全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月1226
收稿 2009-08-20 修定 　2009-10-20
资助 国家自然科学基金(30 6 00 4 1 3)、教育部科学技术研究
重点项目(207064)和河南省科技厅基础与前沿技术项目
(0 82 30 04 30 32 0)。
* 通讯作者(E-mail: l ichengweiwau@hotmail.com; Tel:
03 94 -8 17 80 10 )。
NBS Profiling: 一种有效寻找植物抗性基因的分子标记
裴冬丽 1,2, 李成伟 2,3,*
1河南农业大学农学院, 郑州 450002; 2商丘师范学院生命科学系植物与微生物互作重点实验室, 河南商丘 476000; 3周口师
范学院生命科学系, 河南周口 466001
An Effective Molecular Marker of Mining Plant Resistance Gene—NBS Pro-
filing
PEI Dong-Li1,2, LI Cheng-Wei2,3,*
1College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2Key Laboratory of Plant-Microbe Interactions,
Department of Life Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu, Henan 476000, China; 3Department of Life Science, Zhoukou
Normal University, Zhoukou, Henan 466001, China
提要: 核苷酸结合位点 -富含亮氨酸重复(NBS-LRR)类的抗病基因是植物抗病基因中最大的一类, 也是近年来植物抗病分
子育种研究的一大热点。NBS profiling是一种新型的寻找NBS-LRR类R基因和R基因同源序列(RGA)的分子标记。本文
介绍这一分子标记技术的基本原理、方法步骤、优点及其在寻找植物抗性基因中的作用。
关键词: R基因; 同源序列克隆; NBS profiling
植物抗病基因(resistance, R)介导的抗性反应是
植物对病原物的防御机制之一。迄今为止, 大约有
50多个植物抗性基因已得到克隆(Coaker等 2005),
根据 1971年 Flor提出的著名的基因对基因学说
(Flor 1971), 过敏反应相关的抗性反应依赖于寄主
中 R基因和病菌中无毒基因(avirulence, Avr)的匹
配。R基因介导的抗病过程涉及病原无毒基因产
物或次生代谢产物与寄主 R 基因产物的相互识
别、下游信号传递系统的激活与传递、植物防卫
及相关抗病反应, 如活性氧的释放、过敏反应、
病程相关基因的表达、系统获得性抗性等过程。
植物 R基因的克隆是了解 R基因的结构特征、研
究 R基因与 Avr基因互作机制、R基因的进化机
制、持久抗性及兼抗抗性机制的重要基础, 同时也
为植物抗性分子育种提供可直接利用的基因资源。
因此, 植物R基因的寻找有一定的理论意义和应用
前景。
1 R基因及同源序列的克隆
1.1 R基因的分类 分析已知的植物抗病基因编码
的蛋白质结构, 发现它们具有相当高的保守性。根
据预测结构域, 这些基因可以分为 5个主要类别
(Baker等1997): (1)含有核苷酸结合位点(nucleotide
binding site, NBS)和富含亮氨酸重复序列(leucine-
rich repeats, LRR)的胞内受体蛋白基因; (2)丝氨酸/
苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase, STK); (3)
含有胞外LRR结构的跨膜受体蛋白基因; (4)同时含
有胞外LRR和胞内STK结构的跨膜受体蛋白基因;
(5)编码毒素还原酶的HM1基因。依据保守序列设
计引物寻找R基因同源序列(resistance gene analog,
RGA), 从而克隆R基因的方法被称为R基因同源克
隆法, 具有简便快速的优点。小麦抗叶锈基因Lr10
的克隆就是利用这一方法克隆的第一个 R 基因
(Feuillet等 1997)。
1.2 NBS-LRR 类 R基因和同源序列的克隆 在己
