全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月22
水稻幼苗根细胞质膜和液泡膜微囊Ca2+-ATP 酶的特性
王精明1 李洪清2 李美茹3,*
1 惠州学院理学系, 惠州 516015; 2华南师范大学生命科学学院, 广州 510631; 3中国科学院华南植物研究所, 广州 510650
提要 水稻幼苗根质膜和液泡膜 Ca2+-ATP 酶对 ATP 的 Km 值分别为 7.1 和 4.5 μ mol.L-1；反应的最适 pH 分别为 8.0 和
7.0。两者活性均受 Na3VO4 和曙红 B（EB）抑制;CPZ 抑制质膜 Ca2+-ATP 酶活性，但促进液泡膜 Ca2+-ATP 酶活性。30
mmol.L-1 CaCl2 浸种和 CaCl2 浸种结合低温锻炼预处理,均可提高此酶的活性和冷稳定性。
关键词 Ca2+-ATP 酶; 质膜; 液泡膜; 水稻幼苗
Characteristics of Ca2+-ATPase of Plasma Membrane and Tonoplast Membrane
Vesicles from Roots of Rice Seedlings
WANG Jing-Ming1, LI Hong-Qing2, LI Mei-Ru3,*
1Department of Natural Science, Huizhou College, Huizhou 516015; 2College of Life Sciences, South China Normal University,
Guangzhou 510631; 3South China Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650
Abstract Plasma and tonoplast membrane-enriched vesicles were prepared from rice seedling root by Dextran
T70 gradient centrifugation. Ca2+-ATPase of both vesicles were identified. The Km values for ATP of Ca
2+-
ATPase of plasma membrane and tonoplast membrane vesicles are 7.1 and 4.5 μ mol.L-1 respectively, and the
optimum pH values of the two vesicles were 8.0 and 7.0, respectively. The enzyme activities of both vesicles
were inhibited by Na3VO4 and erythrosin B (EB).The activity from plasma membrane was inhibited by chlor-
promazine (CPZ), but the activity from tonoplast membrane was promoted by CPZ. However, the enzyme
acitivties and its cold stability of both vesicles were improved by rice seed-submerged in CaCl2 treatment or
seedling-cold-hardened treatment following seed-submerged in CaCl2 treatment.
Key words Ca2+-ATPase; plasma membrane; tonoplast membrane; rice seedlings
收稿 2003-04-07 修定 　 2003-09-16
资助　 国家自然科学基金项目（3017066 7）。
* 通讯作者（E-mail:limr@scib.ac.cn, Tel:020-
37252590）。
维持细胞胞质中低水平的 Ca2+ 稳态对细胞
的正常生理代谢活动有重要作用，而存在于细
胞器膜上的 Ca2+-ATP 酶对由于受刺激而升高的
胞质Ca2+浓度, 在其完成信息传递后迅速回落到
静息态水平时起调控作用。质膜和液泡膜上的
Ca2+-ATP 酶分别将胞质中 Ca2+ 运住细胞外或液
泡中，因此，研究此酶的特性有重要意义。近
年来，人们虽对 Ca2+-ATP 酶的分子生物学特性
有了初步了解，但有关此酶的结构、功能、
活性的调控机制还不清楚[ 1 ]。已有实验证明
Ca 2+- A TP 酶对逆境（如:盐、铝、冷胁迫等）
有应答功能[2~5]。为了阐明 Ca2+-ATP 酶在逆境
应答中的机制，必须了解影响此酶活性的因
子。本文探讨水稻幼苗根质膜和液泡膜 Ca 2+-
ATP 酶及其在氯化钙浸种提高幼苗抗寒性过程
中的活性变化特性。
材料与方法
选用抗冷力较强的水稻（Oryza sativa）品
种“特三矮二”为材料[6]。分别以蒸馏水和 30
mmol.L-1 CaCl2 浸种 24 h后，用湿沙布包裹置于
恒温箱（28℃）中催芽 2 d，再将种子分别排列
在放有蛭石的培养皿中，置于恒温箱内（28℃）
生长24 h，取出放在(28± 1)℃、30μ mol.m-2.
s-1 光强下生长8 d。将两组幼苗分别分为两部分：
一部分置于光强为75 μmol.m-2.s-1、 14℃的培养箱
中锻炼3 d；另一部分继续置于培养架上生长。3
d后，将全部幼苗取出置于1℃、光强为150 μmol.
