全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月708
与拟南芥抗寒性相关的CBF3和 AtGolS3基因克隆及其表达载体的构建
钟克亚 叶妙水 胡新文 符少萍 郭建春*
中国热带农业科学院热带生物技术研究所热带作物生物技术国家重点实验室， 海口 571101
Cloning and Construction of Expression Vector of CBF3 and AtGolS3 Genes
Related to Cold Tolerance of Arabidopsis thalina
ZHONG Ke-Ya, YE Miao-Shui, HU Xin-Wen, FU Shao-Ping, GUO Jian-Chun*
State Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy
of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
提要 用 RT-PCR 技术从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆到抗寒相关基因 CBF3、AtGolS3, 序列分析后用 BLAST 软件
作同源序列分析的结果显示，它们的核苷酸序列与 GenBank 中登录的拟南芥 CBF3 (AF074602)、AtGolS3 (AB062850)核
苷酸序列完全相同。CBF3 和AtGolS3基因分别与植物表达载体pVKH相连构建pVKH-35S-CBF3-pA、pVKH-35S-AtGolS3-
pA 以及通过中间载体 pRT101，将 AtGolS3 连接到 pVKH-35S-CBF3-pA 上，成为各自带有 35S 启动子及 PolyA 终止子的
双价植物表达载体 pVKH-35S-CBF3-pA-35S-AtGolS3-pA。
关键词 CBF3 基因；AtGolS3 基因；pVKH 植物表达载体；双价表达载体
收稿 2005-12-23 修定 　2006-05-12
资助 教育部重点项目(204158)、海南省自然科学基金(30406)
和中国热带农业科学院自然科学基金(Rky0526)。
*通讯作者(E-mail: jianchunguoh@163.com, Tel: 0898-
66890635)。
植物抗寒性受多基因控制，冷诱导基因表达
的产物可以分为 2 类：一类是调控性蛋白，调控
寒冷信号转导、抗寒基因表达和抗寒蛋白活性；
另一类是与植物抗寒性的提高直接相关的功能性蛋
白(Guy等1985)。拟南芥基因CBF3 (c-repeat bind-
ing factor 3)、AtGolS3 (Arabidopsis thaliana
galactinol synthase 3)分别属于这2种类型。
CBF3 是 CBF 基因家族中的一员，定位在拟
南芥 4 号染色体的短臂上，约含 800 个核苷酸，
其基因阅读框架中不含有内含子( M e d i n a 等
1999)，其在植物抗寒中作用机制为CBF3 蛋白中
含有AP2结构域，可与COR (cold-regulated)基因
启动子中的 CRT/DRE 结合而激活 COR15a 基因表
达(Medina 等 1999；Liu 等 1998)。COR15a 是拟
南芥叶绿体中的低温保护蛋白(Artus 等 1996)。
Gilmour等(2000)报道，拟南芥中CBF3基因的过
量表达，不仅能提高 COR15a 蛋白的含量，而且
脯氨酸和可溶性糖的含量也大大提高，而这两者
普遍认为是与提高植物抗寒性有关的(Gilmour等
2000)。可溶性棉子糖(raffnose)在植物抗寒及抗旱
中起一定的作用。
肌醇半乳糖苷酶(GolS)是催化尿苷二磷酸
(UDP)- 半乳糖生化合成棉子糖家族反应的第一
步。AtGolS3 是受冷压迫诱导的，其启动子中含
有 2 个 CRT/DRE 中心基序和 2 个类似的 CRT/DRE
基序，C B F 3 结合到这些基序上后即可诱导
AtGolS3表达，增加植物的抗寒性(Taji等2002)。
我们根据已经报道的拟南芥 CBF3 (AF074602)、
AtGolS3 (AB062850)基因序列设计引物，采用RT-
PCR 的方法从拟南芥中克隆 CBF3、AtGolS3 基
因，而后将这2个基因单独和串联起来构建植物表
达载体。
材料与方法
1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)人工栽培。
质粒 pV K H - 3 5 S - G U S - p A 其特性为 Ka n R
HygromycinR 35S pA；pRT101的特性为AmpR 35S
pA；pGEM-T Easy Vector 的特性为AmpR lacZ。
转化受体菌DH5a为我院生物技术国家重点实验室
保存。Taq DNA 聚合酶为北京华美生物公司产
品。各种限制性内切酶及Klenow酶为大连宝生物
公司产品。Trizol试剂盒为上海生工生物工程技术
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 709
有限公司产品。
2 方法
2.1 拟南芥总RNA提取 取无菌培养的拟南芥幼苗
