全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月638
野生茄子(Solanum torvum)抗黄萎病相关基因StoVe1的克隆与分析
史仁玖1,* 殷　1,* 王忠1 陈敏1 黄权生2 黄乐平2 杨清1,**
1 南京农业大学生命科学学院，南京 210095；2 新疆农业科学院核生物技术研究所，乌鲁木齐 830000
提要 采用 RT-PCR 和 RACE 技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因，命名为 StoVe1，其 cDNA 全长 3 400
bp，含有 3 153 bp 的完整开放阅读框，编码 1 051 个氨基酸，该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄 Ve1 编
码的氨基酸序列同源性分别为 82%、81% 和 80%，且有很高的功能区段保守性。将该 cDNA 全长序列提交 GenBank，登
陆号为 DQ020574。半定量 PCR 表明该基因为组成型表达，在根中表达最多，叶中最少。
关键词 野生茄子；StoVe1 基因；克隆；表达
Cloning and Analysis of Full-length cDNA of StoVe1 Gene from Solanum torvum
SHI Ren-Jiu1,*, YIN Yue1,*, WANG Zhong1, CHEN Min1, HUANG Quan-Sheng2, HUANG Le-Ping2, YANG Qing1,**
1College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2Institute of Nuclear Biotechnology, Xinjiang
Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830000, China
Abstract The full-length cDNA of a gene associated with verticillium wilt disease resistance, named StoVe1,
was amplified and cloned from Japanese Solanum torvum by RT-PCR and RACE. The cDNA contained 3 400
bp with an open reading frame (ORF) of 3 153 bp and encoded 1 053 amino acid residues. The deduced amino
acid sequence showed 82% homology to SaVe1 from Solanum aethiopicum, 81% homology to SlVe1 from
Solanum lycopersicoides and 80% homology to Ve1 from Lycopersicon peruvianum and also highly conserved
domains of function. This gene has been registered in GenBank with accession number DQ020574. Semi-
quantitive RT-PCR analysis indicated that StoVe1 expression was different in roots, stems and leaves, and richer
in roots, poor in leaves.
Key words Solanum torvum; StoVe1 gene; cloning; expression
收稿 2006-01-26 修定 　2006-05-25
资助 新疆农业科学院核生物技术研究所自治区重点实验室基金。
*同为第一作者。
** 通讯作者(E-mail: qyang19@njau.edu.cn, Tel: 025-
84395221)。
黄萎病(verticillium wilt)是一种由大丽轮枝菌
(Verticillium dahliae)和黑白轮枝菌(Verticillium
albo-atrum)引起的植物维管束病害，在世界各地
引起许多重要经济作物如陆地棉( G o s s y p i u m
hirsutum)、茄子(Solanum melongena)、番茄