植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月 23
m-2.s-1的培养箱内进行冷胁迫处理，2 d后取出置
培养架上让幼苗恢复生长。在冷锻炼后和冷胁迫
后采样测定。
质膜和液泡膜制备按文献 7 方法。取一定量
的根，按1∶2比例加入缓冲液（0.25 mol.L-1 甘
露醇、2 mmol.L-1 EDTA、1 mmol.L-1 DTT、25
mmol.L-1 Tris-Mes， pH 7.8）匀浆。浆液用2层
纱布过滤后, 以13 000×g离心10 min； 取上清
液再以80 000×g离心30 min；将沉淀物悬浮在
含有0.25 mmol.L-1 甘露醇、1 mmol.L-1 EDTA、
1 mmol.L-1 DTT、10 mmol.L-1 Tris-Mes(pH 7.5)的
悬浮液中；取悬浮液，铺在装有5 mL 6%与 4 mL
12% (重量比)的Dextran T70的液泡上（梯度溶液
用悬浮液配制），以 105 000 × g 离心 2 h；取
6%与12% Dextran T70界面颗粒为原生质膜微囊，
0%与6% Dextran T70界面处的沉淀颗粒为液泡膜
微囊，样品贮于-20℃下备用。以上操作均在4℃
下进行。
测定质膜 Ca2+-ATP 酶活性时，取 0.5 mL 含
50 mmol.L-1 Tris-Mes (pH 6.5)、3 mmol.L-1 CaCl2、
3 mmol.L-1 ATP、1 mmol.L-1 (NH4)6MO7O24、1
mmol.L-1 NaN3、50 mmol.L-1 NaNO3、0.01%(体
积比)Triton X-100、20 μg膜蛋白的反应液，用
ATP启动反应，37℃下反应30 min后, 以 0.5 mL
10%TCA 终止反应。按Lin 和 Morales[8]的方法测
定 Ca2+-ATP 酶水解 ATP 后所释放的无机磷的量。
测定液泡膜Ca2+-ATP酶活性时，取0.5 mL含
50 mmol.L-1 Tris-Mes (pH 6.0)、3 mmol.L-1 CaCl2、
4 mmol.L-1 ATP、1 mmol.L-1 (NH4)6MO7O24、0.1
mmol.L-1 Na3VO3、1 mmol.L-1 NaNO3、0.01%(体
积比)Triton X-100、20 μg膜蛋白的反应液。其
它反应过程与上述测质膜 Ca2+-ATP 酶活性相同。
蛋白质含量测定按Bradford[9]的方法。
根质膜和液泡膜微囊制剂纯度的鉴定见前
文[3 ]。
实验结果
1 水稻幼苗根细胞质膜Ca2+-ATP酶的动力学特征
各种阳离子对膜微囊 ATP 酶的激活能力顺序
是：Mg2+>Ca2+>Mn2+>Zn2+(图 1)。向反应系统加
入Ca2+ 或 Mg2+ 时表现的酶活性称为Ca2+-ATP 酶或
Mg2+-ATP 酶活性。通过 Lineweaver-Burk 作图，
Ca2+-ATP 酶对 ATP 的 Km 值比 Mg2+-ATP 酶的大，
两者分别为7.1和5.89 μmol.L-1; 这两种酶反应的
最适pH值也不一样, 前者为8.0，后者为6.5。前
者与后者一样也受Na3VO4抑制，曙红B (erythrosin
B, EB)对其也有抑制作用，5 μ mol.L-1 的氯丙嗪
（CPZ）对该酶的抑制作用较小；而后者不受 EB
和C P Z 的抑制（图 2 ）。
向反应系统加入Ca2+ 时，水解ATP 的酶活性
图1 Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+ (2.5 mmol.L-1)对
水稻幼苗根细胞质膜ATP 酶活性的影响
Fig.1 Effects of Ca2+, Mg2+, Mn2+ and Zn2+ (2.5 mmol.L-1)
on the activity of ATPase of plasma membrane from
roots of rice seedlings
以不加任何二价阳离子而呈现的ATP酶水解活性为对照
[0.088 μmol (Pi).mg-1(蛋白).min-1]。
图2 各种抑制剂对水稻幼苗根细胞质膜Ca2+-ATP酶
和 Mg2+-ATP 酶活性的影响
Fig.2 Effects of inhibitors on the activities of Ca2+-ATPase
and Mg2+-ATPase of plasma membrane from roots
of rice seedlings
对照的Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性分别为：0.158和
0.218 μmol (Pi).mg-1 (蛋白).min-1。
植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月24
随Ca2+浓度增加而增加，当Ca2+浓度达到2.5 mmol.
