全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月 1075
AtRGS1-GFP融合蛋白对AtRGS1细胞定位的研究
季芳芳 1,2,*, 陈云 1, 吴晓霞 1, 梁建生 1, 顾闽峰 3
1扬州大学生物科学与技术学院, 扬州 225009; 2盐城师范学院科技处, 江苏盐城 224002; 3江苏沿海地区农业科学研究所, 江
苏盐城 224002
提要: 应用Gateway克隆技术构建了以CaMV 35S为启动子, 含AtRGS1-GFP融合基因的植物表达载体, 并分别用根癌农杆
菌介导法和PEG介导法转化拟南芥野生型(Col)悬浮细胞系和幼苗叶片原生质体, 利用荧光显微镜观察AtRGS1-GFP融合
基因在转化受体系统中的表达与定位。结果显示, 在含AtRGS1-GFP融合基因的转化细胞系中, GFP绿色荧光在细胞膜(壁)
上特异表达; 原生质体瞬时表达系统中, GFP绿色荧光在细胞膜上强烈表达, 表明AtRGS1蛋白定位于细胞质膜上。
关键词: AtRGS1; GFP; 融合蛋白; 细胞定位; 拟南芥
Study of AtRGS1 Protein in Cellular Localization Using AtRGS1-GFP Fusing
Protein
JI Fang-Fang1,2,*, CHEN Yun1, WU Xiao-Xia1, LIANG Jian-Sheng1, GU Min-Feng3
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2Science and Technology Office, Yancheng
Teachers College, Yancheng, Jiangsu 224002, China; 3Institute of Agricultural Sciences in the Coastal Area in Jiangsu, Yancheng,
Jiangsu 224002, China
Abstract: The recombination of plant expression vectors which express AtRGS1-GFP driven by CaMV 35S
promoter were constructed using Gateway cloning technology. The vectors were introduced into cell suspen-
sion cultures by Agrobacterium-mediated transformation and into leaf protoplast by the polyethylene glycol
(PEG)-mediated DNA uptake in Arabidopsis thaliana. The expression and localization of AtRGS1-GFP in trans-
fected systems were studied by the fluorescence microscope. The results showed that the green fluorescence
of GFP accumulated specifically in cell plasma membrane (wall) in cell suspension cultures which transformed
with AtRGS1-GFP, and the green fluorescence of GFP accumulated intensively in plasma membrane in proto-
plast transient expression system, which suggesting that AtRGS1 was localized in plasma membrane.
Key words: AtRGS1; GFP; fusion protein; cellular localization; Arabidopsis thaliana
收稿 2008-05-23 修定 2008-10-29
资助 国家自然科学基金(30370731)和江苏省高校自然科学研
究项目(04KJB180157)。
* E -m a i l : y c j i f f@ 1 6 3 . c o m ; T e l : 0 5 1 5 -88258236
拟南芥 RGS蛋白(AtRGS1)是 Chen等于 2003
年发现的第一个植物G蛋白信号转导调节蛋白, 其
N末端具有独特的类似于G蛋白耦联受体(G pro-
tein-coupled receptors, GPCRs)的 7次跨膜(7TM)结
构, C末端具有保守的 RGS结构域, 该结构域执行
GTP酶活化蛋白(GTPase activating proteins, GAPs)
功能, 能够显著促进Gα亚基自身GTP水解酶活性,
加速活化态Gα回到非活化状态, 从而终止或抑制
植物 G蛋白信号转导过程(Chen等 2003)。由于
AtRGS1在细胞分裂、糖信号转导等过程中具有调
控作用(Chen等 2003; Chen和 Jones 2004; Chen等
2006a, b; Johnston等 2007; Willard和 Siderovski
