全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 931
芜菁的类黄酮 3羟化酶基因克隆和UV-A诱导表达特性
许志茹 *, 崔国新, 李春雷, 孙燕, 李玉花
东北林业大学生命科学学院, 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 用UV-A处理 ‘津田 ’芜菁和 ‘赤丸 ’芜菁块根 24 h后提取总RNA，以RT-PCR方法分别克隆到 BrF3H1和 BrF3H2
基因。BrF3H1和 BrF3H2的开放读码框为 1 536 bp, 均编码 511个氨基酸。氨基酸序列分析显示, BrF3H1和 BrF3H2与
甘蓝型油菜 F3H的同源性达 99%, 在第 45~476的肽段含有细胞色素P450家族基因的结构域。BrF3H1和BrF3H2基因有
高度同源性, 核苷酸序列的17个位点处有差异, 推导的氨基酸序列在5个位点处有差异。Northern杂交结果显示, UV-A可
以诱导 BrF3H1表达, 基因的表达量与UV-A处理时间呈相关, UV-A不能诱导 BrF3H2基因表达。
关键词: 芜菁; 类黄酮3羟化酶基因; 基因克隆; 序列分析; 基因表达
Cloning and UV-A Induced Expression Trait of Flavonoid 3-Hydroxylase Gene
in Turnip (Brassica rapa L.)
XU Zhi-Ru*, CUI Guo-Xin, LI Chun-Lei, SUN Yan, LI Yu-Hua
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, College of Life Sciences, Northeast
Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: The roots of ‘Tsuda’ turnip (Brassica rapa) and ‘Yurugi Akamaru’ turnip were irradiated with UV-A
light for 24 h. Total RNAs were isolated and then BrF3H1 and BrF3H2 genes were cloned by RT-PCR method.
The open reading frame (ORF) of BrF3H1 and BrF3H2 genes contained 1 536 bp encoding proteins of 511
amino acids. Amino acid sequence analysis showed that BrF3 H1 and BrF3H2 were 99% identitied to F3H of
Brassica napus, and the cytochrome P450 domain was in the sequence from 45 to 476. BrF3H1 and BrF3H2
genes had high identity. The nucleotide sequence of BrF3H1 and BrF3H2 genes had 17 differences, as well as
5 differences in deduced amino acid sequence. The Northern blotting results showed that the expression of
BrF3H1 could be induced by irradiation of UV-A, and the expression of the gene was correlated with light-
exposure time. The expression of BrF3H2 gene could not be induced by irradiation of UV-A.
Key words: turnip; flavonoid 3-hydroxylase (F3H) gene; gene clone; sequence analysis; gene expression
收稿 2008-07-05 修定 2008-08-26
资助 国家自然科学基金(30700560)和国家自然科学基金重点
项目(3 07 3 0 0 78 )。
* E-mail: xuzhiru2003@126.com; Tel: 0451-82191783
植物花青素是黄酮类化合物, 决定花卉、果
实和种子的颜色。花青素主要包括天竺葵色素、
矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛色
素、锦葵色素及其衍生物(Holton和Cornish 1995),
积累在维管植物液泡中。类黄酮 3-羟化酶是花青
素合成途径的关键酶, 属于细胞色素P450单加氧酶
家族, 催化的反应需要NADPH和O2的参与(Buchanan
等 2004)。4,5,7-三羟黄烷酮(naringenin)和二氢莰
非醇(dihydrokaempferol)的B环3位置在F3H的催
化下发生羟化反应, 生成圣草酚(eriodictyol)和二氢
