全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 2期，2005年 4月 143
植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性
孙卫红 王伟青* 孟庆伟**
山东农业大学生命科学学院，泰安 271018
Functional Mechanism and Enzymatic and Molecular Characteristic of Ascor-
bate Peroxidase in Plants
SUN Wei-Hong, WANG Wei-Qing*, MENG Qing-Wei**
College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Taian 271018
提要 介绍叶绿体中 H2O2 的产生和清除，抗坏血酸过氧化物酶(APX)的酶学和分子特性，APX 同工酶在植物体内的分
布和功能及其相互之间的区别，APX 与细胞色素 C 过氧化酶(CPX)和谷胱苷肽过氧化物酶(GPX)等一些在不同生物中的
H2O2 清除酶的异同之处，以及有关 APX 基因工程的研究进展。
关键词 抗坏血酸过氧化物酶(APX); H2O2；清除；叶绿体
收稿 2004-12-06 修定 　 2005-01-04
资助　 国家重点基础研究发展规划(G1998010100)和国家自然
科学基金(30370854)。
* 现在青岛中国海洋大学就读博士学位。
** 通讯作者(E-mail: qwmeng@sdau.edu.cn, Tel: 0538-
8249606)。
过氧化氢(H2O2)是一种活性氧，若不及时清
除，它会通过金属催化的Haber-Weiss反应生成高
度活泼的羟基自由基(·OH)。·OH 能氧化几乎所有
的细胞组分，并引起细胞的破坏[1]。因此，对所
有的好氧生化过程，及时清除 H2O2 和有机过氧化
氢物质对于维持植物正常的生理功能很重要。抗
坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)是利
用抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)为电子供体的H2O2
的清除剂。在细胞内它的同工酶定位于 4 个不同
的区域：叶绿体中的基质 APX(sAPX)、类囊体
膜 APX(tAPX)、微体 APX(mbAPX)和胞质 APX
(cAPX)。目前，有多种植物的 APX 基因已克隆
并应用于提高植物的抗逆性。
1 叶绿体中H2O2 的产生和清除及APX的作用机制
H2O2 是叶绿体中光合电子传递和某些酶学反
应的天然产物及对植物具有毒害作用的一种活性
氧。活性氧是需氧生物正常代谢的产物，已知在
逆境伤害、机体损伤、细胞分裂、酶反应等方
面都可能涉及到活性氧的作用。活性氧可与
D N A 、类脂化合物和蛋白质反应，引起细胞损
伤。在植物组织中，活性氧类型主要有 H 2 O 2、
·OH、单线态氧(1O2)等。H2O2 的伤害机制，一方
面与其本身的毒害有关，如它可以抑制Calvin循
环中的酶，降低叶绿体中的 AsA 含量，氧化铁氧
还素[2]。H2O2 的累积可以促进叶绿素的降解，其
原因可能是由于高水平的 H2O2 诱导酚特异性过氧
化物酶(PPOD)的从头合成，而 PPOD 使酚氧化形
成酚自由基从而攻击叶绿素[3]所致。另一方面，
H2O2与超氧阴离子自由基(O2－· ) 相互反应形成致命
的 ·OH。已证明 ·OH 是活性最强的活性氧，它可以
直接引发脂质过氧化[4]，严重时导致植物细胞死亡。
一般认为，叶绿体中双氧分子的光还原产物
是 H2O2，它由定位在基质中的铜锌 - 超氧化物歧
化酶(CuZn-SOD)催化的O2－· 的歧化反应产生[5]:
O2－· +2H+ —→H2O2+O2
在光照下的叶绿体中，双氧分子是由光系统