L -1 时，酶活性最大，这时再提高 Ca2+ 浓度，酶
活性反而下降（图 3）。反应系统中加入 Mg2+ 时，
酶活性随Mg2+ 浓度增加而升高，说明反应系统中
的 Mg2+ 水平影响 Ca2+-ATP 酶活性；测 Mg2+-ATP
酶活，则随着Ca2+ 浓度增加而下降，说明Ca2+ 对
M g 2 +- A T P 酶活性亦有影响（图 4）。
2 水稻幼苗根细胞液泡膜Ca2+-ATP酶的动力学特征
反应系统中分别加入的二价阳离子激活酶的
能力大小依序为 Ca 2+> M g 2+> M n 2+> Z n 2+(图 5)。
C a 2+- A T P 酶活性明显高于 M g 2+- A T P 酶活性，
Ca2+-ATP酶的 Km 值为 4.5 μ mol.L-1, 而 Mg2+-ATP
酶的为7.6 μmol.L-1, 这与质膜微囊表现得不一样。
当Ca2+ 浓度达到2.5 mmol.L-1 时，酶活性达到最
大，C a 2 + 浓度再提高时，酶活性反而下降（图
6），这与质膜微囊的结果一致。测定 Ca 2+- A TP
酶和 Mg2+-ATP 酶时，分别加 Mg2+ 或 Ca2+ 后，前
者抑制Ca2+-ATP 酶活性，且随反应系统中Mg2+ 浓
度的增加而下降；测定Mg2+-ATP 酶活性, 加入低
浓度的 Ca2+ 时，酶活性下降，但当加入浓度大于
0.05 mmol.L-1 后，Mg2+-ATP 酶活性有回升趋势。
说明反应系统中Mg2+ 和 Ca2+ 水平影响着ATP 酶的
活性（图 7）。Ca2+-ATP 酶的最适 pH 值为 7.0，
Mg2+-ATP 酶为 6.0，这与质膜微囊不同。
液泡膜微囊的 Ca 2+- A T P 酶活受 Na 3V O 4 抑
制，受 EB 抑制的程度比质膜更严重，而 CPZ 则
有促进作用。这与质膜微囊不同。Mg 2+- AT P 酶
图3 水稻幼苗根质膜Ca2+-ATP酶对Ca2+的依赖性
Fig.3 Ca2+ concentration dependence of Ca2+-ATPase of
plasma membrane from roots of rice seedlings
图4 Mg2+或Ca2+对水稻幼苗根质膜Ca2+-ATP酶和
Mg2+-ATP 酶活性的影响
Fig.4 Effects of Mg2+ or Ca2+ on the activities of Ca2+-
ATPase and Mg2+-ATPase of plasma membrane from
roots of rice seedlings respectively
图 5 Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+ (2.5 mmol.L-1)对
水稻幼苗根细胞液泡膜ATP酶活性的影响
Fig.5 Effects of Ca2+, Mg2+, Mn2+ and Zn2+ (2.5 mmol.L-1)
on the activity of ATPase of tonoplast membrane
from roots of rice seedlings
以不加任何二价阳离子而呈现的ATP酶水解活性为对照
[0.178 μmol (Pi).mg-1 (蛋白).min-1]。
图6 水稻幼苗根液泡膜Ca2+-ATP酶对Ca2+的依赖性
Fig.6 Ca2+ concentration dependence of Ca2+-ATPase of
tonoplast membrane from roots of rice seedlings
植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月 25
活不受 N a 3V O 4、E B、C P Z 的影响（图 8）。
3 CaCl2浸种对质膜和液泡膜Ca2+-ATP酶活性的
影响
冷胁迫降低质膜和液泡膜Ca2+-ATP酶活性[3]。
图 9 表明，CaCl2 浸种的 Ca2+-ATP 酶活性明显提
高，冷胁迫后，仍高于未浸种的。CaCl2 浸种结
合低温锻炼也表现出CaCl2浸种的相同效果，在冷
胁迫后，该酶活性甚至高于冷胁迫前的水平。
讨 论
据报道，植物细胞质膜和液泡膜Ca2+-ATP酶
均为 PM型 Ca2 +-ATP 酶，其活性可为钙调节蛋白
(calmodulin,CaM)和酸性磷脂激活, 对EB高度敏感,
低于 1 μ mol.L-1的 EB可完全抑制其活性[1]。本
文结果表明，液泡膜上的 Ca2+-ATP 酶对 EB 的敏
感性高于质膜上的，但1 μ mol.L-1 的 EB 并不能
完全抑制此酶的活性(图 2、8)。这可能与我们实
验所用的材料和膜制剂与前人不同有关。质膜和
液泡膜 H+-ATP 酶对 EB 敏感性低，其活性受抑制
程度大于85%时，EB浓度则远高于1 0 0 μmol.