2004), 所以近年来, 其功能研究日益受到人们的关
注。
此外, 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,
GFP)融合蛋白表达技术已广泛应用于活细胞或生
物体内基因表达和蛋白质定位的研究(Chalfie等
1994)。GFP作为一种标记物, 与其他蛋白质标记
物相比, 一个突出的优点在于其与靶蛋白耦合形成
的融合蛋白既有荧光又有靶蛋白原有的正常功能和
定位特征(Chalfie等 1994; Davis和Vierstra 1998;
Stewart 2001)。本文通过采用Gateway克隆技术,
将已获得的拟南芥AtRGS1与GFP基因融合, 利用
GFP的示踪作用, 研究AtRGS1-GFP基因在拟南芥
野生型(Columbia, Col)悬浮细胞系和幼苗叶原生质
体体系中的表达, 分析AtRGS1蛋白在细胞中的定
位情况, 为进一步研究拟南芥AtRGS1在植物生长
发育过程中的调节机制建立基础。
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材料与方法
拟南芥野生型(Arabidopsis thaliana, Columbia,
Col)种子由我校植物生长发育与蛋白质组学研究实
验室提供。以无菌苗叶片为材料, 参照 Chen等
(2006a)的方法建立拟南芥悬浮细胞系。AtRGS1
全长cDNA由本实验室制备并保存(Chen等2006a, b)。
植物表达载体 pK7FWG2 (Kanr、Spr)由美国
北卡罗莱那大学Alan Jones教授惠赠。该质粒含
CaMV 35S启动子、Gateway box (attR1-CmR-
ccdB-attR2, Gateway克隆所特有)的基因组合片段
及增强型GFP基因(EGFP), Gateway box与GFP
的 N 端相连。
AtRGS1-GFP融合基因植物表达载体构建时,
根据AtRGS1的 ORF (At3g26090) 与 GatewayTM
TOPO cloning要求设计引物, 引物序列为: 引物 1,
5 att att atc gat atg gcg agt gga tgt gct 3 ; 引物 2, 5
att agt cga cat acc ggg act act gca tct 3 。PCR反应
条件为：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min, 58 ℃ 1 min, 72
℃ 1 min, 40个循环; 72 ℃延伸 10 min。按照
GatewayTM TOPO Cloning操作手册, 将AtRGS1基
因片段经TOPO克隆导入载体pENTR/D-TOPO, 选
取阳性菌落提取质粒DNA, 再经LR重组反应亚克
隆到 pK7FWG2 (pENTRTM/D-TOPO、GatewayTM
TOPO Clone试剂盒及LR Clonase均购自Invitrogen
公司 )。
根癌农杆菌浸染悬浮细胞系及Western blotting
鉴定时, 采用 Bechtold和 Pelletier (1998)冻融法将
重组质粒 pK7FWG2转化农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens) GV3101 (Rifr、Gentr)感受态, 设
pK7FWG2 (只含GFP)转化农杆菌作对照; 再按照
Kościańska和Wypijewski (2001)方法将重组农杆菌
浸染悬浮细胞系, 48 h后, 荧光显微镜(Olympus BX
51TRF)观察GFP表达情况; 7 d后, 收集并提取重
组农杆菌转化系(含 AtRGS1-GFP融合基因)、对
照(只含GFP基因)和空白对照(正常悬浮细胞系)的
细胞总蛋白。10% SDS-PAGE电泳分离, 然后转
膜(NC, Amersham公司)、漂洗、封闭, 一抗GFP
抗体(Santa cruz 公司)孵育、洗膜、显色。
拟南芥原生质体制备及瞬时表达: 以三周龄无
菌苗叶片为材料, 参照Abel和 Theologis (1994)方
法制备原生质体(cellulase R-10和macerozyme R-
10购自日本Yakult Honsha公司); PEG4000 (Fluka
公司)将重组质粒pK7FWG2导入原生质体, 16 h后
荧光显微镜观察 GFP瞬时表达。
实验结果
1 AtRGS1基因的克隆与AtRGS1::GFP融合质粒
的构建
利用Gateway克隆技术, 将目的基因 AtRGS1
替换植物表达载体 pK7FWG2中的Gateway box基
因组合片段, PCR鉴定, 选取 LR重组反应后的阳
性菌落送上海生工公司测序。结果显示, 全序列长
为 1 380 bp, 包含了全部的编码区序列, 与预期的
相符; 将测得的AtRGS1序列与已公开的AtRGS1蛋
白编码基因序列(At3g26090)比较, 同源性为100%,
无碱基差异。新构建的 AtRGS1-GFP融合基因植
物表达载体命名为AtRGS1::GFP融合质粒, 其中
AtRGS1与GFP蛋白的N端相连, AtRGS1::GFP融合
质粒及 pK7FWG2质粒的T-DNA区域如图 1所示。
2 AtRGS1::GFP融合质粒转化拟南芥悬浮细胞和
原生质体