加液氮磨成粉后，用Trizol试剂盒提取拟南芥总
RNA (其中 CBF3 基因不含内含子，可以通过提取
拟南芥总 DNA 来作模板；本文中的 CBF3 可以和
AtGolS3基因同时用 RT-PCR产物为模板，所以不
再提取拟南芥总 DNA)。
2.2 RT-PCR 反应引物设计 引物 1 (CB-3): 5
GTCGGATCCAGTTACCTTATCCAGT 3; 引物 2
(CB-4): 5 GCGAAGCTTTAATAACTCCATAACG 3;
引物 3 (AT-1): 5 GCGAATTCATGGCACCTGAGATG
3; 引物 4 (AT-2): 5 TAGTCGACTCTAAGCCGC-
GGATG 3; 引物 5 (AT-3): 5 TAAGGATCCGAT-
GGCACCTGAGATG 3; 引物 6 (AT-4): 5 ATAAG-
CTTTCTAAGCCGCGGATGG 3。
其中引物1、2根据Gilmour等(2000)报道的
拟南芥CBF3基因(GenBank AF074602)序列设计，
扩增CBF3 基因编码区序列，总长约 750 bp。其
中画线部位为添加于引物上的BamHI和HindIII酶
切位点。引物3~6根据Taji等(2002)报道的拟南芥
AtGolS3基因(GenBank AB062850)序列设计，扩增
AtGolS3 基因的编码序列，总长约 1 050 bp，其
中划线部位为添加于引物上的 E c o R I、S a l I、
BamHI和HindIII酶切位点。引物由大连宝生物公
司合成。RT-PCR 扩增根据TaKaRa RNA PCR kit
(AMA) Ver 3.0上的说明进行。
2.3 基因序列分析 由上海联合基因有限公司测定。
实验结果
1 CBF3和AtGolS3基因的克隆与序列鉴定
1.1 CBF3和AtGolS3基因的克隆 以拟南芥总RNA
为模板进行 RT-PCR 反应，扩增出长度分别约为
750和 1 050 bp的 DNA片段， 凝胶电泳回收DNA，
分别与pGEM-T Easy Vector连接，转化大肠杆菌
DH5a，挑取蓝色菌斑，筛选阳性克隆，提取质
粒后进行EcoRI+SalI双酶切鉴定(图1、2)。由图
1、2可以看出，T载体上所插入的片段大小与RT-
PCR 产物相同，这证明 RT-PCR 目的片段已克隆
到 T 载体上。连有 CBF3、AtGolS3 基因的载体
分别命名为 T-CBF3 质粒、T-AtGolS3 质粒。
1.2 序列分析 T-CBF3质粒和T-AtGolS3质粒由上
海联合基因有限公司测序， 所测序列在GenBank中
采用BLAST 程序进行序列同源性分析的结果表明，
该序列与GenBank 中报道的CBF3、AtGolS3 基因
序列同源性为 100%。DN A 序列测定结果如下。
CBF3 基因序列:
GTCGGATCCAGTTACCTTATCCAGTTTCTTGAAACA
GAGTACTCTTCTGATCAATGAACTCATTTTCTGCTT
TTTCTGAAATGTTTGGCTCCGATTACGAGTCTTCGG
TTTCCTCAGGCGGTGATTATATTCCGACGCTTGCGA
GCAGCTGCCCCAAGAAACCGGCGGGTCGTAAGAAG
TTTCGTGAGACTCGTCACCCAATATACAGAGGAG
TTCGTCGGAGAAACTCCGGTAAGTGGGTTTGTGAGG
TTAGAGAACCAAACAAGAAAACAAGGATTTGGC
TCGGAACATTTCAAACCGCTGAGATGGCAGCTCGA
GCTCACGACGTTGCCGCTTTAGCCCTTCGTGGCCGA
TCAGCCTGTCTCAATTTCGCTGACTCGGCTTGGAGA
CTCCGAATCCCGGAATCAACTTGCGCTAAGGACA
TCCAAAAGGCGGCGGCTGAAGCTGCGTTGGCGT
TTCAGGATGAGATGTGTGATGCGACGACGGATCA
TGGCTTCGACATGGAGGAGACGTTGGTGGAGGCTA
TTTACACGGCGGAACAGAGCGAAAATGCGTTTTATA
TGCACGATGAGGCGATGTTTGAGATGCCGAGTTTG
TTGGCTAATATGGCAGAAGGGATGCTTTTGCCGCTT
图1 T-CBF3质粒 PCR和酶切检测
从左到右依次为 P C R 、酶切、D N A 分子量标记。
图2 T-AtGolS3质粒PCR和酶切检测
从左到右依次为 D N A 分子量标记、酶切、P C R 。
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月710
CCGTCCGTACAGTGGAATCATAATCATGAAGTCGA
CGGCGATGATGACGACGTATCGTTATGGAGTTA
TTAAAA
AtGolS3基因序列:
TAAGGATCCGATGGCACCTGAGATGAACAACAAGT
TGAGCTACGGAGAAAAGAAGAGAGCGTACGTTACG
TTCCTCGCCGGAACCGGAGACTACGTGAAAGGA
GTGGTTGGTCTGGCTAAAGGGCTAAGGAAAAC
TAAAAGCAAGTACCCATTAGTGGTTGCTGTGTTA