经克隆的R基因中, NBS-LRR类是已分离R基因中
最大的一类, 占抗病基因的 60% 左右, 广泛存在于
植物的基因组中(Hammond-Kosack和 Parker 2003;
McDowell和Woffenden 2003), 并且覆盖整个基因
组(Meyers等 2002, 2003; Monosi等 2004)。NBS
结构域存在于大量的ATP和GTP结合蛋白, 如ATP
专题介绍 Special Topics
植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月 1227
合成酶、鸟苷三磷酸酶等中, 表明R基因需要ATP
或GTP的参与来完成其功能(Traut 1994)。依据
NBS-LRR类R基因N端结构域的不同又分为两大
亚类: TIR类, 与果蝇及哺乳动物的白细胞介素1的
受体蛋白(TIR)具有同源性; non-TIR类, 具有一个
卷曲螺旋基序(Meyers等 1999; Pan等 2000)。
虽然不同NBS-LRR类R基因之间核苷酸序列
的差异较大, 但是它们的氨基酸序列存在一些保守
基序(conserved motif): 磷酸结合环 P-1oop, 共有序
列为GxGxxGR(T/S); 一个疏水性的结构域GLPL,
序列为GLPLxL; 两个激酶结构域 kinase-2和激酶
kinase-3a (图 1)。NBS结构域的功能主要是参与
信号转导, 通过激活激酶或G蛋白来诱导一系列的
防御反应(Hammond-Kosack和 Jones 1997)。LRR
结构域由一个重复的富含有亮氨酸的基序(平均约
24个氨基酸)组成, 这一结构域参与蛋白质与蛋白
质的相互识别, 具有特异性地识别病原菌的功能
(Takken和 Joosten 2000)。
profiling被开发和应用(van der Linden等 2004)。
NBS profiling是一种DNA指纹技术, 是依据植物抗
性基因的核酸结合域的保守基序的R基因表达谱。
这一方法的基本程序(图2)为: 首先准备多种抗
病和感病的植物材料, 提取植物基因组总 DNA。
约400 ng每个单株基因组DNA用单个的限制性内
切酶MseI (AluI、RsaI或HaeIII)消化 4 h以上, 产
生平均长度为 300~400 bp的片段。接着片段的末
端与一个接头(adapter)连接, 接头具有长臂和短臂,
其 5端为单链。接头与接头引物序列如下: 接头
长臂序列, 5 ACTCGATTCTCAACCCGAAAGT-
ATAGATCCCA 3; 接头短臂序列, 5 TGGGATCT-
ATACTT 3 (在3端加入氨基基团); 接头引物序列,
5 ACTCGATTCTCAACCCGAAAG 3。依据植物
NBS-LRR类抗性基因的保守基序设计简并引物:
NBS2、NBS3、NBS5、NBS7、NBS9等用于后
面的扩增。随后进行 2次 PCR。第一次为线性扩
增, 在反应体系中只使用简并引物, 第二次为指数
扩增, 体系中使用了简并引物及接头引物作为上、
下游引物。两次 RCR的反应程序相同: 95 ℃变性
5 min; 95 ℃变性 30 s, 55 ℃或60 ℃退火1 min 40 s
(NBS5、NBS7和NBS9为55 ℃; NBS2和NBS3为
60 ℃), 72 ℃延伸 2 min, 共 35个循环; 72 ℃延伸
20 min。PCR产物采用 6%的变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)分
离。凝胶银染后, 于室温自然干燥, 照相。将植
NBS-LRR类R基因的保守基序为基于同源序
列的R基因和RGA的直接PCR克隆提供了引物设
计的依据。自Kanazin等(1996)和Yu等(1996)报道
大豆中采用 R基因保守序列设计简并引物扩增得
到 RGA后, 迄今人们己在柑橘(Deng等 2000)、棉
花(Hinchliffe等 2005)、粗燕麦(Irigoyen等 2004)、
甜瓜(van Leeuwen等 2005)、马铃薯(Leister等
1996)、草莓(Martinez Zamora等 2004)、咖啡树
(N oi r 等 20 01 )、拟南芥(Tan 等 20 07 )、甘蔗
(Wanderley-Nogueira等 2007)、水稻(王世全等
