全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 713
LDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物过氧化物酶同工酶
王爽 陈卫良*
浙江大学生物技术研究所，杭州310029
Analysis of Plant Peroxidase Isoenzymes by LDS-polyacrylamide Gel Electro-
phoresis (LDS-PAGE)
WANG Shuang, CHEN Wei-Liang*
Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China
提要 以高粱和甘蓝型油菜叶片为材料，用十二烷基磺酸锂不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(LDS-PAGE)检测过氧化物酶同
工酶的结果表明，LDS-PAGE 的酶带条数比非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(native PAGE)明显增加，分辨率大大提
高，上样量少，胶片易保存；比复性电泳(G-PAGE)的步骤简单，电泳后无需除去 LDS 即可直接按常规活性染色方法染
色。
关键词 LDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(LDS-PAGE) ；过氧化物酶(POD) ；同工酶
收稿 2006-02-15 修定　 2006-06-02
*通讯作者(E-mail: chenwl@zju.edu.cn, Tel: 0571-86971184)。
过氧化物酶(peroxidase, POD)是一族能利用
H2O2 氧化供氢体的酶，由 1个糖蛋白和 1个氯正
铁血红素IX的铁卟啉辅基缀合而成(胡能书和万贤
国 1985)。它在高等植物中广泛而大量存在，是
植物中最重要的氧化还原酶类之一。它具有多种
同工酶，在植物不同的生长发育时期和不同的组
织器官中，POD 同工酶的数目和活性都有很大变
化，因此，研究 P O D 同工酶可以更好地用以了
解和调控植物生长发育过程。
目前，研究POD 同工酶通常用非变性不连续
聚丙烯酰胺凝胶电泳(native PAGE) (宋晓轩等
1995)，其特点是在电泳过程中可以保持酶的活
性，但这种电泳方法分辨率低，条带分离较模
糊。姬生栋等(2000)用Neuhaus-Steinmetz等(1994)
的复性电泳技术(sodium dodecyl sulfate-gelatin-poly-
acrylamide gel electrophoresis, G-PAGE)研究小麦
P O D 同工酶，此法在染色前需要复性即除去
SD S，染色较繁琐，实验操作技术要求也较高。
本文以高粱(Sorghum bicolor L.)和甘蓝型油菜
(Brassica napus L.)叶片为材料，采用变性作用比
SDS低的十二烷基磺酸锂(LDS)进行不连续聚丙烯
酰胺凝胶电泳(LDS-PAGE)分析 POD 同工酶并与
native PAGE进行比较，以期能找到一种更好、更
简便的检测植物 PO D 同工酶的方法。
材料与方法
1 实验材料
苗高3~5 cm的高粱(Sorghum bicolor L.)品种
‘辽杂10号’叶片和甘蓝型油菜(Brassica napus
L.)品种‘浙双 758’的叶片。
2 试验方法
2.1 样品的制备 称取高粱和油菜叶片各1.0 g，洗
净，用纱布吸干后，放入液氮中，在预冷的研
钵中加1 mL提取缓冲液(0.1 mol·L-1 Tris-HCl, pH
8.5)和0.1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)研磨，匀浆以
4 000×g 离心10 min，取上清液为粗酶液，分装
后贮存于 -70℃冰箱中备用。以上操作均在0~4℃
条件下进行。
2.2 蛋白质测定 参照Bradford (1976)检测法。
2.3 电泳
2.3.1 native PAGE 参照Bollag和Edelstein (1992)
