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海南粗榧愈伤组织的诱导和培养



全 文 :植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期,2004 年 2 月34
海南粗榧是国家二级保护濒危植物[1,2]。自上
世纪70年代,人们从其树皮和枝叶中分离出脱氧
三尖杉酯碱(deoxyharringtonine)、异三尖杉酯
碱(isoharringtonine)、三尖杉酯碱(harring-
tonine)和高三尖杉酯碱(homoharringtonine)等
多种生物碱,并经动物肿瘤抑制试验及临床应
用,证实对各类白血病及恶性淋巴病有很好疗
效[3,4]。以后,海南粗榧资源破坏严重。由于该
树种生长缓慢,自然资源有限,很难满足日益增
长的临床需求。因此,对海南粗榧进行细胞培
养,让其产生有用的次级代谢产物,以解决其资
源保护和开发利用的矛盾很有必要。
用细胞培养生产药用成分的工业化研究始于上
世纪50年代,已有许多成功的先例 [5~8]。人们对
三尖杉科其他树种组织培养和生物碱分析曾有过报
道[9~12]。但尚未见到海南粗榧细胞培养的有关报
道。自1994年以来,我们开展了海南粗榧细胞培
养、快速繁殖和生物生态学的研究[14~16],试图通
过海南粗榧的细胞培养提取有效抗癌次生代谢产
物。本文是这方面工作的继续。
材料与方法
海南粗榧(Cephalotaxus mannii)采自中国
热带农业科学院热带植物园。取其嫩树皮、茎、
叶为外植体。采用 MS 基本培养基,在不同培养
阶段添加 NAA(单位:mg.L-1,下同)、2,4-D、
6-BA 和 KT 等。固体培养基用 0.6% 卡拉胶固化,
3.0%蔗糖,pH 5.8。培养温度为(25± 3)℃。采
用固体和液体悬浮振荡两种培养方式。光培养以
日光灯为光源,连续照光 10~12 h.d-1,光照度
为1 000~1 500 lx;暗培养在暗中进行。外植体
在流水中冲洗后,放在新洁尔灭溶液中浸洗 1 0
min,以蒸馏水洗净;于无菌条件下用 70% 酒精
擦拭表面,再用 70% 酒精浸泡 1 min;最后在
0.1% 升汞中消毒,消毒时间分别为 10、12、15
和 20 min,用无菌水冲洗 3~4次后接种。培养
7 d后统计污染率和观察外植体长势。
诱导愈伤组织时,将外植体切成约1 cm的长
条小块和 1 cm × 1 cm 方块(树皮),接种于 12
种处理的诱导培养基中。接种时按树皮、茎、叶
3 种外植体类型分类接种,每处理接种 4 瓶,每
瓶接种外植体 3 块,共 12 块。培养 50~60 d 后
统计出愈块数,计算诱导率,同时观察愈伤组织
生长情况。
愈伤组织继代增殖培养时,以6-BA 0.1+NAA
海南粗榧愈伤组织的诱导和培养
符文英1 杜道林2,* 符木均1
1海南大学农学院, 海口 570228; 2海南师范学院生物系, 海口 571158
提要 海南粗榧的嫩茎和嫩叶以 0.1% 升汞消毒 12 min 的效果最好。外植体在 MS+0.1 mg.L-1 6-BA+1 mg.L-1 NAA+2
mg.L - 1 2,4-D+3.0% 蔗糖 +0.6% 卡拉胶(pH 5.8)培养基中能顺利诱导出愈伤组织。液体悬浮和暗培养均有利于愈伤组
织的增殖。愈伤组织增殖的最佳培养基为 MS+0.1 mg.L-1 KT +3 mg.L-1 NAA+3.0% 蔗糖(pH 5.8)。
关键词 海南粗榧; 愈伤组织; 诱导; 增殖; 组织培养
Callus Induction and Culture of Cephalotaxus mannii
FU Wen-Ying1, DU Dao-Lin2,*, FU Mu-Jun1
1College of Agronomy, Hainan University, Haikou 570228; 2Department of Biology, Hainan Normal College, Haikou 571158
Abstract The results showed that: (1)Young stem and young leaf of Cephalotaxus mannii were sterilized best
in 0.1% mercuric chloride for 12 min; (2)MS medium+0.1 mg.L-1 6-BA+1 mg.L-1 NAA+2 mg.L-1 2,4-D+3.0%
sucrose+0.6% carrageenan (pH 5.8) could induce calli from explants; (3)Liquid suspension and dark cultures
were advantageous to proliferation of callus; (4)MS medium +0.1 mg.L-1 KT+3 mg.L-1 NAA+3.0% sucrose
(pH 5.8) was optimum for proliferation of callus.
