全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第5期，2005年10月 649
光合作用条件下烟草叶片中的NADP 含量分析
王鹏* 叶济宇 米华玲**
中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海200032
Determination of NADP in Tobacco Leaves Under Photosynthetic Conditions
WANG Peng*, YE Ji-Yu, MI Hua-Ling**
Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai
200032, China
提要 用酶循环法在叶片水平上分析 NADP 含量的结果显示，在光照条件下，NADP 含量呈现出先迅速下降进而缓慢上
升的变化，上升过程受高温和抗霉素 A (antimycin A)抑制，说明此法所得结果能够反映光合作用条件下叶中内源 NADP
含量的变化趋势。
关键词 NADP 含量；酶循环法
收稿 2004-12-27 修定 　2005-04-21
资助 国家自然科学基金(30270123)。
*E-mail: pwang@sibs.ac.cn
** 通讯作者(E-mail: hlmi@sibs.ac.cn, Tel: 021-
54924137)。
NADP(辅酶 II)作为叶绿体内重要的氢受体，
通过光合电子传递形成 NADPH(还原型辅酶 II)，
进而与光合磷酸化反应生成的 ATP 一起推动 CO2
同化，N A D P H 重新氧化为 N A D P。叶绿体内源
NADP含量很低[仅10-9 mol·mg-1 (Chl)]，有人曾采
用高灵敏度的酶循环测定法对菠菜离体叶绿体中
NADP/NADPH 作了分析[1,2]。但如要分离到具有
同化 CO2 活性的完整叶绿体，除了菠菜和豌豆等
少数材料外，其他植物材料尚有一定的难度。因
此，若能直接从叶片中分析 NADP，并能反映其
在光合作用条件下的氧化还原情况，其生理意义
是不言而喻的。另外，叶片中还原物质的干扰与
分析仪器灵敏度偏低之间的矛盾也是需要研究克服
的问题。我们在研究烟草光合作用时，感到制备
具有同化 C O 2 活性的离体叶绿体难度较大，为
此，直接以烟草叶片为材料对分析 NADP 含量的
方法进行了探索，结果表明此法在一定程度上可
以反映光合作用条件下叶中内源 N A D P 含量变
化，现报告如下。
材料与方法
1 植物材料
烟草(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)种植于人
工气候室(12 h光照 /12 h黑暗；光照度约300 mmol
(光量子)·m-2·s-1；温度为白天25℃，夜晚20℃；
湿度为 40%~50%)。播种后 6~8 周，取第 1 片完
全展开的叶片作实验。切取直径为1 cm的烟草叶
圆片 20 片，叶面朝上浮于 28℃恒温水浴的水面
上，在约500 mmol(光量子)·m-2·s-1光照下处理1 h。
热处理时，水浴温度升至 42℃；抗霉素A(anti-
mycin A)处理时，预先将5 或7.5 mmol·L-1的溶液真
空渗入叶圆片，以渗入水为对照。
2 样品制备
经以上处理的叶圆片再暗适应 5 min，并在
暗中取出4片，投入1 mL 0.5 mol·L-1 HClO4中研
磨固定，作为暗处理样品。重新照光，分别在
不同时间取出 4 片叶圆片制备光处理样品，取材
和研磨必须保持在约500 mmol(光量子)·m-2·s-1光下
迅速进行。以酸固定的样品在室温下放置 5 min
后，10 000×g离心 3 min，取上清液，加入55 mL
1.2 mol·L-1 三乙醇胺(终浓度约60 mmol·L-1)，并
以饱和 K2CO3 调 pH 至 7.6，离心后上清液置于冰
浴中备用。
3 酶循环法测定
每40 mL基本反应液中含20 mL 0.1 mol·L-1
Tris-HCl (pH 7.9)、1.2 mL 0.1 mol·L-1 EDTA、600
mL 5 mmol·L-1 二氯酚靛酚(DCPIP)、18.4 mL水。
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第41卷 第5期，2005年10月650
酶反应体系为 2.5 mL，含反应液 2 mL、10 mL
10 mmol·L-1 二氮蒽甲硫酸(PMS)、500 mL 样品、
