全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月34
海南粗榧是国家二级保护濒危植物[1,2]。自上
世纪70年代，人们从其树皮和枝叶中分离出脱氧
三尖杉酯碱（deoxyharringtonine）、异三尖杉酯
碱（isoharringtonine）、三尖杉酯碱(harring-
tonine)和高三尖杉酯碱（homoharringtonine）等
多种生物碱，并经动物肿瘤抑制试验及临床应
用，证实对各类白血病及恶性淋巴病有很好疗
效[3,4]。以后，海南粗榧资源破坏严重。由于该
树种生长缓慢，自然资源有限，很难满足日益增
长的临床需求。因此，对海南粗榧进行细胞培
养，让其产生有用的次级代谢产物，以解决其资
源保护和开发利用的矛盾很有必要。
用细胞培养生产药用成分的工业化研究始于上
世纪50年代，已有许多成功的先例 [5~8]。人们对
三尖杉科其他树种组织培养和生物碱分析曾有过报
道[9~12]。但尚未见到海南粗榧细胞培养的有关报
道。自1994年以来，我们开展了海南粗榧细胞培
养、快速繁殖和生物生态学的研究[14~16]，试图通
过海南粗榧的细胞培养提取有效抗癌次生代谢产
物。本文是这方面工作的继续。
材料与方法
海南粗榧（Cephalotaxus mannii）采自中国
热带农业科学院热带植物园。取其嫩树皮、茎、
叶为外植体。采用 MS 基本培养基，在不同培养
阶段添加 NAA（单位：mg.L-1，下同）、2,4-D、
6-BA 和 KT 等。固体培养基用 0.6% 卡拉胶固化，
3.0%蔗糖，pH 5.8。培养温度为(25± 3)℃。采
用固体和液体悬浮振荡两种培养方式。光培养以
日光灯为光源，连续照光 10～12 h.d-1，光照度
为1 000～1 500 lx；暗培养在暗中进行。外植体
在流水中冲洗后，放在新洁尔灭溶液中浸洗 1 0
min，以蒸馏水洗净；于无菌条件下用 70% 酒精
擦拭表面，再用 70% 酒精浸泡 1 min；最后在
0.1% 升汞中消毒，消毒时间分别为 10、12、15
和 20 min，用无菌水冲洗 3～4次后接种。培养
7 d后统计污染率和观察外植体长势。
诱导愈伤组织时，将外植体切成约1 cm的长
条小块和 1 cm × 1 cm 方块（树皮），接种于 12
种处理的诱导培养基中。接种时按树皮、茎、叶
3 种外植体类型分类接种，每处理接种 4 瓶，每
瓶接种外植体 3 块，共 12 块。培养 50～60 d 后
统计出愈块数，计算诱导率，同时观察愈伤组织
生长情况。
愈伤组织继代增殖培养时，以6-BA 0.1+NAA
海南粗榧愈伤组织的诱导和培养
符文英1 杜道林2,* 符木均1
1海南大学农学院, 海口 570228； 2海南师范学院生物系, 海口 571158
提要 海南粗榧的嫩茎和嫩叶以 0.1% 升汞消毒 12 min 的效果最好。外植体在 MS+0.1 mg.L-1 6-BA+1 mg.L-1 NAA+2
mg.L － 1 2,4-D+3.0% 蔗糖 +0.6% 卡拉胶(pH 5.8)培养基中能顺利诱导出愈伤组织。液体悬浮和暗培养均有利于愈伤组
织的增殖。愈伤组织增殖的最佳培养基为 MS+0.1 mg.L-1 KT +3 mg.L-1 NAA+3.0% 蔗糖(pH 5.8)。
关键词 海南粗榧; 愈伤组织; 诱导; 增殖; 组织培养
Callus Induction and Culture of Cephalotaxus mannii
FU Wen-Ying1, DU Dao-Lin2,*, FU Mu-Jun1
1College of Agronomy, Hainan University, Haikou 570228; 2Department of Biology, Hainan Normal College, Haikou 571158
Abstract The results showed that: (1)Young stem and young leaf of Cephalotaxus mannii were sterilized best
in 0.1% mercuric chloride for 12 min; (2)MS medium+0.1 mg.L-1 6-BA+1 mg.L-1 NAA+2 mg.L-1 2,4-D+3.0%
sucrose+0.6% carrageenan (pH 5.8) could induce calli from explants; (3)Liquid suspension and dark cultures
were advantageous to proliferation of callus; (4)MS medium +0.1 mg.L-1 KT+3 mg.L-1 NAA+3.0% sucrose
(pH 5.8) was optimum for proliferation of callus.