Key words Cephalotaxus mannii; callus; induction; proliferation; tissue culture
收稿 2003-02-12 修定  2003-06-30
资助  国家自然科学基金(39660018, 30260024)、海南省
重点扶持学科“生态学”、海南大学科研基金、海南
师范学院科研启动基金。
* 通讯作者(E-mail:ddl@hainnu.edu.cn, Tel:0898-
68374118)。
植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期,2004 年 2 月 35
1+2,4-D 2培养基中诱导并继代3次的愈伤组织为材
料。将愈伤组织切成等体积小块,重约0.5 g,接
种于不同处理中,连同培养瓶称重。每处理接种
4瓶。培养45 d后称鲜重(此鲜重为45 d后培养
瓶总重量和刚接种后培养瓶总重量的差值)。继代
增殖培养试验有:(1)加入 NAA 和 2,4-D;(2)
固相和液相培养试验(液相培养为振荡培养,约140
r . m i n -1);(3)光培养和暗培养试验。
观察愈伤组织生长动态时,用KT 0.1+NAA 3
培养基,接种 20 瓶,并在接种当天和培养后 5、
10、20、30、40、50、60 d 分别称取培养瓶
重量(W 0 和 W j ),并按愈伤组织平均增长数
(g)= (W j- W 0)/ 2 0 绘制生长曲线。
结果与讨论
1 外植体消毒时间的比较
海南粗榧为多年生乔木,材料带菌多,不易
彻底消毒;同时,此树种对消毒剂很敏感,极
易被杀伤变褐。表 1 的结果显示,外植体的污染
率以0.1%升汞处理10 min的为最高,12 min次
之,15 和 20 min 最低。但从外植体的表现情况
看,超过 15 min 则出现变褐死亡现象。这说明
消毒时间过长,不利于培养。故 0.1% 升汞的消
毒时间应控制在12~15 min 内。
2 海南粗榧愈伤组织的诱导
海南粗榧的树皮、茎段、叶片接种在 12 种
不同生长调节物质组合的培养基中。光培养 3 周
后,部分组合中外植体开始膨大,切口处先后长
出黄绿色愈伤组织。培养60 d 后的结果(表2)
表明:树皮在12种组合中都没能诱导成功;2,4-D
对愈伤组织的诱导有决定作用,凡没有添加2,4-D
的组合诱导率均为零。6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 2
可促进愈伤组织的诱导,叶的诱导率比茎段高。
3 愈伤组织的继代增殖培养
从表 3 和表 4 可见:
(1)5种处理间差异极显著。加2,4-D的海南
粗榧愈伤组织生长最好。但随着培养时间的延长,
愈伤组织有逐渐变褐、死亡的现象,且2,4-D浓度
越高,褐变现象出现得越早。加有 N A A 的愈伤
组织生长快, NAA在愈伤组织的增殖中比2,4-D
重要(表 3)。所有处理中以 KT 0.1+NAA 3 最
好,愈伤组织不仅生长快且色白、疏松;其他
处理的愈伤组织生长相对缓慢,并有逐渐变褐、
死亡的趋势。
(2)液体培养的愈伤组织增殖比固体培养
表1 海南粗榧外植体在1%升汞中消毒时间的效果比较
Table 1 Sterilizing time of explants of Cephalotaxus
mannii in 0.1% mercuric chloride
消毒时间/ 接种数/ 污染数/ 污染率/ 外植体
min 块 块 % 生长情况1)
10 16 7 44 正常
12 16 2 13 正常
15 16 1 6 部分褐死
20 16 1 6 严重褐死
1) 接种15 d后观察的结果,升汞浓度为0.1%,培养基
为 M S 培养基。
表2 不同生长调节物质组合对海南粗榧愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effects of different hormones on callus induction
树皮 茎 叶
生长调节物质浓度/
mg.L-1 外植体 成愈数 诱导率 外植体 成愈数 诱导率 外植体 成愈数 诱导率
数/块 /块 /% 数/块 /块 /% 数/块 /块 /%
6-BA 0.1+NAA 1 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.1+NAA 2 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.1+NAA 3 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.1+NAA 5 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.5+NAA 1 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.5+NAA 3 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.5+NAA 5 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 1+NAA 0.1 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 3+NAA 0.1 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 5+NAA 0.1 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 1 12 0 0 12 11 91.7 12 12 100
6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 2 12 0 0 12 12 100 12 12 100
培养60 d后测定的结果。
植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期,2004 年 2 月36
好;暗培养比光培养更适合愈伤组织增殖;液体
暗培养的愈伤组织生长最好。KT 0.1+NAA 3 组
合在任何培养条件下均优于其它组合(表 4 )。
4 愈伤组织的生长动态
图1显示,培养前20 d,愈伤组织生长较慢;
20~45 d的生长速度明显加快;45~60 d的生长
速度变慢。因此,若要获得较高的愈伤组织生物
量,则以培养 40~45 d为宜。
根据本文结果,我们认为有几个问题须考
虑:(1 )如何防止褐变。海南粗榧愈伤组织
在继代增殖过程中常出现褐变现象,尤其是培
养基中添加 2,4 - D 的,变褐较早且严重。(2)
培养基中 2,4-D 对次生代谢产物的药用安全性如
何。(3)前人[3,4]工作表明,海南粗榧不同部位
组织中的生物碱含量差异很大,以树皮含量最
高。本文以树皮作外植体,但由于树皮易于褐
死,诱导未能成功。如何解决这一问题,也应
深入研究。
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图1 海南粗榧愈伤组织生长进程
Fig. 1 Growth course of callus of Cephalotaxus mannii
表3 NAA和2,4-D对海南粗榧愈伤组织增殖的影响
Table 3 Effects of NAA and 2,4-D on callus proliferation
差异显著性
生长调节物质/mg.L-1 鲜重/g.瓶-1
0.05 0.01
KT 0.1+NAA 3 1.55 a A
6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 2 1.25 b B
KT 0.1+2,4-D 2 1.16 c C
6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 1 1.10 d D
KT 0.1+2,4-D 1 1.06 e E
F=33.6>F0.01=26.83
表4 培养方式对海南粗榧愈伤组织增殖的影响
Table 4 Calli proliferation with different culture methods

培养方式
鲜重/g.瓶-1
KT 0.1+NAA 3 6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 2 KT 0.1+2,4-D 2 6- BA 0.1+NAA 1+2,4-D 1 KT 0.1+2,4-D 1
固体培养 光培养 1.58 1.25 1.20 1.12 1.05
暗培养 1.64 1.31 1.23 1.16 1.07
液体培养 光培养 1.70 1.34 1.28 1.20 1.10
暗培养 1.74 1.37 1.32 1.24 1.16
培养45 d后测定。