(Lycopersicon esculentum)、马铃薯(Solanum
tuherosum)、甘蓝(Brassica oleracea)、油菜
(Brassica napus)、白菜(Brassica chinensis)、辣
椒(Capsicum frutescens)等黄萎病(张启刚等1998)，
严重影响了这些作物的产量与产品品质，全球每
年因黄萎病危害所造成的经济损失高达10亿多美
元，克隆抗黄萎病基因并将之应用于育种可能是
解决上述问题的有效途径。
目前，有关茄科植物抗黄萎病基因克隆的报
道很少。在番茄中，Kawchuk 等(1998, 1994,
2001)分离到抗黄萎病基因家族的 2 个成员基因
Ve1和Ve2，将之转化马铃薯后成功提高了其抗黑
白轮枝菌的能力。本文所用野生茄子(Solanum
torvum)来自日本，对黄萎病具有极强的抗性。试
验根据番茄Ve1、刚果野茄(Solanum aethiopicum)
SaVe1 的 cDNA 全长序列比对结果设计引物，通
过RT-PCR及 5、3-RACE扩增得到了野生茄子抗
黄萎病基因的 cDNA 序列，并对该基因进行了组
织表达分析。
材料与方法
野生茄子(Solanum torvum)由我校园艺学院朱
月林先生提供。植株栽种于温室中，于旺盛生长
期取幼嫩侧枝茎段用作离体培养，以再生组培苗
为试验材料。
总 R N A 的提取按照北京天为时代公司
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T R IZ O L 试剂的说明书，稍加改进。cDNA 第一
链的合成按照Takara RNA PCR Kit (AMV)使用说
明书进行。
根据番茄 Ve1、刚果野茄 SaVe1 的 cDNA 全
长的多重比对结果，分别设计一对扩增StoVe1 5
c D N A 末端的引物( P 1 ：5 - G T T C C T T C G -
A A C T G C A T A A C T G A G - 3 ；P2：5- T G C A T T -
GCGTAACTCGTCGACTTG-3)和一对扩增 StoVe1
中间编码区的引物(P3：5-CC TT TC AC GT AA -
T G G T C T A A C T G G - 3 ；P 4：5 - G T T C C C A A -
GATTCAGCACTCCAAG-3)。根据 StoVe1 中间编
码区测序结果，设计2条 StoVe1 3 cDNA末端扩
增正向引物( P 5：5 - G T C T G T G G A G C A G C C -
T T A C A - 3 ；P 6：5 - A G C A A T T C C A T G C C A -
CCAGA-3); 反向引物采用Takara RNA PCR Kit
(AMV)提供的 M4 (5-GTTTTCCCAGTCACGAC-
3)。以反转录产物为模板进行 PCR 扩增。反应
体积为50 µL，10× 缓冲液，5 µL；10 mmol·L-1
dNTP，1 µL；P1，2 µL；P2，2 µL；cDNA
第一链模板，1 µL；Tag酶(2 U·µL-1)，0.626 µL；
双蒸水，38.4 µL。反应条件为：94℃预变性 4
min，94℃变性 30 s，54℃ 30 s，72℃延伸 1.5
min，35 个循环，然后 72℃延伸 10 min。PCR
产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检查后，切下目的条
带，用 P C R 产物纯化试剂盒回收 DN A。与 p M D
18-T Vector连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)
D H 5 a，测序由上海博亚生物技术有限公司完
成。
根据上面测序得到的StoVe1 cDNA 5序列、
中间编码区序列和3序列拼接，得到StoVe1 cDNA
全长序列。据此，设计一对扩增StoVe1 cDNA 全
长的引物( P 7 ：5 - A T G A A A A T G A T G G C -
A A C T C T G T A G - 3 ；P 8：5 - C T C A T C A T T -
ATGCGTTTAAGGATC-3)。反应体积、反应条
件、P C R 产物回收、连接、转化和测序同上。
将 D N A 序列及其对应的氨基酸序列与
G e n B a n k 中已有的相应序列进行比较，用
D N A M A N 软件对结果进行分析。
