全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月 1143
核桃胚培养快速成苗技术初探
张智英 1, 李保国 1,*, 顾玉红 2, 齐国辉 1, 郭素萍 1, 张旺林 3
河北农业大学 1林学院, 2生命科学学院, 河北保定 071000; 3沧州林业科学研究所, 河北沧州 061001
提要: 以核桃品种 ‘香玲 ’的成熟种胚为试材, 分别以带 2片子叶、带 1片子叶和不带子叶的胚接入MS培养基上的成苗情
况和比较HgCl2消毒 2 min、5 min、NaClO消毒 10 min 3种消毒的灭菌效果表明: HgCl2消毒 5 min的效果最佳, 1周后的材
料污染率仅为7%; 采用MS为基本培养基, 不附加任何生长调节物质, 以不带子叶的胚培养4周后即可成苗, 未经过煅炼的
苗直接移栽到装有蛭石的营养钵中, 其最终成活率可达84.6%。
关键词: ‘香玲 ’核桃; 快速成苗; 胚培养
Preliminary Study on Embryo Culture Technology for Rapid Seedling
of Walnut
ZHANG Zhi-Ying1, LI Bao-Guo1,*, GU Yu-Hong2, QI Guo-Hui1, GUO Su-Ping1, ZHANG Wang-Lin3
1College of Forestry, 2College of Life Sciences, Agricutural University of Hebei, Baoding, Hebei 071000, China; 3Forestry Science
Institute of Cangzhou, Cangzhou, Hebei 061001, China
Abstract: Mature embryos with two cotyledons, one cotyledon or no cotyledon of walnut cultivar ‘Xiang Ling’
were used as materials to be inoculated on MS medium substrate in this trial and the sterilization effects were
examined by 3 sterilization methods in which the materials were treated with HgCl2 for 2 min, 5 min or NaClO
for 10 min. The results showed that: the best sterilization method for materials was HgCl2 for 5 min, the
contamination rate was only 7% after materials inoculated into MS for one week; mature embryos with no
cotyledon seedlings after inoculated into MS without growth regulators for 4 weeks, and transplanted directly
into pots with vermiculite as a substrate, the survival rate was up to 84.6%.
Key words: ‘Xiang Ling’ walnut; rapid seedling; embryo culture312-7528735)¡£
收稿 2008-08-11 修定 2008-10-14
资助 河北省科技支撑计划(0 72 30 60 6D )。
* 通讯作者 ( E-m a i l : lb g 8 8 8 @1 6 3 . c om ; T el : 0 3 1 2 -
7 5 2 8 7 3 5 )。
核桃产量低而不稳、品质良莠不齐、经济效
益不高的主要原因之一是缺少优良品种。随着国
际上对核桃品质要求的不断提高, 急需培育优良品
种来提高我国核桃在国际市场上的竞争力。传统
的杂交育种试验在生产上存在杂交育种困难、获
得杂种苗年限长等问题, 胚培养是解决这个问题的
办法之一。‘ 香玲 ’ 核桃是山东省果树研究所从
‘新疆阿克苏 9号 ’和 ‘山东上宋 5号 ’核桃人工杂
交后代中选育而成, 该品种具有壳薄、优质、早
实和丰产的优良特性(杨继明等 2003)。本文以核
桃品种 ‘香玲 ’的成熟种胚为材料, 采用组织培养
技术, 对核桃种胚的消毒方法、接种方式进行了研
究, 筛选核桃快速成苗的技术, 以供短时间内获得
优良杂种单株及快速繁殖时参考。
材料与方法
试验材料为2007年8月20日采集的河北临城
绿岭公司基地生产的核桃(Juglans regia L.)品种
‘香玲’的成熟果实, 采后直接运至河北农业大学生
命科学学院发育生物学实验室。在室内去果皮、
风干后转入 4 ℃冰箱贮藏 30 d后用于试验。
先用洗洁净清洗核桃, 再用自来水冲洗干净, 移
至超净工作台, 用镊子去掉核桃硬壳, 放入大烧杯
中, 分别用 0.1%的HgCl2消毒 2 min、5 min或者
50%的NaClO消毒 10 min, 用无菌水冲洗 4次, 再
用75%的酒精消毒2 min, 用无菌水冲洗3次, 置于
干净容器中备用。每处理接种 30个, 1周后调查
材料污染率。以不灭菌为对照。污染率(%)=(污
染种胚数 /接种总胚数)×100%。
将消毒完毕的核桃种胚, 置于无菌滤纸上, 分
别以带 2片子叶的胚、带 1片子叶的胚、去掉子
叶的胚接入培养基。每处理接种 30个, 每瓶接种
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1个核桃种胚。在接种后每周调查1次种胚的生长
情况, 共调查 4次, 筛选核桃种胚的最佳接种方法。
以上试验均采用MS基本培养基, 附加 2%蔗
