全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月 271
ISSR引物鉴定芍药栽培品种之间亲缘关系的初步研究
于恒秀 王淼 梁国华 何小弟* 龚志云 孙维娟
扬州大学植物功能基因组学教育部重点实验室，江苏扬州225009
Pereliminary Identification of Relationship among Cultivars of Paeonia lactiflora
Pall by ISSR Analysis
YU Hen-Xiu, WANG Miao, LIANG Guo-Hua, HE Xiao-Di*, GONG Zhi-Yun, SUN Wei-Juan
Key Laboratory of Plant Function Genomics, Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009, China
提要 以芍药栽培品种‘莲台’、‘妒花魁’、‘紫霞映雪’、‘粉玉奴’、‘紫金龙’、‘合欢娇’、‘蓝田碧玉’、‘鱼鳞红’、‘红
莲’等为试材，用 10 个来源于水稻的 ISSR 标记对其进行亲缘关系鉴定的初步结果表明：‘蓝田碧玉’与其余 7 个品种之
间的亲缘关系较远。5 个引物扩增出的 DNA 片段在 250~1 000 bp 之间，扩增 DNA 谱带总数为 21，引物 ISSR7 和 ISSR8
扩增出的条带数最多。
关键词 芍药(Paeonia lactiflora Pall); ISSR; 亲缘关系
收稿 2005-08-03 修定 2005-12-31
资助 江苏省农业攻关项目(BE2003338)和江苏省农业高技术
项目(BG2004309)。
*通讯作者(E-mail: rain8068@sina.com, Tel: 0514-7979395)。
观赏芍药(Paeonia lactiflora Pall)的分类，目
前主要集中在花型、花期、花色等外部形态的研
究方面。但由于受自然环境因素、土壤理化性能
和栽培管理措施的影响，芍药花器在栽培中往往
会出现不规则的形态变异，甚至出现同一植株两
种花型的现象；即使是同一品种，花色也可能随
着开花时期而变化。这给芍药栽培品种的准确界
定和区分，带来较大的困惑和不便。
ISSR (inter-simple sequence repeat)是一种简单
序列重复区间扩增多态性分子标记技术，由
Zietkiewicz等在1994创建。这项技术根据植物广
泛存在 SSR 的生物学基础，采用在植物基因组中
常出现的 SSR 本身设计引物，无需预先克隆和测
序。用于 ISSR-PCR 扩增的引物通常为 16~18 个
碱基序列，由 1~4 个碱基组成的串联重复和几个
非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因
组 DNA 中 SSR 的 5或 3末端结合，导致位于反
向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段
进行PCR 扩增。ISSR标记等分子遗传学的相关分
类研究技术，因其快速、简便、可靠、多态性
高，在园艺作物的品种鉴定、注册中已成功地得
到应用。如唐荣华等(2002)用ISSR指纹图谱鉴定
了柑桔属不同品种，通过 22 个引物产生的 ISSR
分析可用于区分68个柑桔品种，确定了各个基因
型之间的遗传变异和亲缘关系。但在花卉中的研
究应用尚不多见，特别是用于芍药遗传特性的研
究几为空白。
本文采用ISSR引物标记，初步分析了8个芍
药栽培品种间的亲缘关系，可为进一步的种质分
类研究作些前期探索。
材料与方法
供试材料为芍药(Paeonia lactiflora Pall)的8个
栽培品种，均来自本校芍药种质资源圃。
‘莲台’为中晚品种，托桂型。花复色，
外瓣 2 轮白色有紫红沙痕，内瓣由雄蕊完全瓣化
的黄色至橘黄色簪状瓣整齐排列，形似莲台。
‘妒花魁’为晚花品种，蔷薇型。花粉色，雄
蕊瓣化的花瓣大，排列整齐；雌蕊瓣化成小而碎
的花瓣。‘紫霞映雪’为早花品种，台阁型。
花紫色，端发白；下方花雌雄蕊瓣化，上方花
正常。‘粉玉奴’为早花品种，单瓣型。花初
开时粉色，盛开后变成淡肉粉色，有花椒般的香
气。‘紫金龙’为早花品种，菊花型。花紫红