2005)、蔷薇(Xu等 2005)、扁豆(Yaish等 2004)和
花生(Yuksel等 2005)等多种植物中分离到RGA序
列并对其起源、多样性和进化机制进行了研究。
2 NBS profiling 技术及其应用
2.1 NBS profiling技术 近几年来, 一种新型的寻找
NBS-LRR类 R基因和 RGA的分子标记技术 NBS 图 2 NBS profiling 的基本步骤
图 1 NBS-LRR类 R基因的保守基序(van der linden等 2004)
箭头所指为引物所在位置。
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物的抗病性和分离的RGA进行关联分析, 确定与植
物抗病性关联的RGA, 从而确定R基因候选片段和
抗性分子标记, 并对目标片段进行克隆测序, 采用
BLASTN和BLASTX软件与NCBI核酸数据库中的
R基因和 RGA进行同源比对和聚类分析。
NBS profiling中用于指数 PCR的接头引物与
接头单链部分的序列是一样的, 因此, 接头引物的
互补完全依赖于其互补链的合成。而在 PCR反应
中接头短臂 3端的延伸被一个氨基基团有效地阻
止。因此接头引物只能在选择性的NBS引物延伸
后才能参与 PCR反应。结果使得扩增高度依赖于
NBS的选择性与特异性。为了提高 PCR反应的特
异性, 在实际的指数PCR之前, 先只用NBS特异引
物做一线性 PCR。实验中不对称的线性扩增对于
获得稳定的重复结果很必要。
这项技术不同于常规的同源序列克隆(两端
PCR引物都是根据R基因保守序列设计的R基因和
RGA分离技术), 采用 R基因的保守序列设计 PCR
扩增的一端引物, 另一端引物根据与限制性内切酶
酶切位点相连的接头设计, 可以提高获得R基因和
RGA的几率, 同时结合了扩增片段长度多态性
(amplified fragment length polymorphism, AFLP)的
稳定性和RGA目标性的优点。这一技术类似于序
列特异性扩增多态性(sequence-specific amplification
polymorphism, SSAP), 但有本质的不同点, 后者是
一种修饰的AFLP技术(Hayes等 2000)。
2.2 NBS profiling 技术的应用 首先开发并利用
NBS profiling技术的van der Linden 等(2004)用此技
术在基因组水平上分析了马铃薯、大麦、番茄和
莴苣的 RGA的分布状况。Brugmans等(2008)用
NBS profiling方法对马铃薯进行了抗性基因位点的
遗传作图及其转录分析, 定位了 34个 RGA位点。
并将NBS profiling应用于 cDNA, 以鉴定那些具有
潜在功能的可以转录的 R基因簇。Mantovani等
(2006)用NBS profiling作为一种分子标记的方法分
析硬粒小麦的遗传多样性, 通过8种引物和酶的组
合产生了 691个条带, 其中的 190个条带具有多态
性, NBS profiling分子标记的结果与AFLP、SSR
分子标记得到的遗传距离接近一致。W a ng 等
(2008)曾用NBS profiling分析了块茎繁殖的茄属植
物的系统分类, 并与AFLP分析的结果比较, 提出
了NBS profiling于植物系统进化构建的潜在功能。
古瑜等(2007)用NBS profiling技术也构建了花椰菜
的遗传图谱, 并分析了 RGA在图谱中的定位。
2.3 NBS profiling 与相关技术的比较
2.3.1 成对简并引物的同源序列克隆 为了获得抗
病位点的生物多态性也可用成对简并引物的同源序
列克隆的方法, 即用R基因或RGAs的保守区域设
计简并引物对来扩增大量的RGAs的NBS的部分序
列。这一方法最初由 Leister等(1996)报道, 采用高
分辨率的电泳技术可以检测RGA的多态性。NBS
profiling与此方法的不同点是用了一个简并 RGA
引物和一个连接在酶切位点的接头。这可以同时
检测到片段的长度多态性和限制性内切酶识别位点
的多态性。在鉴定目的R基因或RGAs时, 可以采
用大量的限制性内切酶来提高发现与有意义的抗性
位点连锁的遗传变异的机会。
2.3.2 SSAP NBS profiling技术与Hayes等(2000)的
SSAP技术有一定的相似性。DNA用限制性内切