的方法，用非变性不连续聚丙烯酰胺垂直平板电
泳，浓缩胶为 5%, 分离胶为 7.5%。样品蛋白在
上样缓冲液中的终浓度为1 mg·mL-1，每孔上样量
分别为 5、10 和 20 mL，在稳压 55 V、4℃条件
下电泳 6~7 h。
2.3.2 G-PAGE 参照Bollag和Edelstein (1992)的方
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法，略作改动：浓缩胶为 5%，分离胶为 9.5%，
样品缓冲液中不加巯基乙醇，不加热，12 000×g
离心 5 min 后，直接上样，每孔上样量 5 mL。
电泳完毕后，参照姬生栋等(2000)的方法进行复
性，即胶片用洗涤液(Triton X-100 2.4 mL、Tris-
base 0.6 g、双重蒸水100 mL, pH 7.0)洗涤30 min，
再用双重蒸水洗涤2~3次，每次10 min，以除去
S D S 。
2.3.3 LDS-PAGE 将 G-PAGE 中的 SDS 替换为
LDS，每孔上样量 3 mL。除无需复性步骤外其余
同2.3.2小节。
2.4 考马斯亮兰染色 参照Bollag和Edelstein (1992)
的方法。
2.5 同工酶染色 参照胡能书和万贤国(1985)的方
法，用醋酸联苯胺染色。
实验结果
1 POD 同工酶酶谱图
从native PAGE 的高粱 POD 同工酶谱可见，
上样量 5 和 10 mL 时，只有 1 条酶带；上样量增
加到20 mL 时，显示出 5 条酶带，有 2 条染色较
深，为主带，其余 3 条模糊(图 1)。G-PAGE 上
样量 5 mL 时，显示出 4 条较清晰的主带，另有
3条较浅的酶带(图 3)。而 LDS-PAGE上样量 3 mL
时，就显示出 8 条较清晰的酶带，比 G-PAGE 多
了 1条酶带(图 4)。native PAGE的油菜 POD同工
酶谱，上样量5 mL 的只有 1条染色很浅的酶带；
10 mL 的有 2 条酶带，染色均较浅；20 mL 的有
4条酶带，其中前3条为主带，最后 1条很浅(图
2)。G-PAGE 上样量 5 mL 的显示出 5 条较清晰的
酶带(图 3)。而 LDS-PAGE 上样量为 3 mL 的，除
显示出 5 条清晰的主带外，比 G-PAGE 多 2 条酶
带(图 4)。
从酶带数目上来说，无论高粱和油菜，LDS-
PAGE 均多于 native PAGE 和 G-PAGE。我们认为，
可能是后者的分辨率较低，以致有些同源性较高
的同工酶无法在凝胶中清晰地分开，因此酶带宽
而模糊；也有可能是 SDS 变性作用强于 LDS，即
使采用复性技术也不能完全恢复某些 POD 同工酶
的活性，从而导致凝胶上一些含量较低的酶带无
法显示出来。
此外，1 mg·mL-1 浓度的蛋白样品在LDS-PAGE
中只需3 mL上样量就可以得到更多、更清晰的酶
谱图，这极大地节省了样品用量，对于一些不容
易制备的样品来说，无疑是一个优点。
2 染色时间
由表1 可以看出，高粱和油菜的 POD 同工酶
的native PAGE在染色3 min开始有酶带出现，6
min 时所有酶带完全显出，以后酶带条数不再增
图1 高粱叶片POD同工酶native PAGE电泳图
　　a: 醋酸联苯胺染色; b: 考马斯亮蓝染色。1、2、3上样量
分别为 5、10、20 µL。
图2 油菜叶片POD同工酶native PAGE电泳图
　　a: 醋酸联苯胺染色; b: 考马斯亮蓝染色。1、2、3 上样
量分别为 5、10、20 µL。
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加。G-PAGE 和 LDS-PAGE 在染色 3 min 也开始
有酶带出现，但油菜所有酶带在10 min都完全显
现，而高粱的在随后 30 min 内，又会逐渐显出
新的酶带，以后酶带条数不再增加。
实验中还看到，native PAGE显色 6 min后，
若继续染色至30 min，则随着时间的延长，酶带
迅速扩散，颜色也将逐渐变浅，由蓝色变为浅棕
色，甚至有的原本着色浅的酶带会消失，而且胶
在去离子水中不能保存，否则酶带将逐渐褪去；