色，上方花大部分雄蕊未瓣化，花丝变粗；雌
蕊瓣化为卷曲状花瓣。‘蓝田碧玉’为中晚品
种，台阁型。花红色，微蓝，雄蕊完全瓣化。
‘鱼鳞红’为中花品种，皇冠型。花紫色，微
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红。‘红莲’为早花品种，单瓣型。花紫红色。
本文用的 10 个水稻 ISSR 引物中，包括 4 个
(GA)n 重复单元的引物、1 个(AG)n 重复单元的引
物、2 个(CT)n 重复单元的引物、2 个(AC)n 重复
单元的引物、1个(GATA)n重复单元的引物(表1)。
25 mL的PCR反应体系包括2.5 mL 100 mmol·L-1
Tris-HCl (pH 8.3, 500 mmol·L-1 KCl)、2.5 mL 25
mmol·L-1 MgCl2、1个单位大连宝生物(TaKaRa)公
司产的 Taq 酶、4 nmol dNTP、10 pmol 引物，
表1 ISSR标记的引物序列
标记 正义引物序列 反义引物序列
ISSR2 5-(GA)8T-3 与正义引物相同
ISSR3 5-(GA)8C-3 与正义引物相同
ISSR4 5-(CT)8A-3 与正义引物相同
ISSR6 5-(AG)8YC-3 (Y= C/G/T/A) 与正义引物相同
ISSR7 5-(GATA)4-3 与正义引物相同
ISSR8 5-BDB(CA)6 -3 (B=C/G/T, D=A/G/T) 与正义引物相同
ISSR11 5-GC(AC)4-3 与正义引物相同
ISSR12 5-CSC(GA)6-3 (S=G/C) 与正义引物相同
ISSR13 5-GCG(AC)6A-3 与正义引物相同
ISSR15 5-CCCGGATCC(CT)9-3 与正义引物相同
20 ng模板 DNA。在 Biometra PCR仪上先 94℃预
变性5 min；然后，94℃变性 1 min，50℃退火
1 min，72℃延伸 2 min，计 35 次循环；最后，
72℃延伸 5 min。
PCR 产物在 3% 的琼脂糖凝胶上 120 V 电泳
1.5 h后，在 BIORAD凝胶成像仪下进行观察、拍
照。依据扩增产物有或无的关系，比较分析 8 个
材料之间带型的异同，作出判断。
结果与讨论
1 PCR产物
图 1~3 表明，仅 ISSR2、ISSR3、ISSR6、
ISSR7、ISSR8 能对芍药扩增。其中，ISSR7 只
对‘紫霞映雪’有扩增效果，I S S R 6 对除‘粉
玉奴’外的材料都能扩增，ISSR3 能扩增除‘蓝
田碧玉’之外的其它品种，ISSR2 和 ISSR8 均只
能扩增 4 个品种。
2 ISSR 引物扩增结果
5个引物扩增的DNA 片段在 250~1 000 bp 之
间(图 1、2 )，扩增 DNA 谱带总数为 21，引物
图1 ISSR2、ISSR3、ISSR4、ISSR6 对 8 个芍药品种扩增的结果
M: marker ( 100 b p); 1:‘莲台’；2:‘妒花魁’；3:‘紫霞映雪’；4:‘粉玉奴’；5:‘紫金龙’；6:‘蓝田碧玉’；7:‘鱼鳞
红’；8 : ‘红莲’。
图2 ISSR7、ISSR8、ISSR9、ISSR11 对 8个芍药品种扩增的结果
1 :‘莲台’；2 :‘妒花魁’；3 :‘紫霞映雪’；4 :‘粉玉奴’；5 :‘紫金龙’；6 :‘蓝田碧玉’；7 :‘鱼鳞红’；8 :‘红莲’。
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ISSR7 和 ISSR8 扩出的条带数最多。‘妒花魁’
与‘粉玉奴’有 3 个带型一样；‘妒花魁’与
‘紫霞映雪’、‘紫霞映雪’与‘粉玉奴’、
‘紫金龙’与‘鱼鳞红’，分别有 2 个带型相
同；‘莲台’与‘紫金龙’、‘莲台’与‘鱼
鳞红’、‘莲台’与‘红莲’、‘妒花魁’和
‘鱼鳞红’，均有 1 个带型一样(表 3 ) 。
3 亲缘关系分析
从表 5 可以看出：与‘莲台’亲缘关系最
近的是‘妒花魁’，亲缘关系最远的是‘蓝田
碧玉’；与‘妒花魁’亲缘关系最近的是‘粉
玉奴’，亲缘关系最远的是‘蓝田碧玉’；与
表2 8个芍药品种与ISSR引物产生的扩增带
品种 ISSR2 ISSR3 ISSR6 ISSR7 ISSR8
‘ 莲 台 ’ 2 1,2,3 3,4 1,2,5,6
‘妒 花 魁 ’ 1,2 1,3 1,2,3,4,5 1,2,3,4,5,6