酶EcoRI和MseI消化, 接头连接在限制性内切酶的
末端。第一轮 PCR用MseI和 EcoRI +1 选择性引
物扩增获得一亚类消化和连接片段。然后进行第
二轮 PCR, 用第一轮的 EcoRI +1和标记的简并引
物(与抗性基因的 P-loop的区域对应)做 PCR。但
是用SSAP产生的RGAs于指纹中的频率最好只达
到 20%~25%。相反, 用NBS-profiling技术 RGAs
的频率可以达到 40%~90%。
2.3.3 连接介导的 PCR (ligation-mediated PCR,
LM-PCR) LM-PCR是由Hornstra和Yang (1993)
提出, 并由 Trognitz等(2002)用于筛选与防御相关
的基因。通过限制性内切酶产生黏性末端, 与非磷
酸化的人工接头相连, 用一条与接头互补的引物和
一条与目的基因序列互补的引物扩增目的片端。
这可以扩增目的基因两侧的序列。理论上通过这
种方法产生的片段数目反映了该基因在基因组中的
拷贝数。LM-PCR和NBS profiling的区别是, 使
用了切割频率不太高的识别6个碱基的限制性内切
酶和较少简并性的基因特异性引物。使得结果中
每个分析仅包含有一个或几个位点, 而不像 NBS
profiling有多个位点。
3 NBS profiling 技术的应用前景
NBS profiling是一个产生R基因和RGAs分子
标记的有力工具。在无需改变引物和方法步骤的
条件下, 它可用于许多物种。因此 NBS profiling
植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月 1229
在作物改良、种质鉴定和生物多样性研究中是一
个有应用前景的工具。
NBS profiling能产生可靠的抗病分子标记, 采
用分离杂交种可以得到 R基因。通过混合分组分
析法(bulked segregant analysis, BSA), 选择引物和酶
的不同组合可以迅速产生多态性条带。那些与抗
性共分离的标记可以进一步进行鉴定, 并可转变为
共显性的标记。已有的初步结果表明采用分离群
体可以在很多作物中绘制多态性位点的基因组图
谱。通过仔细选择引物序列有可能筛选到一类 R
基因和特异的基因簇, 甚至筛选到与抗病位点紧密
连锁的标记, 进一步可以鉴定潜在的新的R基因簇
或已知基因簇的新成员。
分子标记可用于种质资源鉴定。NBS profil-
ing作为一种分子标记技术可以鉴定抗性位点的遗
传多样性。对这一重要性状的鉴定, 将促进对种质
资源的有效利用。其中, 重要农作物的野生型材料
可用于寻找新的抗性基因。
NBS profiling的部分标记很有可能处于选择压
力之下, 因此可用于生态学和系统发育的生物多样
性研究。通过将NBS profiling与随机标记系统如
AFLP的分子标记进行比较, 可以进一步阐明 R基
因在物种形成中的作用。另外, NBS profiling技
术中限制性内切酶引物端可以检测 R基因的单核
苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),
有助于研究 R基因的进化和多样性。
NBS profiling不但可以扩增和产生与R基因和
RGAs连锁的分子标记, 在NBS profiling技术基础
之上, 可以扩展出一种适用范围广泛的技术, 称之
为基序介导的 profiling (motif-directed profiling), 可
以用来寻找其它的基因家族(van der Linden等
2005)。采用选择性简并引物扩增基因组中具有足
够保守性的序列, 目的基因可以是植物或其它包括
人类中的基因家族: 如蛋白激酶、细胞色素 P450
基因家族、MADS-box基因家族、NAC转录因子
基因家族以及在基因转录中起调控作用的启动子元
件等保守的 DNA基序。
参考文献
古瑜, 赵前程, 孙德岭, 宋文芹(2007). 花椰菜遗传图谱的构建及
NBS-LRR类抗性同源基因在图谱中的定位. 遗传, 29 (6):
751~757
王世全, 张德春, 李平, 汪旭东, 李世贵, 朱立煌, 翟文学(2005). 水
稻中一个 NBS-LRR抗病同源基因家族的克隆和分析. 遗传
学报, 32 (7): 704~711
Baker B, Zambryski P, Staskawicz B, Dinesh-Kumar SP (1997).