Key words Cephalotaxus mannii; callus; induction; proliferation; tissue culture
收稿 2003-02-12 修定 　2003-06-30
资助　 国家自然科学基金（39660018, 30260024）、海南省
重点扶持学科“生态学”、海南大学科研基金、海南
师范学院科研启动基金。
* 通讯作者（E-mail:ddl@hainnu.edu.cn, Tel:0898-
68374118）。
植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月 35
1+2,4-D 2培养基中诱导并继代3次的愈伤组织为材
料。将愈伤组织切成等体积小块，重约0.5 g，接
种于不同处理中，连同培养瓶称重。每处理接种
4瓶。培养45 d后称鲜重（此鲜重为45 d后培养
瓶总重量和刚接种后培养瓶总重量的差值）。继代
增殖培养试验有：（1）加入 NAA 和 2,4-D；（2）
固相和液相培养试验（液相培养为振荡培养,约140
r . m i n -1）；（3）光培养和暗培养试验。
观察愈伤组织生长动态时，用KT 0.1+NAA 3
培养基，接种 20 瓶，并在接种当天和培养后 5、
10、20、30、40、50、60 d 分别称取培养瓶
重量（W 0 和 W j ），并按愈伤组织平均增长数
（g）= （W j- W 0）/ 2 0 绘制生长曲线。
结果与讨论
1　外植体消毒时间的比较
海南粗榧为多年生乔木，材料带菌多，不易
彻底消毒；同时，此树种对消毒剂很敏感，极
易被杀伤变褐。表 1 的结果显示，外植体的污染
率以0.1%升汞处理10 min的为最高，12 min次
之，15 和 20 min 最低。但从外植体的表现情况
看，超过 15 min 则出现变褐死亡现象。这说明
消毒时间过长，不利于培养。故 0.1% 升汞的消
毒时间应控制在12～15 min 内。
2　海南粗榧愈伤组织的诱导
海南粗榧的树皮、茎段、叶片接种在 12 种
不同生长调节物质组合的培养基中。光培养 3 周
后，部分组合中外植体开始膨大，切口处先后长
出黄绿色愈伤组织。培养60 d 后的结果（表2）
表明：树皮在12种组合中都没能诱导成功；2,4-D
对愈伤组织的诱导有决定作用，凡没有添加2,4-D
的组合诱导率均为零。6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 2
可促进愈伤组织的诱导，叶的诱导率比茎段高。
3　愈伤组织的继代增殖培养
从表 3 和表 4 可见：
（1）5种处理间差异极显著。加2,4-D的海南
粗榧愈伤组织生长最好。但随着培养时间的延长，
愈伤组织有逐渐变褐、死亡的现象，且2,4-D浓度
越高，褐变现象出现得越早。加有 N A A 的愈伤
组织生长快， NAA在愈伤组织的增殖中比2,4-D
重要（表 3）。所有处理中以 KT 0.1+NAA 3 最
好，愈伤组织不仅生长快且色白、疏松；其他
处理的愈伤组织生长相对缓慢，并有逐渐变褐、
死亡的趋势。
（2）液体培养的愈伤组织增殖比固体培养
表1 海南粗榧外植体在1%升汞中消毒时间的效果比较
Table 1 Sterilizing time of explants of Cephalotaxus
mannii in 0.1% mercuric chloride
消毒时间/ 接种数/ 污染数/ 污染率/ 外植体
min 块 块 % 生长情况1)
10 16 7 44 正常
12 16 2 13 正常
15 16 1 6 部分褐死
20 16 1 6 严重褐死
1) 接种15 d后观察的结果，升汞浓度为0.1%，培养基
为 M S 培养基。
表2 不同生长调节物质组合对海南粗榧愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effects of different hormones on callus induction
树皮 茎 叶
生长调节物质浓度/
mg.L-1 外植体 成愈数 诱导率 外植体 成愈数 诱导率 外植体 成愈数 诱导率
数/块 /块 /% 数/块 /块 /% 数/块 /块 /%
6-BA 0.1+NAA 1 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.1+NAA 2 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.1+NAA 3 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.1+NAA 5 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.5+NAA 1 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.5+NAA 3 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.5+NAA 5 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 1+NAA 0.1 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 3+NAA 0.1 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 5+NAA 0.1 12 0 0 12 0 0 12 0 0
6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 1 12 0 0 12 11 91.7 12 12 100
6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 2 12 0 0 12 12 100 12 12 100
培养60 d后测定的结果。
植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月36
好；暗培养比光培养更适合愈伤组织增殖；液体
暗培养的愈伤组织生长最好。KT 0.1+NAA 3 组
合在任何培养条件下均优于其它组合（表 4 ）。
4　愈伤组织的生长动态
图1显示，培养前20 d，愈伤组织生长较慢；
20～45 d的生长速度明显加快；45～60 d的生长
速度变慢。因此，若要获得较高的愈伤组织生物
量，则以培养 40~45 d为宜。
根据本文结果，我们认为有几个问题须考
虑：（1 ）如何防止褐变。海南粗榧愈伤组织
在继代增殖过程中常出现褐变现象，尤其是培
养基中添加 2,4 - D 的，变褐较早且严重。（2）
培养基中 2,4-D 对次生代谢产物的药用安全性如
何。（3）前人[3,4]工作表明，海南粗榧不同部位
组织中的生物碱含量差异很大，以树皮含量最
高。本文以树皮作外植体，但由于树皮易于褐
死，诱导未能成功。如何解决这一问题，也应
深入研究。
参考文献
1 郑万钧, 傅立国. 中国植物志. 第七卷. 北京: 科学出版社, 1978.