Ⅰ(PSⅠ)(反应中心X和/或反应中心A/B)还原侧电
子载体和铁氧还蛋白还原而成的[6]，其光还原速
率[15 mmol·mg(chl)·h-1]仅是饱和光下由CO2的同化
速率所观察到的电子传递速率的 10%，其原因尚
不清楚[7]。H2O2攻击的主要目标是果糖-1,6-二磷
酸酶、3- 磷酸甘油醛脱氢酶和 5- 磷酸核酮糖激
酶，因此及时清除 H2O2 对于维持叶绿体的光合能
力是必要的[1]。
植物叶绿体和胞质中，一个主要的H2O2 清除
系统称为抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环，其
中 APX 是关键的酶[8]。叶肉细胞的过氧化物酶体
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内广泛分布着过氧化氢酶(catalase, CAT)，但在叶
绿体中尚未发现 CAT 的存在，也未发现清除 H2O2
的 GSH、细胞色素 c 或吡啶核苷酸，而且 APX 对
H2O2 有更高的亲和力[9]，故认为叶绿体中的 H2O2
是由 APX 清除的。例如，H218O 2 及 18O2 的实验证
明，添加 H218O2 后，照光的菠菜叶绿体释放的是
16O 2 而不是18O 2，由于叶绿体中不存在 CAT，故
认为 H218O2 是由 APX 分解的[10]。
H216O2 —→ 2H++2e+16O2
H218O2+2e+2H+ —→2H218O
H216O2+H218O2 —→16O2+2H218O
当无 CO2 而提供18O2 时，照光的完整叶绿体
能以相同速率吸收18O2，释放16O2，没有 H218O2 积
累，表明叶绿体产生的内源 H2O2 也是通过 APX 分
解的。H 2O 2 从叶绿体扩散到过氧化物酶体后由
CAT 清除是不可能的，因为叶绿体中 H2O2 的清除
是利用类囊体中产生的光化还原剂作为电子供体
的[2,10]。Foyer和Hailiwell[11]首先确认此种过氧化物
酶催化反应的电子供体是 AsA。APX 催化 AsA 与
H2O 2 反应而使 H2O 2 分解：
2AsA+H2O2 —→2MD-AsA(单脱氢抗坏血酸)+2H2O
只要 AsA 能够再生，APX 就能充分进行催化
反应，从而保护叶绿体维持正常的光合能力。
2 APX的反应机制
Foyer和Hailiwell[11]于1976年发现了以AsA为
电子供体的一种过氧化物酶，1981 年 Nakano 和
Asada[2]正式确定此酶为APX，存在于叶绿体的基
质 中 。
2.1 APX的反应机制 APX的催化循环属于过氧化
物酶的乒乓机制，反应如下[12](R表示卟啉或保守
Trp 残基，MDA 为单脱氢抗坏血酸):
APX-Fe (III)-R+H2O2—→
APX-Fe(IV)＝ O-R++H2O
APX-Fe(IV)＝ O-R++AsA —→
APX-Fe(IV)＝ O-R+MDA
APX-Fe(IV)＝ O-R+AsA —→
APX-Fe(III)-R+MDA+H2O
APX 首先被 H2O2 氧化成中间复合物，此种中
间复合物接着氧化抗坏血酸双电子氧化物形成2个
分子的 M D A。当 A s A 未为复合物利用时，A P X
失 活 。
2.2 抑制剂及抗坏血酸的作用 APX作为一种血红
蛋白，通过与血红素铁的连接作用而受氰化物或
叠氮化物抑制。巯基试剂也能通过阻断 H2O2 与血
红素的氧化作用而使 APX 失活。
APX 还有更多的特异性抑制剂，如巯基、双
胺苯、羟基脲素和羟胺。这些化合物本身并不能
抑制 APX，但在 H2O 2 存在时，它们则使 APX 失
活。例如，由 APX 催化的羟脲(HU)能被 H2O 2 氧
化形成它的氨基离子(HU·)，尽管它的反应速度与
抗坏血酸相比并不高。
2HU+H2O2 —→2HU·+2H2O2
反应中心形成的 HU· 能与 APX 或中间复合物
发生反应，从而使 A P X 失活。
