全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 453
温度对枳椇次生胚发生和植株再生的影响
李成浩 1,*，刘宝光 1，王伟达 1，刘立琨 1，YU Chang-Yeon2
1 东北林业大学黑龙江省林木遗传育种重点实验室，教育部林木遗传育种与生物技术重点实验室(在建)，哈尔滨
150040；2江原大学农业生命科学学院，韩国春川 200-701
提要：在含有2,4-D 椇的培养基上所诱导和增殖的枳 体细胞胚只能形成无再生能力的畸形胚。通过次生胚发生途径可以
在不加植物生长调节物质的培养基诱导出发育正常的体细胞胚，子叶期胚的次生胚诱导能力高于早期体胚。相对高的温
度(30 ℃)有利于次生胚的诱导，相对低的温度(20 ℃)更有利于次生胚的发育、植株再生和移栽成活。
关键词：次生胚发生；重复体胚发生；培养温度；植物生长调节物质
Effects of Temperature on Secondary Somatic Embryogenesis and Plant Re-
generation in Hovenia dulcis Thunb.
LI Cheng-Hao1,*, LIU Bao-Guang1, WANG Wei-Da1, LIU Li-Kun1, YU Chang-Yeon2
1Key Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding of Heilongjiang Province, Key Laboratory of Forest Genetics and Tree
Breeding and Biotechnology of Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2College of Agricul-
ture & Life Science, Kangwon National University, Chunchon 200-701, Korea
Abstract: Somatic embryos induced on medium containing 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, could only de-
velop abnormal embryos. Well developed somatic embryos could be obtained through secondary somatic em-
bryogenesis in medium without plant growth regulator. The induced ability of cotyledonary somatic embryos
induced more secondary embryos was higher than early stage somatic embryos. The temperature strongly
affected on secondary embryogenesis, relatively high temperature (30 ℃) was effective for induction of sec-
ondary somatic embryos, and low temperature (20 ℃) was more suitable for further embryo development,
plantlet regeneration and transplantation survival.
Key words: secondary somatic embryogenesis; cyclic somatic embryogenesis; culture temperature; plant growth
regulator
收稿 2007-01-24 修定 　2007-04-23
资助 国家自然科学基金(30671701)和黑龙江省博士后基
金。
* E-ma il：chli0@16 3.com；Tel：04 51 -8 21 90 60 7
枳椇为鼠李科(Rhamnaceae)拐枣属(Hovenia
Thunb.)落叶乔木，自然分布于中国、朝鲜、日
本和印度，其他各国也常有栽培。枳椇是传统的
中药材，近年来又被尝试用作解酒果粉饮料、熬
糖和酿酒。枳椇生长快、材质优、适生性强，
是退耕还林、西部开发、岗丘瘠薄地资源开发和
现代绿化极好的新树种(嵇扬和陆红 2002)。但缺
少优良的苗木资源，对精选出的家系和无性系繁
