准；B：载体 p E T 3 2 a ( + )；C：重组
质粒 p ET 5 1 7 8 0。
图 2 pET51780 的酶切鉴定
Fig.2 pET51780 tested by BamHI and EcoRI cut
A：D N A 分子量标准；B：载体 p E T 3 2 a ( + )；C：重组
质粒 p E T 5 1 7 8 0 用 B a m H I 和 E c o R I 双酶切；D：重组质粒
p ET 5 1 7 8 0 用 B a m H I 单酶切。
图 3 SDS-PAGE 亲和纯化获得的融合蛋白
Fig.3 SDS-PAGE of the recombine protein expressed in E.
coli after affinity purification
A：蛋白质标准；B：大肠杆菌诱导后的表达产物；C：
亲和层析纯化后的融合蛋白。
图 4 融合蛋白的Western印迹分析
Fig.4 Immunoblotting analysis of recombinant
protein expressed in E. coli
A：蛋白质标准；B：大肠杆菌中表达的融合蛋的Western
印迹分析。
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所示)的结果显示：原核诱导表达蛋白与拟南芥提
取蛋白都与多克隆抗体有特异性的结合。特异性
条带的位置与预测的结果一致：融合蛋白大小约
为 49 kDa处，拟南芥自身表达蛋白约为29 kDa处。
讨 论
本文中选用的AtBAG4蛋白属于拟南芥BAG
家族第 1类，在蛋白的中间含有 1个保守的 BAG
结构域，N端是 1个类泛素的结构域。AtBAG4在
植株的根、茎、叶、花中都有表达，与植物对
热、冷和高盐浓度的逆境耐受有关。鉴于蛋白自
身含量少，易降解，不易被分离纯化等特点，因
此本文中的拟南芥蛋白采用的是原核表达的重组蛋
白免疫动物来制备抗体。
王义华等(2004)、李少琼等(2005)分别用 pET
系统表达了拟南芥MnSOD和细胞壁关联蛋白激酶
并成功地制备了多克隆抗体，但含BAG结构域的
蛋白尚未见报道。本文中，融合蛋白在宿主菌
BL21 (DE3)中加入 IPTG诱导后能够高效表达，且
表达蛋白以可溶性形式存在。这为以后在天然条
件下分离纯化，保持蛋白的活性建立了基础。本
文制得的抗体与原核表达的蛋白和拟南芥蛋白都有
特异性的结合，说明多克隆抗体是高效的。该抗
体的成功制备，为研究拟南芥的AtBAG4蛋白功
能提供了材料，也为研究AtBAG4的相互作用蛋
白提供了工具。
参考文献
李少琼, 徐朗莱, 陈伟华, 谢静红, 凌永贞, 杨志敏(2005). 拟南芥
细胞壁关联蛋白激酶融合表达及多克隆抗体的制备. 植物生
理学通讯, 41 (5): 652~654
王义华, 徐梅珍, 党云琨, 陈珈(2004). 拟南芥MnSOD的原核表
达、纯化及抗体制备. 生物技术通讯, 15 (2): 112~114
Doong H, Vrailas A, Kohn EC (2002). What’s in the ‘BAG’? —
a functional domain analysis of the BAG-family proteins.
Cancer Lett, 188: 25~32
Doukhanina EV, Chen SR, Zalm EVD, Godzik A, Reed J, Dickman
MB (2006). Identification and functional characterization
of the BAG protein family in Arabidopsis thaliana . J Biol
Chem, 281: 18793~18801
Takayama S, Reed JC (2001). Molecular chaperone targeting and
regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol, 3: 237~241
Yan JQ, He CX, Zhang H (2003). The BAG-family proteins in
Arabidopsis thaliana. Plant Sci, 165: 1~7
图 5 拟南芥蛋白的Western印迹分析
Fig.5 Immunoblotting analysis of protein
expressed in A. thaliana
A：蛋白质标准；B：拟南芥自身蛋白的W e s t e r n 印迹分析。