栎精(dihydroquercetin)。在花青素合成途径中, 二
氢栎精在二氢黄酮醇 4-还原酶(dihydroflavonol 4-
reductase, DFR)和花色素合成酶(anthocyanidin
synthase, ANS)等酶的催化下生成紫红色花青素(也
称为矢车菊色素, cyanidin)。目前, 一些植物的
F3H基因已得到克隆(Schoenbohm等2000; Toda等
2002; Bogs等 2006; Jeong等 2006; Xu等 2007)。
花青素生物合成除了受催化酶影响外, 还与转录因
子、光受体及光信号转导因子密切相关(万小荣和
李铃 2002; Quattrocchio等2006; Chatterjee等2006;
Sheehan等2004), 蓝光和紫外光对花青素合成相关
酶基因表达的调控也有所报道(Noh和 Spalding
1998; Zhou等 2007)。
芜菁别名小蔓菁, 十字花科芸苔属芜菁亚种。
需光型的‘津田’芜菁(‘Tsuda’ turnip)块根中花青素
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合成时需要光, 受光部分呈紫红色, 背光部分呈白
色。非需光型的 ‘赤丸 ’芜菁 (‘Yurugi Akamaru’
turnip)块根中花青素合成时无论受光与否都呈红色,
块根在黑暗条件下即可着色。本文以 ‘津田 ’芜菁
和 ‘赤丸’芜菁为试材, 通过RT-PCR方法克隆了两
者的F3 H基因。以基因片段合成探针, 并用Northern
杂交技术检测了UV-A照射条件下两品种芜菁中
F3H基因表达情况, 以期为分离需光型和非需光型
花青素关键催化酶基因和研究需光型和非需光型花
青素生物合成的机制建立基础。
材料与方法
温室种植的芜菁(Brassica rapa L.)品种 ‘津田 ’
和 ‘赤丸 ’在土中避光生长的块根开始膨大时用锡
纸遮蔽整个栽培钵, 进一步避光。块根膨大 2个月
后, 裸放在波长352 nm的UV-A光(光照强度为13.5
µmol·m-2·s-1)下处理 0、6、12、18、24和 48 h。
在Database数据库中查找登录的 F3H基因,
选取十字花科植物的基因序列设计RT-PCR引物。
引物序列为: F, 5 CCACCACTATGACTAATCTT-
TACC 3; R, 5 TAAGTTAGGTTTAAGCCGACCC
3。探针合成的引物序列: F, 5 CAGGCTCCATC-
CACCAACA 3; R, 5 GTAACTGAATCGTCCGTA-
ACCC 3。
LA-Taq DNA聚合酶及DNA Marker等购自宝
生物工程有限公司(大连); pBS-T载体购自北京
TIANGEN生化科技有限公司; PowerScriptTM Re-
verse Transcriptase购自 Clontech公司; Northern杂
交部分试剂购自 Roche公司。
按许志茹和李玉花(2006)文中方法提取UV-A
处理 24 h的 ‘津田 ’芜菁和 ‘赤丸 ’芜菁块根皮总
RNA。用 Clontech公司的 PowerScript反转录酶和
程序进行反转录。以反转录产物为模板, 利用RT-
PCR引物和 LA-Taq DNA聚合酶进行 F3H全长
cDNA的克隆。回收纯化 PCR产物, 与 T载体连
接后转化大肠杆菌感受态细胞 Top 10, 经Amp+抗
性及蓝白斑筛选, 随机挑取转化平板上的白色菌斑
液体悬浮培养后提取重组质粒。重组质粒经 PCR
鉴定后由上海生工生物工程技术服务有限公司测
序。
将测得的两品种芜菁的F3H全长cDNA序列
与NCBI数据库中推测的氨基酸序列进行 Blast比
对。用开放阅读框(open reading frame, ORF)程序
查找序列的ORF, 软件 Clustalw 1.8.1进行多序列
比较和分子进化树的绘制。以 BioEdit软件比较
‘津田 ’芜菁和 ‘赤丸 ’芜菁 F3H基因的异同。用
SignalP 3.0预测蛋白的信号肽。用软件 ProtParam
(http: //au.expasy.org/tools/protparam.html)预测蛋白
的分子量、等电点、稳定性和氨基酸组成。用
ScanProsite软件查找蛋白质的标签序列。用Blast P
和HNN (Hierarchical Neural Network)程序预测蛋
白保守区和二级结构。
Northern杂交时, 提取经 UV-A处理 0、6、
12、18、24和 48 h的芜菁块根皮总 RNA。用地
高辛标记出探针。通过Northern杂交技术检测两
种芜菁中 F3H基因的表达情况(许志茹和李玉花
2006)。Northern杂交重复 3次。
结果与讨论
1 芜菁F3H全长 cDNA的克隆
如图 1所示, ‘津田 ’芜菁和 ‘赤丸 ’芜菁中扩
增的 cDNA产物在 1 500 bp附近, 分子量大小与预
期结果吻合。
图 1 芜菁 F3H基因的RT-PCR反应产物
Fig.1 The RT-PCR product of F3H genes of turnip
M: DNA分子量标记(DL20 00)。
2 芜菁 F3H核苷酸序列和氨基酸序列分析
两类芜菁中 RT-PCR产物测序后证实为F3H
基因全长 cDNA序列。‘津田 ’芜菁 F3H cDNA