殖手段单一。采用枳椇体细胞胚的培养可能有助
于解决这一问题。关于枳椇体细胞胚的发生迄今
只有 Eum等(2002)的极少数报道，诱导的体细胞
胚都是无再生能力的畸形胚，未能得到完整的再
生植株(Eum等 2002)。一般在多种植物体细胞胚
发生的工作中，均发现固体或悬浮培养的体细胞
胚在成熟、发芽过程中经常有次生胚发生(Nair和
Dutta Gupta 2006)，有人认为此可用作为改善体
细胞胚品质和提高植株再生率的手段(庞晓斌和李
彦舫 2006；Nair和 Dutta Gupta 2006)。本文在
此种认识的基础上进行研究，通过次生胚发生途
径在固体培养基上可以获得正常发育的体细胞胚和
再生植株。
材料与方法
材料为从韩国江原道阳扬群采集的野生枳椇
(Hovenia dulcis Thunb.)的成熟果实，水浸泡 4 d
后，搓去果肉，洗净种子。种子用浓硫酸浸泡
20 min，自来水冲洗 30 min，剥去外种皮，置
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于 70%乙醇中浸泡 1 min，用 2% NaClO溶液消
毒 20 min，再用无菌蒸馏水冲洗 4次后，取出种
胚，接种到添加 1.0 mg·L-1 2,4-D的固体培养基
上，在 25 ℃培养室中暗培养。2~3个月后，把
胚性愈伤组织转接到不添加植物生长调节物质的培
养基上，以促进体细胞胚的形成和进一步发育。
将各发育时期的体细胞胚转接到新鲜培养基
后分别在 20、25和 30 ℃温度条件下培养。培养
6周后调查不同培养温度下次生胚诱导和胚发育的
情况。
在25 ℃温度下培养的次生胚转接到新鲜培养
基上，于 20 ℃下培养 1~2周后，挑选发芽的体
细胞胚转到添加 0.1~2.0 mg·L-1 6-苄基嘌呤(6-
benzylaminopurine，6-BA)的固体培养基上，分别
在 20、25和 30 ℃培养温度下培养，4周后调查
植株再生率。
移栽时，挑选出现 5 个以上叶片的再生植
株，用自来水洗去根部培养基，移栽到装有草炭
土的容器中，分别置于 20和 25 ℃的光照培养箱
中培养。移栽后的 2周内用塑料薄膜覆盖，2 d
浇水 1 次，6 周后观察移栽成活率。
以上基本培养基均加 1/3 MS+3%蔗糖 +2.5 g·
L-1胶立得(Gelrite)，调 pH至 5.8，121 ℃高压灭
菌 15 min后使用。培养条件为光照时间 16 h·d-1，
光照强度 35 µmol·m-2·s-1左右。每个培养瓶培养10
个左右体胚，每处理 20个体胚，重复 3次。实
验数据用Duncan法进行多重比较。
实验结果
1 体细胞胚的诱导
在 25 ℃的温度条件下，2周后外植体开始膨
大，2个月后开始出现淡黄色胚性愈伤组织，3个
月后的胚性愈伤组织诱导率为 10%左右。将胚性
愈伤组织转接到不加植物生长调节物质的培养基上
后 1周开始出现体细胞胚，在以后的 2~3周内体
细胞胚发育至子叶形胚后停止发育。形成的都是
无子叶分化或连体胚的畸形胚，转到不添加植物
生长调节物质的培养基上后也不能发芽，而且 2
周以后开始从大部分体胚的下胚轴出现次生胚或胚
性细胞团(图 1-a)。胚性细胞团形成后又形成大量
的体细胞胚，此时出现的体胚都是独立个体，胚
的发育也遵循合子胚发育的历程，由球形胚经心
图 1 枳椇的次生胚诱导和植株再生
Fig.1 Secondary embryogenesis and plant regeneration of H. dulcis
a ：次生胚诱导；b ：次生胚发育；c ：植株再生；d ：移栽成活。
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形胚与子叶期胚发育成熟(图 1-b)。但至子叶期以
后也停止发育，过一段时间反又开始发生新的次
生胚。以这种方式可以反复诱导次生胚，体细胞
胚可稳定维持 3年以上。
2 温度对次生胚重复发生的影响
将25 ℃温度条件下培养的心形胚和子叶期胚
分别转到不加植物生长调节物质的培养基上后于不
同温度条件下培养 1个月后的结果表明，培养温
度和体细胞胚的发育程度对次生胚的诱导有明显的
作用，相对的高温和子叶期胚的次生胚诱导能力
显著高于低温和幼龄期的体胚(表 1)。温度对诱导
形成的次生胚的数量和发育速度也有明显的作用，
即随着培养温度的提高，诱导的次生胚数量显著
增加，但胚的发育速度变慢(表 2)。综合分析可
以认为，25 ℃的温度较可满足体胚数量和发育速
度的要求。
的体细胞胚可形成完整植株(图1-c)。6-BA对植株
再生也有一定的影响。低浓度的6-BA对植株再生