10 mL 0.1 mol·L-1葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)、10 mL
G-6-P脱氢酶(0.05 mg·mL-1)。反应开始前，除G-
6-P 脱氢酶以外的其他组分均匀混合后，分装于
两比色杯(样品杯和参考杯)中，用 Shimazu UV-
3000双光路分光光度计进行测定，反应从样品杯
中加入G-6-P脱氢酶开始，于波长600 nm处记录
光密度值衰减速度。反应条件为黑暗、28℃，按
NADP 浓度标准曲线计算 NADP 含量[2]。
实验结果
1 光诱导的NADP 含量变化
图 1 显示，经光照的叶片置于暗中后，其
NADP含量缓慢下降, 这可能是叶绿体内G-6-P/6-
G-P 等转换反应在暗中运行的结果。重新照光后
的瞬间，叶绿体内的 NADP 迅速还原为 NADPH，
其含量显著下降；持续照光，CO2 同化反应可能
逐渐激活，N A D P H 消耗而减少，所以 N A D P 含
量重新上升；CO 2 同化速率趋向恒定时，NADPH
氧化还原速率也趋向平衡，因而 NADP 含量趋向
稳 定 。
2 热处理对光诱导过程中NADP 含量的影响
高温能抑制Calvin循环的活性，因而CO2 同
化速率减慢[3,4]。热处理时，由于电子传递链和基
质处于相对还原的状态，NADP 含量偏低，照光
的瞬间，叶绿体中 NADP 仍能通过光合电子传递
生成 NADP H 而减少；但由于 CO 2 同化可能受到
抑制，N A D P H 耗用受阻，N A D P 含量并不随光
照时间的延长而升高(图 1)。因此，测定光照条
件下的 NADP 含量变化，也能间接反映碳同化的
活 性 。
3 抗霉素 A对光诱导过程中NADP 含量的影响
抗霉素 A 是一种循环电子传递抑制剂，而循
环电子传递偶联的光合磷酸化可能为CO2同化反应
的有效运行提供部分ATP[5,6]。经抗霉素A处理的
叶圆片，在照光初期 NADP 仍然迅速还原和逐渐
再氧化，但随着照光进程，NADP 含量不是趋向
稳定，而是开始下降(图 2)。这表明由于抗霉素
A 抑制循环电子传递，光下 CO 2 同化所需的 ATP
供应可能逐渐不足，因而 NADPH 的利用也受到抑
制。随着抗霉素 A 浓度的升高，N A D P H 利用受
抑程度也进一步加大。
讨 论
酶循环法是指用酶的底物特异性放大靶物质
的测定方法。G-6-P 脱氢酶可专一性地利用NADP
作为辅酶催化 G-6 - P 的氧化，生成 NAD P H 后，
其再氧化又与 PMS 的氧化还原相偶联，从而推动
DCPIP 还原，其褪色程度与 NADP 含量成比例。
一定时间内如此循环 n 次，灵敏度可提高 n 倍。
由于以叶片直接制备的样品中含有抗坏血酸
等还原性物质，会引起 DCPI P 显著的非酶促褪
色，若使用背景干扰大和灵敏度过低的普通单光
路分光光度计测定，可靠性会受到影响。我们根
据G-6-P脱氢酶可专一性地利用NADP为辅酶的特
性，适当提高 DCPI P 浓度，让其能足够地承受
非酶促反应所引起的褪色，用双光路分光光度计
图1 光诱导和热处理时的NADP含量变化
图2 抗霉素 A对 NADP 含量的影响
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进行测定，以实时地消除对照杯和反应杯中由于
非酶促褪色而产生的变化，同时，可以设定较高
的测定灵敏度，于加入 G-6-P 脱氢酶后直接记录
酶促反应的速度。图3中不同照光时间叶片在G-
6-P脱氢酶驱动下对NADP 特异的酶促反应变化表
明，此法可以达到从高背景中检测 NADP 特异反
应的目的。
尽管此法可测得叶片在光、暗转换或光诱导
下 NADP 含量的动态变化，以及其受环境条件和
化学抑制剂的影响，在一定程度上可以反映
NADP含量消长与光合碳同化的关系和光合电子传
递链的氧化还原状态，但仍然需要破碎活体细胞
或组织，有其局限性和不足之处。近来，Mi 等[7]
用测量 NADPH 荧光法直接对光诱导下的蓝藻细胞
进行了 NADPH 含量变化分析，这对在非破坏条件
下直接监测细胞中 NADP 或 NADPH 的生理变化提
供了可能。但此法直接用于高等植物叶片时，仍
然有较多干扰因素影响测定，对此，我们正在探
讨 中 。
参考文献
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2000, 41(10): 1129~1135图 3 对 NADP特异的酶循环反应初速度