HU·+APX(或复合物)—→失活的 APX
当 AsA 存在时，HU· 的酶促产物与AsA 竞争，
HU · 被 AsA 产生的 MDA 所捕捉。通过这个机制，
AsA保护了由自杀性抑制剂引起的APX 的失活[13]。
AsA 的浓度低于 20 mol·L-1 时，APX 即失活，这
主要是由中间复合物的降解引起的。AsA 未被中
间复合物利用时，APX 的血红素就会被 H2O2 分解
掉，从而使 APX 失活。 tAPX 和 sAPX 的半寿期
约是 20 s，而 cAPX 的半寿期约是 10 min，所
以叶绿体 APX 非常不稳定[9]，这也是 APX 不像谷
胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase, GPX)那样
容易被发现的原因之一。
AsA 可直接与活性氧反应而将其还原，又可
作为酶的底物在活性氧的清除过程中起作用，即
在叶绿体类囊体表面作为还原剂参与 APX 介导的
H2O 2 的清除。在这一过程中，AsA 氧化成 MDA。
叶绿体中 APX 发挥正常的催化作用时，需要依赖
单二氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbate
reductase, MDHAR)、二氢抗坏血酸还原酶
(dehydroascorbate reductase, DHAR)、铁氧还蛋白
(ferredoxin, Fd)和MDA等参与的4种反应源源不
断地再生 AsA。如 AsA 由 MDHAR[14,15]或 DHAR[14]
分别利用NAD(P)H或谷胱甘肽(glutathione, GSH)作
为电子供体，催化过氧化物酶反应中的氧化产物
得以再生，而这两种电子供体又可利用来自类囊
体的电子再生[10]。由于 AsA 在清除活性氧的过程
中发挥作用，故在叶绿体中，它与氧的摄入、
APX 的功能及分子氧还原相关的过程统称为“米
勒-抗坏血酸过氧化物酶光呼吸”[16]。因为AsA能
使 APX 处于稳定状态[17]，所以在纯化过程中必须
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加入 A s A。
3 APX的分子和酶学特征
APX 是一种包含原卟啉 IX 的血红蛋白，它
的分子量大约是 30 k D，单体存在，但有几种
cAPXs 则以同二聚体形式存在。人们已根据茶
叶[18]、拟南芥[19]、大豆[20]、盐地碱蓬[21]的 cDNA
推断出 cAPX 的整个氨基酸序列，它们之间有很
高的同源性(77%~85%)。玉米[22]和菠菜[23]cAPX
的部分氨基酸序列也已确定，从茶叶[24]中亦得到
了sAPX，从菠菜中得到了tAPX[25]的氨基酸序列。
3.1 APX的系统分布及其同工酶之间的异同 在高
等植物中，已报道有 4 种具有不同细胞定位的
APX 同工酶：mbAPX、cAPX、sAPX 以及 tAPX。
cAPX 定位于光合和非光合组织的细胞质中，已
有报道认为逆境胁迫如干旱、热胁迫等能导致
cAPX 的 mRNA 产生，它在清除 H2O2 和使光氧化
伤害处于最低水平中起作用[26]。mbAPX 位于乙醛
酸体和叶片过氧化物酶体的膜上，以还原从乙醛
酸体和叶片过氧化物酶体漏出的H2O2[27]。叶绿体
APX(chlAPX，包括 sAPX 和 tAPX)在叶绿体内清
除 H2O2，sAPX 以可溶态存在于基质中，tAPX 以
结合在膜上的形态存在于类囊体上[28]。在藻类中
也发现了 cAPX，这表明藻类原始的 cAPX 进一步
分化为叶绿体中的 tAPX 和 sAPX 以及被子植物中
的 cAPX。APX 同工酶的表达状况受处于各种胁
迫条件下的各个细胞区室的分别调控，而且每种
APX 同工酶的表达在保护各种组织和保持组织最
小伤害中起协调作用[26]。
cAPX 与 chlAPX 在组成、结构、底物特异