糖和 0.55%琼脂, 不附加任何植物生长调节物质,
pH 5.8, 培养室温度为(25±1) ℃。接种后暗培养 1
周后转入光照培养(光照时间为 16 h·d-1, 光照强度
为 40 µmol·m-2·s-1), 1周转接一次。
实验结果
1 不同消毒方法对核桃胚培养污染率的影响
从表 1可以看出, 接种 1周后, 0.1%的HgCl2
消毒 5 min的污染率最低, 不消毒的污染率最高。
0.1%的HgCl2消毒 5 min为最佳消毒方式。
2 带子叶数对核桃胚培养褐化的影响
带 1片子叶和带 2片子叶的种胚在接种当天,
种胚下部即发生褐化, 附近的培养基颜色变褐, 经
4次继代转瓶后, 种胚附近的培养基不再变褐, 但
种胚尤其是子叶由最初的土黄色逐渐变为深褐色,
且随着培养时间的延长褐化加重, 最终失去生命力,
导致培养失败。说明转瓶可减轻培养基的褐化, 但
不能减轻种胚的褐化。此外, 在培养基中添加
300~500 mg·L-1的聚乙烯基吡咯烷酮或 5~15 mg·L-1
的维生素 C均不能防止这种褐化。不带子叶的种
胚接种后, 种胚和培养基都不发生褐化。表明在控
制褐化上, 以不带子叶的种胚接种明显优于带 1片
子叶和带 2片子叶的接种方式。
3 带子叶数对核桃种胚萌发成苗的影响
由表 2可知, 带 2片子叶和带 1片子叶的种胚
多数不萌发, 两者萌发成苗缓慢且成苗率极低, 剥
去子叶观察发现少数种胚已经死亡, 这可能是由材
料褐化和子叶太大影响种胚吸收养分造成的。此
外, 从表 3可知, 大多数不带子叶的种胚在接种第
4天开始萌动、膨大、转绿, 1周后体积增大至接
种时的 2倍。接种第 2~3周是种胚生长最快的时
期, 上胚轴和胚根迅速伸长, 幼叶展开。接种 4周
后幼苗健壮, 复叶 3~4片, 小叶多达 20片且呈嫩绿
表 1 不同消毒方法对污染率的影响
Table 1 Effect of different methods on sterilization rate of
pollution
试剂及其浓度 消毒时间 接种数 染菌数 污染率
/% /min /个 /个 /%
不消毒(对照) 0 3 0 2 6 8 7
HgCl2 0.1 2 3 0 4 1 3
HgCl2 0.1 5 3 0 2 7
NaClO 50 1 0 3 0 1 7 5 7
表 2 叶片数对种胚接种后萌发情况的影响
Table 2 Effects of leaf number on the germination of embryos after inoculation
带子叶数 /片 接种数 /个 子叶转绿数 /个 子叶膨大数 /个 胚根突起伸长数 /个 子叶开裂数 /个
2 3 0 9 1 5 4 4
1 3 0 2 0 1 5 3 1
表 3 不带子叶的种胚接种后萌发成苗状态
Table 3 Germination of embryos without cotyledons after inoculated
接种后时间 /周 种胚萌发成苗状态
1 多数种胚膨大伸长或转绿, 有愈伤形成, 3%的种胚不萌发。
2 上胚轴迅速伸长, 胚根开始伸长生长, 幼叶呈卷曲状并开始展开。
3 小苗高约 3 cm, 主根伸长约 3.5 cm且呈乳白色, 叶片基本上完全展开。
4 幼苗高达 5 cm, 茎粗 3~4 mm, 主根长 2~5 cm, 多数生有侧根, 复叶 3~4片。
色, 多数种胚生有侧根(图1), 此时的幼苗已可移栽。
培养 4周后, 选择苗高 3 cm、生长健壮的生
根苗移栽到经高压灭菌的蛭石中, 2周后, 幼苗成
活率达 84.6%。总之, 无论是从褐化还是从萌发成
苗情况看, 都以不带子叶的种胚接种为最好的接种
方式。
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讨 论
有关核桃组织培养的研究报道很多, 刘淑兰和
韩碧文(1986)以及韩碧文(1986)曾先后从核桃的不
同组织外植体诱导出丛生芽, 但从种胚诱发的芽苗
不容易诱导生根、不能形成完整的植株。Driver和
Kuniyuki (1984)从实生苗的茎节处诱发出芽以及
Tulecke和Mcgromahan (1985)从子叶诱导出胚状
体和再生植株, 但成苗技术体系都比较繁琐, 不宜
采用。郭洪英等(1999)采用核桃成熟种胚的上胚
轴以上部分为试材诱导芽并增殖, 接种40 d后长出
丛芽原基, 而后形成小苗, 但此法成苗时间长、成
苗率低, 比以上两种核桃快繁技术系统效果好。本
文中用核桃完整种胚直接萌发成苗仅需四周的时
间, 采用不添加任何生长调节物质的MS培养基, 比
生产中正常育苗缩短一年时间, 大大缩短了育种周
期, 且成苗率高, 试验成本下降, 技术简单而快捷。
参考文献
郭洪英, 王永清, 李玉堂(1999). 核桃离体胚的培养. 四川林业科
技, 20 (4): 53~55
韩碧文( 1 9 8 6 ) . 木本植物组织培养. 北京: 高等教育出版社,
456~495
刘淑兰, 韩碧文(1986). 核桃(Juglans regia)的离体繁殖. 北京农
业大学学报, 12 (2): 143~148
杨继明, 赵维进, 杨秀勇, 高其富, 李际华(2003). 核桃优良品种——
香玲. 农业科技通讯, (4)
Driver JA, Kuniyki AH (1984). In vitro propagation of paradox
walnut rootstock. HortScience, 19: 507~509
Tulecke W, Mcgranahan G (1985). Somatic embryogenesis and
plant regeneration from cotyledons of walnut Juglans regia
L. Plant Sci, 40: 57~63
图 1 不带子叶的核桃种胚接种 4周后获得的植株
Fig.1 The plant of cotyledon embryo without cotyledons
after inoculated for 4 weeks