L-1。 据此可以认为，对低浓度 EB 的敏感性是
Ca2 +-ATP 酶区别于 H+-ATP 酶的重要标志[1]。
在本文采用的 EB 浓度范围（0.1~1.0 μ mol.
L -1）内，质膜 Ca 2 +- A TP 酶活性有抑制作用，
而对液泡膜上的则反而略有激活作用（图 2 、
8），其原因尚不清楚。Ca 2+ 和 Mg 2+ 会影响膜微
囊的 Ca2 +-ATP 酶活性（图 4、7），计算膜微囊
Ca2+-ATP 酶活性时，应考虑内源Mg2+ 或 Ca2+ 引起
图8 各种抑制剂对水稻幼苗根细胞液泡膜Ca2+-ATP
酶和 Mg2+-ATP 酶活性的影响
Fig.8 Effects of inhibitors on the activities of Ca2+-ATPase
and Mg2+-ATPase of tonoplast membrane from
roots of rice seedlings
对照的Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活分别为：0.430和0.192
μmol (Pi).mg-1 (蛋白).min-1。
图9 CaCl2浸种和CaCl2浸种结合低温锻炼对水稻幼苗根液泡膜和质膜Ca2+-ATP酶活性的影响
Fig.9 Effects of CaCl2 treatment and CaCl2 treatment combined with cold-hardening on the activities of Ca2+-ATPase
of tonoplast and plasma membrane from roots of rice seedlings
图7 Mg2+或Ca2+对水稻幼苗根液泡膜Ca2+-ATP酶和
Mg2+-ATP 酶活性的影响
Fig.7 Effects of Mg2+ or Ca2+ on the activities of Ca2+-
ATPase and Mg2+-ATPase of tonoplast membrane from roots
ofrice seedlings respectively
植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月26
ATP酶的水解问题。通常认为Ca2 +-ATP 酶的最适
pH 是 7.0~7.5。但我们的实验表明，水稻幼苗根
质膜 Ca2 +-ATP 酶的最适 pH 与液泡膜的不一样，
前者为 8.0，后者为7.0。液泡膜Ca2 +-ATP 酶对
Ca2 + 的亲和性大于质膜，前者对 ATP 的 K m 为
4.5 μmol.L-1, 后者为7.1 μmol.L-1，都远大于大
麦根质膜[2]。
大麦根质膜上存在两种Ca2 +转运机制: 一种是
Ca2 +-ATP 酶驱动的不需要 Mg2+ 的高 Ca2 + 亲和系
统；另一种是需 Mg 2+ 的低 Ca 2 + 亲和系统，是
H +/ C a 2 + 反向传递系统[2]。两者在盐胁迫中不
同：Ca2 +-ATP 酶驱动的初级 Ca2 + 转运系统可能
与胁迫信号的传递有关，而次级Ca2 +转运系统则
可能起信号传递之后将剩余 Ca2 + 运出胞外的功
能。长时间盐胁迫下两系统Ca2 +转运能力的降低
则是一种伤害反应[2]。王红等[10]用细胞化学方法
研究低温胁迫后细胞中Ca2+ 分布时，发现Ca2+ 主
要分布在质膜内侧、胞质和胞核中，随着胁迫时
间的延长，Ca 2+ 沉淀加重。他们的实验还表明，
施用抗寒剂的黄瓜幼苗在低温胁迫后，其胞质中
Ca2+ 分布可基本恢复到冷胁迫前的状态，但未经
抗寒剂处理的细胞中 Ca2+ 沉淀继续加重。我们采
用相同的方法在水稻幼苗材料中也证明冷胁迫的
Ca2+ 沉积于胞质和胞核中，此种现象可一直维持
到恢复期。由此我们认为，这可能是导致幼苗死
亡的重要原因。我们未发表的资料表明，如采用
有利于提高幼苗抗冷力，如盐、冷和氯化钙进行
浸种处理，冷胁迫后胞质中 Ca2+ 分布可恢复到冷
胁迫前的状态。由此我们推测，存在于细胞质膜
和液泡膜上的 Ca2+-ATP 酶可能是将胞质中的 Ca2+