分析StoVe1在各组织中表达时，分别取野生
茄子组培苗的根、茎、叶提取总 R N A ，用中间
编码区引物 P3 和 P4 进行 RT-PCR，分析 StoVe1
在各组织中的表达差异。PCR 扩增条件同上，循
环数改为 26。内参采用组成型表达的 GAPDH 基
因，引物分别为 G A P D H 1 ( 5 - C A A G G A C T -
GGAGAGGTGG-3)，GAPDH2 (5-TTCACT-
CGTTGTCGTACC-3)，循环数为 26。取全部 PCR
产物点样，凝胶电泳，拍照。
实验结果
1 总 RNA 的提取
采用 1 % 琼脂糖凝胶电泳检测 R N A 的完整
性。从图l可以清晰地看到28S 和 l8S rRNA 的 2
条主带，28S/l8S 的亮度比大于 2，最前面的 5S
rRNA 隐约可见。这表明总 RNA 纯度较高，完整
性符合试验要求。
2 StoVe1 cDNA的扩增
以野生茄子叶片总 RNA 反转录获得的 cDNA
为模板，进行StoVe1 的 5、中间和3 片段的引
物扩增。P1 和 P2 扩增得到一条约1 400 bp 的条
带(图2-a)，测序后准确长度为1 405 bp。核酸序
列比对(BLASTN)表明它与Ve1 和 SaVe1 的相关区
段有 87% 和 89% 的一致性。引物 P3 和 P4 扩增得
到一条约1 000 bp的条带(图2-b)，测序后准确长
度为 958 bp。核酸序列比对(BLASTN)表明它与
Ve1 和 SaVe1 的相关区段有89% 和 91% 的一致性。
该片段与5末端1 405 bp的片段有195 bp的重叠
区，表明来自同一基因。
正向引物P5和 P6，与 Takara RNA PCR Kit
(AMV)提供的反向引物 M4 进行槽式 PCR。用 P5
与 M4 进行第一轮 PCR，以第一轮 PCR 产物为模
板，用P6与 M4进行第二轮PCR扩增，得到1 500
bp左右的特异条带(图2-c)，测序结果与前面扩增
图1 总 RNA的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月640
的958 bp 片段之间有212 bp 的重叠区，表明该
序列是StoVe1 的 cDNA 3 末端。
将测序得到的StoVe1 cDNA 5末端、中间958
bp的编码区和3末端序列拼接，得到3 400 bp的
StoVe1 cDNA 全长序列。据此设计了一对扩增基
因 OR F 序列的引物 P7 和 P8。PC R 扩增到了约
3.2 kb大小的条带(图2-d)。
3 StoVe1的核酸序列分析
拼接后 StoVe1 基因 cDNA 序列如图 3。该
cDNA 包含一个长 3 153 bp 的可阅读框，编码
1 051个氨基酸，起始于序列48 bp，终止于3 200
bp，5 端非编码区的长度为47 bp，3 端非编码
区的长度为200 bp，在 poly (A)上游 77 bp处有
典型的真核生物基因poly (A)的信号序列AATAAA。
BLASTN 分析结果表明，该序列与刚果野茄 Ve1
cDNA 序列的一致性为 93%，氨基酸序列的同源
性为82%；与类番茄(Solanum lycopersicoides) Ve1
cDNA 序列的一致性为 88%，氨基酸序列的同源
性为 81%；与番茄基因 Ve1 cDNA 序列的一致性
为90%，氨基酸序列的同源性为 80% (表 1)，推
测其为Ve1基因家族新成员，命名为StoVe1。该
cDNA 序列已提交 GenBank，登陆号 DQ020574。
4 StoVe1的蛋白质序列分析
StoVe1编码一条长1 051个氨基酸残基的多
肽，理论分子量为117 kDa，等电点为5.74。用
Smart分析 StoVe1蛋白，结果显示在蛋白分子的
1~23位存在一个23个氨基酸残基的疏水信号肽；
在蛋白分子的第105~967位存在23个富含亮氨酸
重复序列(leucine-rich repeat, LRR)，LRR跨越了
整个蛋白分子的主体部分，它有助于受体蛋白与
来自胞外的配体的识别和结合。
用ScanProsite分析StoVe1蛋白时发现，蛋
白分子的第7~28位存在一个亮氨酸拉链(leucine
zipper, LZ)，基本上位于N端信号肽的内部；蛋
白分子的第98~986位存在 28个潜在的N-糖基化
位点；在整个蛋白分子内部有29 个磷酸化位点；
在蛋白分子的第1 042~1 046位存在一个由受体蛋
白介导的内吞作用信号(endocytosis signal)。用
TMPRED 对 StoVe1 蛋白进行疏水性分析，发现 7