性和亲和力及纯化中的稳定性不同[20]，二者特性
的差异主要在于[8,13]: (1)两种类型的酶分子是不同
的，各有其特征性序列。目前，在 c A P X 所测
序列中，半胱氨酸(Cys)-31被保护起来，表明它
参与了过氧化反应，而在 tAPX 中未发现相应的
Cys 残基。 (2)分子量不同，chlAPX 为 30 000~
34 000 bp，cAPX约为 57 500 bp。 (3)对 AsA的
敏感性不同，在不含有 AsA 的介质中，chlAPX
比 cAPX更快失活，前者的半衰期为15~30 s，后
者约为 300 s。 (4)对抑制剂的敏感性不同，
chlAPX对巯基试剂(羟基脲)、氨基苯酚等比cAPX
更敏感。 (5)chlAPX 对电子供体的特异性更高，
它不能以愈创木酚、邻联二茴香胺、邻苯二酚作
为电子供体；而cAPX则可以。 (6)植物中存在几
种 cAPX 形式，有几种 cAPX 以同二聚体形式存
在，目前已知序列的 cAPX 未发现目标转运肽；
chlAPX 以单体存在，tAPX 和 sAPX 都发现了向叶
绿体转移的转运肽。 (7)最适 pH 值范围不同，
chlAPX 的最适 pH 值范围窄于 cAPX。
叶绿体tAPX 与 sAPX 有相同的分子比率。假
设每 430 个叶绿素分子有一分子 P700，则 tAPX
和 sAPX 与 P700 的分子比率都是 0.5。二者的分
子特性差别不大，有相似的酶特性，只是 tAPX
的分子量比sAPX大 10 kD，推测这可能是结合在
膜上所必需的。而且，tAPX 在碳末端有一个连
接到类囊体膜上的额外疏水区域[29,30]。除了tAPX
碳末端的差异之外，这两种 APX 的氨基酸序列从
N 端到 315 位残基是相同的。
3.2 APX 与 CPX、GPX 的异同 APX 的氨基酸序
列测定法等表明，它与细胞色素 c 过氧化酶
(cytochrome c peroxidase, CPX)同属于血红素过氧
化酶(class I)，二者的三维结构也相似。CPX位
于线粒体并参与 H2O2 的清除，这与叶绿体的 APX
类似。尽管 APX 与 CPX 有很高的序列同源性，但
二者反应中间物的稳定性却有很大差异，CPX 的
复合物 I 很稳定，故常用作 H2O 2 的微量分析。
A P X、G P X 都是血红蛋白，能通过连接到
血红素上而被氰化物和叠氮化物抑制，都不含任
何碳氢化物。AP X 起催化作用的机制与 GP X 相
同，都是过氧化物酶的乒乓机制。但植物中典型
的 GPX，如辣根过氧化酶在氨基酸序列和生理功
能上都与 A P X 明显不同。
APX、CPX 与 GPX 的不同之处主要表现在：
(1)APX 在高等植物和藻类中，CPX 存在于真菌
中，二者都位于细胞器中，生理功能是清除
H2O2；GPX 主要定位于哺乳动物中，植物中 GPX
的功能不是清除 H2O 2，而是参与新陈代谢反应，
如木质素的生化作用，IAA 的分解，抵御病原体
等[1,8]，它在植物组织中定位在液泡、细胞壁和胞
质中，叶绿体中几乎没有发现[2]。 (2)APX与 CPX
之间的同源性比APX和植物中的GPX更高[12, 13, 27]。
(3)APX 和 CPX 都不能发生糖基化作用，而 GPX
本身就是一个糖蛋白[9]。在和 GPX 发生糖基化作
用的同样位点上，APX和CPX都未发现天冬酰胺[23]。
(4)APX能被巯基试剂抑制，以至于1个分子中的
4个半胱氨酸残基中至少有2个不能形成二硫键；
相反，巯基试剂并不能对 GPX 起作用[9]，人们根
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据这个特性用来分析 APX 和 GPX 的特异性[31 ]。
(5)氧化介质不同：CPX的氧化介质是Oxy-ferrl血
红素和色氨酸残基，GPX是通过Oxy-ferrl血红素
和卟啉残基起作用[8]。 (6)虽然在蓝藻[32]、菠菜叶