外运到胞外或液泡钙库中，起降低胞质中 Ca2+ 浓
度的作用。Jian 等[4]报道，在低温下不抗寒植物
的质膜和核膜中Ca2+-ATP 酶失活，胞质内和核内
Ca2+ 的增加不能被泵回胞外或钙库，因而，导致
细胞死亡。所以可以认为，维持质膜或液泡上的
Ca2+-ATP 酶的正常活性是维持细胞活力的保障。
我们在前文[3]中报道，盐、冷预处理均有激活和
提高质膜、液泡膜 Ca2+-ATP 酶的冷稳定性的作
用，这对胞质中 Ca2+ 水平恢复到静息状水平是有
利的。Ca2+ 预处理可以增强植物对许多非生物逆
境的适应性，减轻逆境对植物所造成的伤害，如
增强对冷害、高温、干旱、盐害等逆境因子的
抵御能力等[11]。本文结果表明，CaCl2 浸种处理
有提高水稻质膜和液泡膜Ca2+-ATP 酶活性的作用
（图 9）。这可能与 CaCl2 浸种提高细胞中可溶性
Ca2+ 含量[11]，激活 Ca2+-ATP 酶活性有关。低温
锻炼提高幼苗的抗寒力的效应可为 EGTA 和 CPZ
抑制[3]。这说明，CaCl2浸种结合低温锻炼处理之
所以更能提高质膜和液泡膜Ca2+-ATP 酶活性，可
能与低温锻炼启动钙信使系统的作用有关，也与
提高细胞抗氧化能力和稳定冷胁迫下细胞质膜和其
它细胞器膜的完整性有关[3，11，12]。
参考文献
1 何龙飞，王爱勤，沈振国等. 高等植物细胞的Ca2+-ATP酶.
广西农业生物科学，20 0 0，1 9（1）：6 4 ~ 6 7
2 郝鲁宁，余叔文. 大麦根细胞质膜Ca2+转运系统对盐胁迫的
反应. 植物生理学报，1993，19：275~284
3 曾韶西，李美茹. 冷和盐预处理提高水稻幼苗抗寒性期间细
胞 Ca2+-ATP 酶活性的变化. 植物学报，1999，41（2）：
156~160
4 Jian LC, Li JH, Chen WP et al. Cytochemical localization of
calcium and Ca2+-ATPase activity under chilling stress: a com-
parative study between the chilling-sensitive maize and the chill-
ing-insensitive winter wheat. Plant Cell Physiol, 1999, 40:
1061~1071
5 张芬琴，沈振国，刘友良. 铝和铝 + 钙对小麦幼苗根尖质
膜、液泡膜微囊ATP酶和膜流动性的影响. 植物生理学报，
200 0，26（2）：105~ 1 1 0
6 李美茹，刘鸿先，王以柔等. 水稻幼苗冷锻炼过程中钙的
效应. 植物学报，1996，38（9）：735~742
7 焦新之，李 琳，倪晋山. 花生幼苗下胚轴质膜氧化还原
系统. 植物生理学报，1992，18：63~69
8 Lin TI, Morales MF. Application of a one-step procedure for
measuring inorganic phosphate in the presence of proteins: the
actomyosin ATPase system. Anal Biochem, 1977, 77: 10~17
9 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation
of microgram quantitites of protein utilizing the principle of pro-
tein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72: 248~254
10 王 红，简令成，张举仁. 低温胁迫下水稻幼叶细胞内Ca2+
水平的变化. 植物学报，1994，36（8）：587~591
11 李美茹，刘鸿先，王以柔等. 钙对水稻幼苗抗冷力的影响.
植物生理学报，19 9 6，2 2（4）：37 9 ~ 3 8 4
12 李美茹，刘鸿先，王以柔. 低温下水稻幼苗叶片细胞膜膜
脂过氧化和膜磷脂脱酯化反应. 广西植物，19 9 8，1 8
（2）：1 7 3 ~ 1 7 6