CCTGACGTGCCGGCCGATCACCGGAGACAGCT
ATTGGACCAAGGCTGCGTCATCAAGGAGATTCA
GCCGGTTTACCCACCGGATAACCAAACTCAGTTT
GCTATGGCTTACTACGTCCTCAACTACTCTAAAC
TTCGTATTTGGAAGTTTGTAGAGTACAGCAAGCTGA
TATACTTAGACGGAGACATACAAGTGTTTGAGAACA
TAGATCACTTGTTTGATCTTCCTGACGGCAACTT
CTACGCCGTTAAAGACTGTTTCTGCGAGAAGACTTGGAG
CCACACGCCTCAGTACAAGATTGGCTACTGCCAA
CAGTGTCCGGACAAGGTGACGTGGCCTGAGTCA
GAGCTTGGTCCTAAGCCACCGTTGTACTTCAACG
CCGGCATGTTCGTCTACGAGCCAAGCCTCCCCACTTA
TTACAACCTTTTGGAGACACTCAAAGTTGTCCCT
CCCACACCTTTTGCTGAACAGGATTTCTTGAACATG
TACTTCAAAGACATATACAAGCCTATTCCACCAG
TTTACAATCTTGTCTTGGCCATGCTCTGGAGGCA
TCCAGAGAACATAGAGCTTAACGAAGCTAAGGTTG
TTCATTACTGTGCAGCCGGTGCTAAGCCTTGGAGG
TTCACAGGCCAAGAAGGAAATATGGAGAGGGAA
GACATCAAGATGCTTGTAGAGAAATGGTGGGACA
TTTACAACGACGAGTCTCTTGACTACAAAAACTTT
AATGTGCATTGCGGACAAAAAGAAGATGTTCACA
GGAAACCGAAAACCCTTCCACAGTTCTTTACAGA
TTTGTCTGAAGCTGATGTGCTTCAATGTGCCAAA
GCTCCATCCGCGGCTTAG
划线部分为引物，字母带阴影部分为起始密
码子和终止密码子。
2 CBF3和AtGolS3基因植物表达载体和双价植物
表达载体构建
2.1 CBF3和AtGolS3基因植物表达载体构建 以
T-CBF3质粒、T-AtGolS3质粒为模板，分别以CB-
3、CB-4、At-3 和 At-4 为引物，进行 PCR 扩增，
得到目的条带的大小分别为750和1 050 bp左右的
条带，凝胶电泳后回收。用限制性内切酶 BamHI
和 HindIII 双酶切回收产物CBF3、AtGolS3 及质
粒 pVKH-35S-GUS-pA，凝胶电泳后回收，T4 连
接酶连接，得到表达载体 pVKH-35S-CBF3-pA、
pVKH-35S-AtGolS3-pA (图 3、4)。
2.2 pVKH-35S-CBF3-pA 和 pVKH-35S-AtGolS3-
pA植物表达载体的物理学鉴定 以引物CB-3、CB-
4、At-3 和 At-4 对质粒 pVKH-35S-CBF3-pA、
pVKH-35S-AtGolS3-pA 分别进行PCR 反应，扩增
片段大小分别为750和 1 050 bp左右。用限制性
内切酶 BamHI 和 HindIII 对这 2个质粒进行双酶
切，酶切后得到的片段分子量约为750和1 050 bp。
这2个载体的酶切结果和PCR结果都和理论计算的
一致，说明构建的是正确表达载体(图 5、6)。
图3 pVKH-35S-CBF3 -pA植物表达载体构建
图4 pVKH-35S-AtGolS3-pA植物表达载体构建
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 711
2.3 pVKH-35S-CBF3-pA-35S-AtGolS3-pA双价植
物表达载体构建 以 T-AtGolS3 质粒为摸板，以
At-1、At-2 为引物，进行 PCR 扩增，得到的目
的片段用SalI 进行酶切，酶切后用 Kleonw 酶补
平，形成平末端。另一端用 EcoRI 酶切。同时，
pRT101质粒用EcoRI和SamI (形成平末端)进行双
酶切。回收后用 T 4 连接酶连接，得到载体
pRT101-AtGolS3。用HindIII酶切载体pVKH-35S-
CBF3-pA 和 pRT101-AtGolS3，回收片段后连接，
用 Bam H I 检测方向性，得到双价植物表达载体
pVKH-35S-CBF3-pA-35S-AtGolS3-pA (图 7)。
2.4 pVKH-35S-CBF3-pA-35S-AtGolS3-pA双价植
物表达载体的物理学鉴定 以引物CB-3、CB-4、At-
3、At-4对质粒pVKH-3SS-CBF3-pA-35S-AtGolS3-
pA进行 PCR，扩增得到的片段大小分别为750 和
1 050 bp，用HindIII酶切，得到一条约1 700 bp
图 5 pVKH-35S-CBF3-pA 质粒 PCR 和酶切检测
从左到右依次为 D N A 分子量标记、P C R 、酶切。
图6 pVKH-35S-AtGolS3-pA质粒 PCR和酶切检测
从左到右依次为 D N A 分子量标记、酶切、P C R 。
图7 pVKH-35S-CBF3-pA-35S-AtGolS3-pA双价植物表达载体构建
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月712