‘紫霞映雪’1,2 1,3 3,5 1,2,3,4,5
‘粉 玉 奴 ’ 1,2 1,3 1,2,3,4,5,6
‘紫 金 龙 ’ 1,2,3 3,4,5 3,4,5,6
‘蓝田碧玉’ 2,3
‘鱼 鳞 红 ’ 1,2,3 3,4,5
‘ 红 莲 ’ 1,2 3,4
参照图 1、图 2；表中数字为扩增带号，离点样孔最远的
带在此表中标为 1 ，次远的为 2 ，以此类推。
图3 ISSR12、ISSR13、ISSR15对 8个芍药品种扩增的结果
1 :‘莲台’；2 :‘妒花魁’；3 :‘紫霞映雪’；4 :‘粉玉奴’；5 :‘紫金龙’；6 :‘蓝田碧玉’；7 :‘鱼鳞红’；8 :‘红莲’。
表3 8个芍药品种相同带型数
‘妒花魁’ ‘紫霞映雪’ ‘粉玉奴’ ‘紫金龙’ ‘蓝田碧玉’ ‘鱼鳞红’ ‘红莲’
‘ 莲 台 ’ 0 0 0 1 0 1 1
‘ 妒 花 魁 ’ 2 3 0 0 1 0
‘紫霞映雪’ 2 0 0 0 0
‘ 粉 玉 奴 ’ 0 0 2 0
‘ 紫 金 龙 ’ 0 0 0
‘蓝田碧玉’ 0 0
‘ 鱼 鳞 红 ’ 0
表4 8个芍药品种中两两品种相同带数和两两品种间扩增出的总带数
‘妒花魁’ ‘紫霞映雪’ ‘粉玉奴’ ‘紫金龙’ ‘蓝田碧玉’ ‘鱼鳞红’ ‘ 红 莲 ’
‘ 莲 台 ’ 9 (16) 4 (17) 7 (13) 7 (14) 1 (11) 5 (11) 4 (10)
‘ 妒 花 魁 ’ 6 (20) 10 (15) 9 (16) 2 (15) 5 (16) 3 (16)
‘紫霞映雪’ 4 (17) 4 (17) 1 (12) 4 (13) 2 (13)
‘ 粉 玉 奴 ’ 6 (14) 0 (12) 2 (14) 1 (13)
‘ 紫 金 龙 ’ 1 (11) 6 (10) 4 (10)
‘蓝田碧玉’ 1 (7) 1 (5)
‘ 鱼 鳞 红 ’ 4 (6)
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‘紫霞映雪’亲缘关系最近的是‘妒花魁’，亲
缘关系最远的是‘蓝田碧玉’；与 ‘ 粉玉奴’亲
缘关系最近的是‘妒花魁’，亲缘关系最远的是
‘蓝田碧玉’；与‘紫金龙’亲缘关系最近的
是‘鱼鳞红’，亲缘关系最远的是‘蓝田碧
玉’；与‘红莲’亲缘关系最近的是‘鱼鳞
红’，亲缘关系最远的是‘粉玉奴’；与发‘鱼
鳞红’亲缘关系最近的是‘红莲’，亲缘关系
最远的是‘粉玉奴’和‘蓝田碧玉’；与‘蓝
田碧玉’亲缘关系最近的是‘红莲’，亲缘关
系最远的是‘粉玉奴’。从这些结果可以看出，
‘蓝田碧玉’与其他各品种的亲缘关系普遍较
远，其次为‘粉玉奴’。
根据以上结果可以得出如下结论：(1) 5个引
物扩增出的DNA片段在 250~1 000 bp之间，扩增
DNA 谱带总数为21；引物 ISSR7 和 ISSR8 扩出的
条带数最多。(2)亲缘指数(两两品种相同带数/两
两品种扩增出的总带数)分析表明，‘蓝田碧玉’
与其他各品种的亲缘关系普遍较远，其次为‘粉
表5 各品种之间的亲缘指数*
‘妒花魁’ ‘紫霞映雪’ ‘粉玉奴’ ‘紫金龙’ ‘蓝田碧玉’ ‘鱼鳞红’ ‘红莲’
‘ 莲 台 ’ 0.5625 0.2352 0.5385 0.5000 0.0910 0.4545 0.4000
‘ 妒 花 魁 ’ 0.3000 0.6667 0.5625 0.1333 0.3125 0.1875
‘紫霞映雪’ 0.2353 0.2353 0.0833 0.3077 0.1538
‘ 粉 玉 奴 ’ 0.4286 0 0.1429 0.0769
‘ 紫 金 龙 ’ 0.0909 0.6000 0.4000
‘蓝田碧玉’ 0.1429 0.2000
‘ 鱼 鳞 红 ’ 0.6667
* 亲缘指数 = 两两品种相同带数/ 两两品种扩增出的总带数。
玉奴’。(3)影响扩增反应结果清晰、准确的主要
因素有 Taq 酶、引物浓度及其退火温度、Mg2+ 浓
度、模板浓度等。其反应体系仍需不断优化，以
得出更清晰的条带。在扩增效果较差或扩增产物
差异不明显的情况下，可以组合使用上述引物，
扩增出更多的带型指纹，从而提高供试材料间的
差异检测能力。深入一步的相关实验正在进行之
中。
参考文献
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