Signaling in plant-microbe interactions. Science, 276:
726~733
Brugmans B, Wouters D, van Os H, Hutten R, van der Linden G,
Visser RGF, van Eck HJ, van der Vossen EAG (2008). Ge-
netic mapping and transcription analyses of resistance gene
loci in potato using NBS profiling. Theor Appl Genet, 117:
1379~1388
Coaker G, Falick A, Staskawicz B (2005). Activation of a phyto-
pathogenic bacteria l effector protein by a eukaryotic
cyclophilin. Science, 308: 548~550
Deng Z, Huang S, Ling P, Chen C, Yu C, Weber CA, Moore GA,
Gmitter Jr FG (2000). Cloning and characterization of NBS-
LRR class resistance-gene candidate sequences in citrus.
Theor Appl Genet, 101: 814~822
Feuillet C, Schachermayr G, Keller B (1997). Molecular cloning
of a new receptor-like kinase gene encoded at the Lr10 dis-
ease resistance locus of wheat. Plant J, 11 (1): 45~52
Flor HH (1971). Current status of the gene-for-gene concept.
Annu Rev Phytopathol, 9: 275~296
Hammond-Kosack KE, Jones JDG (1997). Plant disease resis-
tance genes. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 48:
575~607
Hammond-Kosack KE, Parker JE (2003). Deciphering plant-
pathogen communication: fresh perspectives for molecular
resistance breeding. Curr Opin Biotechnol, 14: 177~193
Hayes AJ, Saghai Maroof MA (2000). Targeted resistance gene
mapping in soybean using modified AFLPs. Theor Appl Genet,
100: 1279~1283
Hinchliffe DJ, Lu YZ, Potenza C, Segupta-Gopalan C, Cantrell
RG, Zhang JF (2005). Resistance gene analogue markers are
mapped to homeologous chromosomes in cultivated tetrap-
loid cotton. Theor Appl Genet, 110: 1074~1085
Hornstra IK, Yang TP (1993). In vivo footprinting and genomic
sequencing by ligation-mediated PCR. Anal Biochem, 213:
179~193
Irigoyen ML, Loarce Y, Fominaya A, Ferrer E (2004). Isolation
and mapping of resistance gene analogs from the Avena
strigosa genome. Theor Appl Genet, 109: 713~724
Kanazin V, Marek LF, Shoemaker RC (1996). Resistance gene
analogs are conserved and clustered in soybean. Proc Natl
Acad Sci USA, 93 (21): 11746~11750
Leister D, Ballvora A, Salamini F, Gebhardt C (1996). A PCR-
based approach for isolating pathogen resistance genes from
potato with potentia l for wide application in plants. Nat
Genet, 14: 421~429
Mantovani P, van der Linden G, Maccaferri M, Sanguineti MC,
Tuberosa R (2006). Nucleotide-binding site (NBS) profiling
of genetic diversity in durum wheat. Genome, 49: 1473~1480
Martinez Zamora MG, Castagnaro AP, Diaz Ricci JC (2004).
Isolation and diversity analysis of resistance gene analogues
(RGAs) from cultivated and wild strawberries. Mol Gen
Genomics, 272: 480~487
McDowell JM, Woffenden BJ (2003). Plant disease resistance
植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月1230
genes: recent insights and potential applications. Trends
Biotechnol, 21 (4): 178~183
Meyers BC, Dickerman AW, Michelmore RW, Sivaramakrishnan
S, Sobral BW, Young ND (1999). Plant disease resistance
genes encode members of an ancient and diverse protein
family within the nucleotide-binding superfamily. Plant J,
20 (3): 317~332
Meyers BC, Kozik A, Griego A, Kuang H, Michelmore RW (2003).