的片段，用 Bam H I 检测方向性，得到的片段大
小约为2 200 bp，证明插入方向为35S-CBF3-pA-
35S-AtGolS3-pA，所以 pVKH-35S-CBF3-pA-35S-
AtGolS3-pA双价植物表达载体构建成功(图8)。
图8 pVKH-35S-CBF3-pA-35S-AtGolS3-pA
质粒 PCR 和酶切检测
从左到右依次为 CBF3 PCR、AtGolS3 PCR、HindIII 酶
切、B a m H I 酶切、D N A 分子量标记。
体、AtGolS3 单价基因载体和两者串联的双价基
因表达载体，可能有助于从单个基因转入与双价
基因转入的植株抗寒性差异区分的研究。
参考文献
Artus NN, Uemura M, Steponkus PL, Gilmour SJ, Lin C, Thoma-
show MF (1996). Constitutive expression of the cold-regu-
lated Arabidopsis thaliana COR15a gene affects both chlo-
roplast and protoplast freezing tolerance. Proc Natl Acad Sci
USA, 93: 13404~13409
Gilmour SJ, Sebolt AM, Salazar MP, Everard JD, Thomashow MF
(2000). Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcrip-
tional activator mimics multiple biochemical changes asso-
ciated with cold acclimation. Plant Physiol, 124: 1854~1865
Guy CL, Niemi KJ, Brambl R (1985). Altered gene expression
during cold acclimation of spinach. Proc Natl Acad Sci USA,
82: 3673~3677
Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki
K, Shinozaki K (1998). Two transcription factors: DREB1
and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain, sepa-
rate two cellular signal transduction pathways in drought-
and low temperature-responsive gene expression,
respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 10: 1391~1406
Medina J, Bargues M, Terol J, Pèrez-Alonso M, Salinas J (1999).
The Arabidopsis CBF gene family is composed of three genes
encoding AP2 domain-containing proteins whose expres-
sion is regulated by low temperature but not by abscisic acid
or dehydration. Plant Physiol, 119: 463~470
Taji T, Ohsumi C, Hchi S, Oeki M, Kasuga M, Kobayashi M,
Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2002). Important roles
of drought- and cold-inducible genes for galactinol synthase
in stress tolerance in Arabidopsis thaliana. Plant J, 29 (4):
417~426
Zhu B, Chen THH, Li PH (1996). Analysis of late-blight disease
resistance and freezing tolerance in transgenic potato plant
expressing sense and antisense genes for an osmotin-like
protein. Planta, 198 (1): 70~77
讨 论
以转基因技术改良植物抗寒性的早期研究一
般侧重于导入抗寒功能基因，这些功能基因的导
入在一定程度上可以改善植物对低温的耐受性(Zhu
等1996)，但是植物的抗寒性受多种数量性状基因
的调控，希望导入一二个功能基因就能迅速提高
植物的抗寒性是困难的，其表达调控的机制还需
待进一步研究。目前抗寒基因工程的研究更多是
从与抗寒相关的调控基因(如 CB F 基因家族)入
手。本文所构建的 3 个载体：CBF 3 单价基因载