所以应在 6 min 显色完全时立即拍照，并制成干
板保存。而 G-PAGE 与 LDS-PAGE 则没有这些现
象，且酶带始终为蓝色；若用去离子水浸泡 1~2
d 后酶带会更加清晰，并且可以长时间保存在去
离子水中。
讨　　论
分离和鉴定蛋白质的电泳技术有多种， SDS-
PAG E 是一种变性条件下的凝胶电泳，其中 SDS
能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去
折叠，破坏蛋白质的分子二级和三级结构。如果
再加入如巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT)等强还原
剂，则半胱氨酸残基间的二硫键即断裂，蛋白质
完全解聚成各亚基，根据亚基分子质量的大小，
多肽链在凝胶中即可分离。因此 SDS-PAGE 对样
品已经造成变性，蛋白失活或其活性大大降低。
实验证明，如果电泳后除去所有与蛋白质分子结
表1 染色时间对POD同工酶酶带的影响
native PAGE 酶带条数 G-PAGE 酶带条数 LDS-PAGE 酶带条数
染色时间
高粱 油菜 高粱 油菜 高粱 油菜
3 min 3 3 3 4 3 5
6 min 5 4 4 5 4 5
10 min 5 4 5 5 5 7
15 min 5 4 6 5 5 7
30 min 5 4 7 5 8 7
24 h 2 (条带淡) 2 (条带淡) 7 5 8 7
　　native PAGE 上样量为 20 µL，G-PAGE 上样量为 5 µL，LDS-PAGE 上样量为 3 µL。
图3 高粱和油菜叶片 POD 同工酶 G-PAGE 图
　　a: 高粱叶片; b: 油菜叶片。1: 醋酸联苯胺染色; 2: 考马斯亮
蓝染色。上样量均为 5 µL。
图4 高粱和油菜叶片 POD 同工酶 LDS-PAGE 图
　　a: 高粱叶片; b: 油菜叶片。1: 醋酸联苯胺染色; 2: 考马斯亮
蓝染色。上样量均为 3 µL。
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合与否的 S D S ，则一些失活的蛋白即可恢复活
性，但这种恢复活性往往受多种因素影响(Hager
和Burgess 1980；Manrow和Dottin 1982；Dottin
等 1979)，因此常常不能复性。G-PAGE 就是在
此基础上建立起来的一种电泳后蛋白或酶可以恢复
活性的复性电泳技术，但它也有其局限性，如
Dutta和Henry (1990)报道G-PAGE容易导致血红素
蛋白中血红素丢失，而丢失血红素的蛋白质分子
在随后的复性过程中也无法恢复活性。此外，只
有单体蛋白和有相同亚基组成的蛋白才可用这种技
术，而且方法相对较繁琐，实验中的技术要求也
较 高 。
native PAGE不像 G-PAGE那样易使蛋白质变
性，因此又称天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝
胶电泳。它能保持蛋白质的天然构象、亚基间的
相互作用及其生物活性(Gabriel和Gersten 1992)，
所以可用于分离欲保持天然蛋白质活性的物质如
酶、激素、抗原等，但其分辨率远不如 G -
P A G E，酶带宽而模糊，因而在分离同源性较高
的同工酶中显得无能为力。
L D S 的变性作用比 S D S 低，有些研究者
(Vargas等1993；Sinclair等1981；Kim等 1996；
Zelck等1995)将LDS-PAGE用于分离动物或细菌血
红素蛋白中，都取得较好的结果，但在植物 POD
同工酶酶谱研究中的应用未见报道。本文用LDS-
PAGE 电泳技术对高粱和油菜叶片中的 POD 同工
酶进行分析的结果表明，LDS-PAGE 比 G-PAGE
可更好地保证 P O D 同工酶的活性，无需复性步
骤；且分辨率高，native PAGE 下不能分离的同
工酶用此技术可以得到分离。此法对分析研究其
它酶和同工酶酶谱也可能有参考价值，不过其中
的具体操作技术还待进一步研究。
参考文献
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