有一定的促进作用，6-BA浓度高于 0.5 mg·L-1时，
体细胞胚开始膨大和愈伤化，以致植株再生率急
剧下降。
表 1 温度和体胚发育时期对枳椇次生胚诱导的影响
Table 1 Effects of temperature and somatic embryo develop-
ment stage on induction of secondary embryos of H. dulcis

培养温度 /℃
不同发育时期体细胞胚的次生胚诱导率 /%
心形胚 +鱼雷形胚 子叶期胚
2 0 0 13.3c
2 5 0 46.7b
3 0 10.0d 86.7a
　　不同英文小写字母表示在 0.05 水平上差异显著，下表同此。
表 2 培养温度对诱导的枳椇次生胚数量的影响
Table 2 Effect of temperature on number of secondary
embryos of H. dulcis
培养温度 /℃ 子叶期体胚中 培养 4周后
次生胚数 /% 次生胚发育时期
2 0 5.7c 子叶期胚
2 5 67.3b 鱼雷形胚 +子叶期胚
3 0 92.7a 胚性细胞团+球形胚+心形胚
表 3 温度和 6-BA对枳椇体胚植株再生率的影响
Table 3 Effects of temperature and 6-BA concentration on
plant regeneration of H. dulcis somatic embryos
温度 /℃ 6-BA浓度 /mg·L-1 植株再生率 /%
2 0 0 36.7a
0.1 43.3a
0.5 13.3b
1.0 6.7c
2.0 0
2 5 0 3.3c
0.1 0
0.5 0
1.0 0
2.0 0
表 4 温度对枳椇再生植株移栽成活率的影响
Table 4 Effect of temperature on transplantation survival rate
of regenerated plantlets of H. dulcis
温度 /℃ 植株移栽数 成活数 成活率 /%
2 0 5 0 4 1 8 2
2 5 5 0 1 7 3 4
4 温度对再生植株移栽成活率的影响
将出现 5 个以上叶片、生长良好的再生植
株，用自来水洗去根部培养基，移栽到草炭土
中，分别放在 20和 25 ℃的培养箱中培养的结果
表明，移栽后 4 d，20 ℃下生长的再生植株开始
出现新根，第 10天左右新叶开始萌发生长，14
d揭去塑料薄膜后，幼茎开始伸长生长。移栽 6
周后成活率达到 82% (图 1-d)。移栽在 25 ℃下生
长7 d左右的很多植株开始出现叶片和嫩茎坏死现
象，最后整株死亡，移栽 6周后只有 34%的移栽
苗能成活(表 4)。
讨　　论
畸形胚在许多植物的体细胞胚发生过程中经
3 温度和 6-BA对植株再生的效应
发芽的体细胞胚转到植株再生培养基上，4
周后调查的结果表明，温度对植株再生起关键作
用(表 3)。在 30和 25 ℃培养的大多数体细胞胚不
能形成再生植株，而在 20 ℃下培养的大约有 1/3
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常出现，如刺五加(Gui等 1991)和橡胶(Durham和
Parrott 1992)，且大部分不能发育成正常植株，
这就大大降低了体细胞胚再生形成植株的效果。
Eum等(2002)已得到枳椇初生胚，但是无再生能
力，因为该类胚是畸形的。本文通过培养温度的
调节，不仅得到高频率的正常次生胚(86.7%)，还
见到温度对植株再生也有明显作用。
迄今为止，环境培养温度对次生胚诱导的影
响的报道还不多。Kamada等(1989)在胡萝卜的初
生胚发生研究中曾有类似的报道。他们用37 ℃高
温处理胡萝卜茎段在不加植物生长调节物质的培养
基里可诱导出体细胞胚。一般认为在体细胞胚诱
导过程中高温可能是作为一种逆境胁迫而促进体细
胞向胚性细胞转变的(Kamada等 1989；Feher等
2003)。本实验中 30 ℃的相对高温环境有利于次
生胚的诱导，其原因可能与此是一样的。
提高体细胞胚的植株再生率的常用的物理方
法有低温处理(Beuno等1992)和干燥处理(Gingas和
Lineberger 1989)等，这类处理在降低内源ABA类
抑制物质的同时也可增加可促进发芽物质内源赤霉
素的含量以促进发芽。本实验中较低的培养温度
(20℃)下枳椇体细胞胚才能再生植株，其原因可
能与此种说法是一样的，这还需要作进一步的研
究。
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