432~434
2 陈毓亨, 黄 全.我国抗癌植物——三尖杉属的资源利用. 中草
药, 1977, (6):14~17
3 中国医学科学院药物研究所, 中国人民解放军第一八七医院.
海南粗榧抗肿瘤有效成分的研究. 化学学报, 1976, 34(4):
283~293
4 吴承卫. 三尖杉及其生物碱类成份的研究进展. 国外医学药学
分册, 1993, 20(3):321~325
5 郑光植. 植物细胞培养及其次级代谢. 昆明: 云南大学出版社，
1992. 10~35
6 何卓培. 植物组织培养生产有用化学物质的潜力与问题.植物
生理学通讯, 1983，(4):8~13
7 陈士云, 侯嵩生. 生产植物次生代谢物几项新技术研究进展.生
物工程进展, 1993, 14(2):43~45
8 侯嵩山. 植物细胞培养与有用化学物质生产的研究动态.武汉
植物学研究，1986, 4(4):411~419
9 惠月明, 胡月红, 吴跃平等. 三尖杉组织培养的初步研究. 中草
药, 1989, 20(1):31~33
10 胡之壁, 周秀佳, 郭济贤等. 三尖杉培养细胞中抗癌活性成分
的研究.植物学报, 1995, 37(6):417~424
11 Delfel NE, Rothfus JA. Antitumor alkaloids in callus cultures of
Cephalotaxus harringtonia. Phytochem, 1977, 10:1595~1598
12 Delfel NE. The effect of nutritional factors on alkaloid metabo-
lism in Cehalotaxus harringtomia tissue cultures, Planta. 1980,
39:168~170
13 符文英, 潘学锋, 陈秀蕙等. 海南粗榧杆插与生根试验研究.海
南大学学报,1997, 15(3):239~224
14 潘学锋, 符文英, 陈秀蕙等. 海南粗榧杆插繁殖研究.热带作物
研究,1996， (3):25~30
15 杜道林，苏 杰，付永川等. A study on the genetic diversity
of Cephalotaxus mannii, a rare and endangered plant. 植物学
报，2002，44(2):193~198
图1 海南粗榧愈伤组织生长进程
Fig. 1 Growth course of callus of Cephalotaxus mannii
表3 NAA和2,4-D对海南粗榧愈伤组织增殖的影响
Table 3 Effects of NAA and 2,4-D on callus proliferation
差异显著性
生长调节物质/mg.L-1 鲜重/g.瓶-1
0.05 0.01
KT 0.1+NAA 3 1.55 a A
6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 2 1.25 b B
KT 0.1+2,4-D 2 1.16 c C
6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 1 1.10 d D
KT 0.1+2,4-D 1 1.06 e E
F=33.6>F0.01=26.83
表4 培养方式对海南粗榧愈伤组织增殖的影响
Table 4 Calli proliferation with different culture methods

培养方式
鲜重/g.瓶-1
KT 0.1+NAA 3 6-BA 0.1+NAA 1+2,4-D 2 KT 0.1+2,4-D 2 6- BA 0.1+NAA 1+2,4-D 1 KT 0.1+2,4-D 1
固体培养 光培养 1.58 1.25 1.20 1.12 1.05
暗培养 1.64 1.31 1.23 1.16 1.07
液体培养 光培养 1.70 1.34 1.28 1.20 1.10
暗培养 1.74 1.37 1.32 1.24 1.16
培养45 d后测定。