Genome-wide analysis of NBS-LRR-encoding genes in
Arabidopsis. Plant Cell, 15: 809~834
Meyers BC, Morgante M, Michelmore RW (2002). TIR-X and
TIR-NBS proteins: two new families related to disease resis-
tance TIR-NBS-LRR proteins encoded in Arabidopsis and
other plant genomes. Plant J, 32: 77~92
Monosi B, Wisser RJ, Pennill L, Hulbert SH (2004). Full-genome
analysis of resistance gene homologues in rice. Theor Appl
Genet, 109: 1434~1447
Noir S, Combes MC, Anthony F, Lashermes P (200l). Origin,
diversity and evolution of NBS-type disease-resistance gene
homologues in coffee trees (Coffea L.). Mol Genet Genomics,
265: 654~662
Pan Q, Wendel J, Fluhr R (2000). Divergent evolution of plant
NBS-LRR resistance gene homologues in dicot and cereal
genomes. J Mol Evol, 50: 203~213
Takken FLW, Joosten MHAJ (2000). Plant resistance genes: their
structure, function and evolution. Eur J Plant Pathol, 106:
699~713
Tan X, Meyers BC, Kozik A, West MA, Morgante M, St Clair DA,
Bent AF, Michelmore RW (2007). Global expression analy-
sis of nucleotide binding site-leucine rich repeat-encoding
and related genes in Arabidopsis. BMC Plant Biol, 7: 56
Traut TW (1994). The functions and consensus motifs of nine
types of peptide segments that form different types of nucle-
otide-binding sites. Eur J Biochem, 222: 9~19
Trognitz F, Manosalva P, Gysin R, Nino-Liu D, Simon R, del
Herrera MR, Trognitz B, Ghislain M, Nelson R (2002). Plant
defense genes associated with quantitative resistance to po-
tato late blight in Solanum phujera × dihaploid S. tuberosum
hybrids. MPMI, 15 (6): 587~597
van der Linden CG, Smmulders MJM, Vosman B (2005). Motif-
directed profiling: a glance at molecular evolution. In: Bakker
FT, Chatrou LW, Gravendeel B, Pelser PB (eds). Plant Spe-
cies-level Systematics: New Perspectives on Pattern &
Process. Ruggell, Liechtenstein: A.R.G. Gantner Verlag,
291~303
van der Linden CG, Wouters DCAE, Mihalka V, Kochieva EZ,
Smulders MJM, Vosman B (2004). Efficient targeting of
plant disease resistance loci using NBS profiling. Theor Appl
Genet, 109: 384~393
van Leeuwen H, Garcia-Mas J, Coca M, Puigdomenech P, Monfort
A (2005). Analysis of the melon genome in regions encom-
passing TIR-NBS-LRR resistance genes. Mol Gen Genomics,
273: 240~251
Wanderley-Nogueira AC, Soares-Cavalcanti NM, Morais DAL,
Belarmino LC, Barbosa-Silva A, Benko-Iseppon AM (2007).
Abundance and diversity of resistance genes in the sugarcane
transcriptome revealed by in silico analysis. Genet Mol Res,
6 (4): 866~889
Wang MQ, Van den Berg R, Van der Linden G, Vosman B (2008).
The utility of NBS profiling for plant systematics: a first
study in tuber-bearing Solanum species. Plant Syst Evol,
276: 137~148
Xu Q, Wen XP, Deng XX (2005). Isolation of TIR and nonTIR
NBS-LRR resistance gene analogues and identification of
molecular markers linked to powdery mildew resistance lo-
cus in chestnut rose (Rosa roxburghii Tratt). Theor Appl
Genet, 111: 819~830
Yaish MWF, Saenz de Miera LE, Perez de la Vega M (2004).
Isolation of a family of resistance gene analogue sequences
of the nucleotide binding site (NBS) type from Lens species.
Genome, 47: 650~659
Yu YG, Buss GR, Saghai Maroof MA (1996). Isolation of a super-
family of candidate disease-resistance genes in soybean based
on a conserved nucleotide-binding site. Proc Natl Acad Sci
USA, 93 (21): 11751~11756
Yuksel B, Estill JC, Schulze S R, Paterson AH (2005). Organiza-
tion and evolution of resistance gene analogs in peanut. Mol
Gen Genomics, 274: 248~263