(BrF3H1)和 ‘赤丸 ’芜菁的 F3H cDNA (BrF3H2)
序列在GenBank中的登录号分别为 EU402420和
EU402421。Blast比对结果显示, BrF3 H1和
BrF3H2基因和甘蓝型油菜(Brassica napus) F3H
mRNA序列的同源性分别为 99%和 98%, BrF3H1
和 BrF3H2氨基酸序列由 511个氨基酸组成, 含有
完整的 ORF (图 2)。
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氨基酸同源性比对显示(图 3), BrF3H1和
BrF3H2与多种植物的F3H蛋白有高度同源性, 与
甘蓝型油菜 F3H (ABC58722)的同源性为 99%, 与
拟南芥(Arabidopsis thaliana)、矮牵牛(Petunia×
hy br i da )、大豆(G ly c i ne m ax )、葡萄(V i t i s
vinifera)、金鱼草(Antirrhinum majus)、高粱
(Sorghum bicolor)和洋葱(Allium cepa) F3H的同源
性在 88%~59%之间。F3H氨基酸序列的系统树
显示, 芜菁的BrF3H1和BrF3H2与甘蓝型油菜和拟
南芥的F3H的进化关系较近, 与高粱和洋葱等植物
的 F3H较远(图 4)。
‘津田 ’芜菁和 ‘赤丸 ’芜菁 F3H的Blast P分
析结果表明, 此蛋白质第45~476的肽段具有细胞色
素 P450家族基因的结构域。ProtParam程序预测
BrF3H1和 BrF3H2属于稳定蛋白, 分子量分别是
56.59和 56.78 kDa, 理论等电点是 7.01和 7.31, 氨
基酸组成中 Leu占最大比例。SignalP 3.0检测结
果显示 BrF3H1和 BrF3H2的N端第 1~22位氨基
酸区段为信号肽序列。二级结构预测表明 ,
BrF3H1和BrF3H2的511个氨基酸可以形成α-螺
旋、随意盘旋序列和伸展序列, 两种蛋白中不含其
他二级结构。ScanProsite分析显示, BrF3H1和
BrF3H2在436~445的氨基酸序列是FGaGRRICAG,
符合标签序列[FW]-[SGNH]-x-[GD]-{F}-[RKHPT]-
{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD]。此基序也包含在Blast P
程序查找出的蛋白结构域内。BioEdit软件比对结
果显示, BrF3H1和BrF3H2基因的同源性为98%,
核苷酸序列存在17个位点的差异, 推导的氨基酸序
列存在 5个位点的差异。
3 BrF3H1和BrF3H2基因的UV-A诱导表达
为了研究 BrF3H1和 BrF3H2基因的表达与
UV-A处理的关系, 用不同的光照时间处理两种芜
菁, Northern杂交结果显示(图 5), 未露于光下的
‘津田 ’芜菁块根皮中 BrF3H1基因不表达, UV-A
处理 6 h后 BrF3H1的表达量明显增加, 处理 24 h
后BrF3H1基因的表达量最高, 显示BrF3H1与UV-
A光照时间有关系。UV-A不诱导 ‘赤丸 ’芜菁的
BrF3H2基因表达。这表明,‘津田 ’芜菁 BrF3H1
图 2 BrF3H1基因全长 cDNA序列和推导的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of BrF3H1 cDNA
阴影部分为 Northern杂交探针序列, 下划线部分为 RT-PCR 引物序列。
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图 3 芜菁BrF3H1和BrF3H2与其他植物 F3H的氨基酸序列比较
Fig.3 Comparison on amino acid sequences of F3H among turnip and other plants
和‘赤丸’芜菁BrF3H2基因的UV-A诱导表达特性
不同。
F3H是细胞色素加氧酶家族成员, 在花青素生
物合成途径中发挥重要作用(Seitz等 2006)。我们
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实验室已有的工作表明, ‘津田’芜菁块根皮中含有
花青素, ‘赤丸 ’芜菁块根皮中含有花葵素(闫海芳
2003)。前者花青素合成过程中需要 F3H催化二
氢黄酮醇合成二氢栎精, 从而进一步形成紫红色的
花青素(矢车菊色素)。后者的二氢黄酮醇直接在
DFR的催化下生成无色天竹葵色素, 进而合成花葵
素, 此过程不需要 F3H蛋白的催化(刘仕芸 2006)。
‘赤丸 ’芜菁中克隆的不受UV-A诱导的F3H基因
的功能尚需实验验证。
图 5 UV-A处理不同时间 BrF3H1和 BrF3H2基因的表达
Fig.5 Expressions of BrF3H1 and BrF3H2 genes after exposed to UV-A with different times
参考文献
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图 4 植物 F3H蛋白的系统进化树
Fig.4 Evolutionary tree of plant F3H