个可能的跨膜结构域。可以推断，StoVe1基因与
番茄 Ve1 基因一样，编码一个具有受体介导的内
吞作用信号的细胞表面糖蛋白。
图2 StoVe1的RT-PCR扩增结果
Fig.2 RT-PCR products of StoVe1
　　1：StoVe1 5 RACE 扩增片段；2：StoVe1 中间 958 bp 片段；3：StoVe1 3 RACE 扩增片段；4：StoVe1 cDNA 序列；
M ：分子量标记。
表1 野生茄子抗黄萎病相关基因StoVe1序列与其他植物Ve相应序列的同源性比较
Table 1 Comparison of S. torvum StoVe1 sequence with the sequences of Ve from other plants
植物来源 核酸序列同源性/% 氨基酸序列同源性/% 基因登录号
刚果野茄 93 82 AY598746
类番茄 88 81 AY262016
番茄 90 80 AF365930
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 641
图3 StoVe1的cDNA序列及推导的氨基酸序列
Fig.3 Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of StoVe1 cDNA
下划线处为非编码区的终止密码子，* 处为终止密码子，加框处为加尾信号。
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月642
5 StoVe1在各组织中的表达分析
分别取野生茄子组培苗的根、茎、叶提取总
RNA，用中间 958 bp 编码区代表目的基因，采
用半定量RT-PCR 的方法分析了StoVe1 在各组织
中的表达差异(图 4)。结果显示在正常生长条件
下，StoVe1的表达量在根中最高，茎中次之，在
叶中表达量最低。这说明StoVe1具有组织表达特
异性，在病原菌未侵染的情况下在根和茎中也有
一定的基础表达水平，这与普遍认为的 Ve1 基因
是组成型表达基因的观点一致。黄萎病是从根部
侵染的维管束病害，可能是在根中表达量较高的
原因。
性，而且对马铃薯的黑白轮枝菌也有抗性
(Kawchuk 等 2001)。有报道指出，番茄 Mi 基因
有类似的多抗效应，Mi基因可对线虫和蚜虫产生
抗性(Vos等1998; Milligan等1998)。这种多抗性
对农作物的抗病育种可能有潜在的应用价值。
半定量 RT-PCR 分析表明，StoVe1 的基础表
达量在根中最高，茎中次之，叶中最少。黄萎
病是根部侵染的维管束病害，根中StoVe1起着与
抗病相关的自然监控作用，可能是其在根中表达
量高的原因。
植物黄萎病病菌的寄主很广，可以在不同物
种间侵染，引起黄萎病。这暗示抗黄萎病基因克
隆不仅可以应用于寄主所属物种的抗性改良，而
且还可用于转化其它植物增强其抗病性。日本野
生茄子对黄萎病有极强的抗性，因此进一步验证
StoVe1基因的功能和抗性分析，从而为茄子及其
它茄科作物抗黄萎病育种提供有价值的抗性资源无
疑是重要的。
参考文献
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图4 StoVe1在野生茄子茎、根和叶中的表达分析
Fig.4 Expression analysis of StoVe1 in the stem,
root, and leaf of S. torvum
G A P D H 为上样量对照。
讨　　论
本文通过RT-PCR 和 RACE 技术从野生茄子中
克隆到StoVe1基因。该基因编码的蛋白序列与刚
果野茄、类番茄和番茄 Ve1 编码的氨基酸序列同
源性分别为 8 2 %、8 1 % 和 8 0 %。在该基因 N 端
存在一个疏水的信号肽，信号肽的内部还发现一
个亮氨酸拉链。蛋白主体部分存在23个完整或不
完整的 LRR 序列，在 LRR 序列内部存在 28 个潜
在的N-糖基化位点。在C末端存在一个明显的跨
膜结构域和一个由受体蛋白介导的内吞作用信号。
这些特征与番茄 Ve1 所编码蛋白极其相似，据此
可以推测StoVe1与番茄Ve1一样，是编码一个具
有受体介导的内吞作用信号的细胞表面糖蛋白
(Kawchuk 等 2001)。
Ve基因中的内吞受体可以有选择地结合配基
并传递该信号到细胞内，激活细胞对致病因子的
抗性(Remy等 1999)。与有非常专一抗性传统的R
基因不同，V e 编码的抗性蛋白能抗多种黄萎病
菌。番茄 Ve1 不仅对大丽轮枝菌 1 和 2 病菌有抗