通过冻融法将AtRGS::GFP融合质粒导入农杆
图 1 pK7FWG2质粒(a)和AtRGS1::GFP融合质粒(b)的 T-DNA区域
Fig.1 T-DNA region of vector pK7FWG2 (a) and fusion vector AtRGS1::GFP (b)
P35S: CaMV 35S启动子; Gateway box: Gateway克隆特有基因组合片段; EGFP: 增强型GFP基因编码序列; T35S: CaMV 35S终
止子; Pnos: nos启动子; NPT II: 卡那霉素抗性基因编码序列; Tnos: nos终止子; RB: T-DNA右边界; LB: T-DNA左边界。
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菌GV3101, 挑取菌落进行 AtRGS1特异性引物的
PCR鉴定, 再选取PCR扩增特异性条带较亮的阳性
克隆, 转化构建好的拟南芥野生型Col悬浮细胞系;
利用PEG介导法将AtRGS::GFP融合质粒转化现用
现制的拟南芥幼苗叶片原生质体。
3 AtRGS1蛋白的细胞定位
通过上述获得的转化细胞培养 48 h后, 取适
量样品用细胞悬浮培养基稀释后, 直接用荧光显微
镜观测拍照。结果显示, AtRGS1-GFP融合蛋白绿
色荧光集中于细胞膜上表达, 而对照中的GFP绿色
荧光分布于整个细胞, 由此推测AtRGS1蛋白分布
于细胞膜(壁)上(图 2)。
图 2 拟南芥悬浮细胞中AtRGS1蛋白的细胞定位
Fig.2 Cellular localization of AtRGS1 protein
in Arabidopsis suspension cells
4 AtRGS1-GFP融合蛋白的Western blotting印
迹鉴定
为验证转化细胞中AtRGS1-GFP融合蛋白的
存在, 采用GFP一抗对转化细胞蛋白提取物进行
Western blotting印迹鉴定。已知AtRGS1分子量
为 53 kDa, GFP分子量为 27 kDa, AtRGS1-GFP融
合蛋白理论上应为 80 kDa。转化 AtRGS1-GFP融
合基因的细胞蛋白提取物, 经 SDS-PAGE电泳, 转
膜、杂交与显色, 发现在约 80 kDa大小处, 有一
条特异性条带显示(图 3), 证明 AtRGS1-GFP融合
基因在转化细胞中得到了正确表达。
5 AtRGS1蛋白的原生质体定位
进一步用原生质体瞬时表达技术研究AtRGS1
蛋白细胞水平的定位情况。结果显示, 对照中绿色
荧光分布于整个原生质体, 而AtRGS1-GFP融合基
因绿色荧光集中于原生质体细胞膜特异性表达(图
4)。结合图 2的结果, 表明AtRGS1蛋白定位于拟
图 3 转化细胞中AtRGS1-GFP融合蛋白的
Western blotting检测
Fig.3 Western blotting analysis of AtRGS1-GFP fusing
protein in transformed cells
1: 对照; 2、3: 转化重组融合蛋白的细胞蛋白提取物; 4: 空
白对照。
图 4 拟南芥叶肉原生质体中AtRGS1
蛋白的原生质体定位
Fig.4 Protoplast localization of AtRGS1 protein in
Arabidopsis mesophyll protoplasts
标尺 =5 µm。
南芥细胞的质膜上。
讨　　论
RGS蛋白广泛存在于真菌、线虫及哺乳动物
细胞中, 是一组大小不同、功能多样的蛋白质大家
族, 作为GTP水解酶活化蛋白(GAPs), 负调节G蛋
白介导的细胞信号转导(De Vries等 2000)。迄今
为止, 哺乳动物中已分离出 20多种 RGS蛋白, 进
一步的研究发现, 不同的RGS蛋白调节不同的G蛋
白信号转导, 这种功能特异性与RGS蛋白亚细胞水
平的定位有关。RGS除了定位于细胞质膜上, 也
存在于细胞内其它类型(如高尔基体)的膜上, 大部
分RGS蛋白在细胞中的分布有两个库: 胞质库和膜
结合库, 且许多RGS可以从胞质中转运至膜上(De
Vries等 1996, 1998, 2000; Wylie等 1999)。迄今,
标尺 =10 µm。
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只有少数 RGS蛋白在胞内得到了精确定位, 对于
RGS蛋白在亚细胞水平上的定位还知之甚少。
拟南芥AtRGS1是哺乳动物 RGS的第一个植
物同源基因。其编码的蛋白AtRGS1由 459个氨
基酸组成, 氨基酸 249~459组成的C末端存在高度
保守 RGS功能结构域。已有的研究发现, AtRGS1
具有GAPs蛋白活性, 能够与Gα亚基互作, 加速
GTP水解, 调节植物G蛋白信号转导, 调节糖信号
转导, 且可能是D-葡萄糖的一个受体蛋白(Chen等
2003; Chen和 Jones 2004; Johnston等 2007), 但其
详细的生理功能还知之甚少。本文采用GFP融合
蛋白表达技术, 初步研究AtRGS1在细胞内定位的
结果表明, AtRGS1定位于细胞的质膜上(图 2、
4)。AtRGS1作为一种膜蛋白, 其在植物生长发育
过程中的调节作用尚需进一步研究。
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