绿体[2]或其他植物中发现了 GPX，但它的活性仅
是 APX 的 1%[33]，其表达受到抑制，而植物却特
别地发展了 APX。 (7)GPX 和 GSH 是由 NADPH 再
生的，N A D P H 由谷胱甘肽还原酶催化产生。而
AsA 则是由利用光合的 NAD(P)H 和 GSH 的系统再
生的[8]。
4 APX的基因工程
提高植物体内抗氧化酶活性和增强抗氧化代
谢的水平是提高植物抗逆性的有效途径之一。
APX 能提高氧化耐受性的作用已在许多植物中有
报道，目前多种植物的 APX 基因已克隆并应用于
植物转基因的研究。
人们已从棉花、拟南芥等植物中克隆了 APX
基因，并进行了部分转基因植物的研究。
Kornyeyev等[34]获得了转叶绿体APX基因的棉花植
株，A P X 在植物体内过量表达，其叶片中 A P X
活性比野生型的提高5倍。王庆斌等[35]获得了转
APX 基因的水稻植株并研究了其功能，发现 APX
基因植株中可能表达 APX 的相关蛋白，可以抵抗
甲基紫精的氧化胁迫，有效保护膜系统。
Kornyeyev 等[34]将 SOD、tAPX、谷胱甘肽还原酶
(glutathione reductase, GR)基因分别导入棉花中，
得到过量表达，所有转基因棉花具有较高的PSII
光化学活性和抗氧化能力。Wang 等[36]获得的转
tAPX 烟草植株，其 APX 活性明显提高，抗低温
的能力也增强。Charles等[20] 研究大豆cAPXs中
观察到，APX 的转录、翻译和翻译后调控可能增
强农作物抵抗环境胁迫的能力。
5 结束语
植物氧代谢研究已有30多年历史，这个问题
不仅涉及植物生命本质，也有生产应用价值。人
们虽然对活性氧在植物体内的产生和清除以及调控机
制已有较深入的认识，但仍有许多问题有待解决。
哺乳动物和植物体含有相同分量的 GSH，为
什么在长期的进化过程中，前者选择了 GPX，而
植物却特别地发展了 APX活性[8]？
由于植物中许多抗氧化剂参与活性氧的清除
过程，且在氧化胁迫下，许多细胞组分需要保
护，所以单纯地转化某一个基因使之过量表达难
以达到预期效果。SOD 是植物活性氧代谢的关键
酶，从目前的研究结果来看，单纯提高 S O D 的
活性并不能显著提高植物的抗逆能力。推测在转
S O D 基因植物中，虽然超氧物阴离子得到了清
除，但 H 2O 2 的清除过程又成了限速步骤，使植
物并不能在整体上提高活性氧的清除能力。Choi
等[37]检测到低温下黄瓜叶片中H2O2 积累量增加约
3 倍，因而他们认为 CuSn-SOD 是光冷胁迫的主
要靶位。 APX是否是真正的靶位，我们认为应该
验证。如果把 A P X 也同时转入植物中，是否就
会解决这个问题，也待进一步验证。
由于各种植物抗氧化胁迫的机制不同，因此
在用基因工程方法增加各种抗氧化酶合成的同时，
应注意 AsA、GSH、VitE 等抗氧化物质代谢产物
的生成[38]。叶绿体中AsA 浓度对于APX 的活性有
很大的影响，看来，AsA 再生系统也是非常重要
的。怎样提高 A s A 的再生，也需进一步研究。
在诸如热击、盐渍等逆境条件下，A P X 转
录水平和酶活性均提高，但免疫分析显示 APX 蛋
白总量却不变。这表明在逆境条件下，APX 的调
节至少存在蛋白质从头合成、蛋白质稳定性或酶
激活几个方面。其间具体的机制尚不清楚[38]，今
后这方面的研究也需要加强。
逆境胁迫信号和氧胁迫信号之间往往有相关
性。如热击转录因子(heat shock factor, HSF)参与
胞质APX2/ 热击 APX 表达的诱导表明，热胁迫和
氧胁迫信号之间有相关性[39]。但 H2O2 参与的植物
逆境胁迫中氧胁迫依赖型 APX 活性的改变问题还
未搞清。另外，目前还没有能同时分析所有
A P X 同工酶对胁迫产生不同反应的方法[30]。这些
问题均应探讨。
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