全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月 211
紫杆柽柳MnSOD基因在非生物胁迫中的作用
班巧英，刘桂丰，姜静，常万霞，王玉成 *
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室，哈尔滨 150040
提要：构建了酵母表达载体 pYES2-MnSOD，并将其转入酿酒酵母 INVSc1，以转空载体 pYES2的酵母 INVSc1为对照，
检测其抗NaCl 、Na2CO3、NaHCO3和紫外线胁迫能力。结果表明，转MnSOD基因酵母在以上逆境因素胁迫下的存活率
有明显提高，说明MnSOD基因具有较强的抗 NaCl 、Na2CO3、NaHCO3和紫外线胁迫能力。
关键词：紫杆柽柳；锰 -超氧歧化酶；酿酒酵母；非生物胁迫
The Roles of MnSOD from Tamarix androssowii in Abiotic Stress Tolerances
BAN Qiao-Ying, LIU Gui-Feng, JIANG Jing, CHANG Wan-Xia, WANG Yu-Cheng*
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Breeding and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin
150040, China
Abstract: In this study, we constructed a yeast expression vector pYES2-MnSOD, transformed it into cells of
yeast INVSc1, and yeast transformed with empty pYES2 were used as control to test the abiotic stress toler-
ance of MnSOD. The results of NaCl, Na2CO3, NaHCO3 and ultraviolet ray tolerance tests showed that MnSOD
transformed yeast lines displayed obvious high survival rate than control lines. It suggested that the MnSOD
gene was highly tolerant to the stresses of NaCl, Na2CO3, NaHCO3 and ultraviolet ray.
Key words: Tamarix androssowii; MnSOD; Saccharomyces cerevisiae; abiotic stress
收稿 2007-09-26 修定 2008-01-14
资助 教育部科学技术研究重点项目( 1 0 7 0 3 7 )、国家自然
科学基金 ( 3 0 5 7 1 5 0 9 )和黑龙江省攻关重点项目
(GB06B303-1)。
* 通讯作者(E-mail：wangyucheng1029@yahoo.com.cn；
T el：0 4 5 1 -8 2 1 9 1 6 2 7 )。
抗氧化酶类是植物抵抗氧化胁迫的关键因
素。盐胁迫下，植物往往会启动一套保护酶系统
[如：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、
过氧化氢酶(CAT)] (沈法富和尹承佾 1993)。它们
可消除盐胁迫下产生的活性氧和过氧化物自由基，
以避免这些物质对细胞质膜和脂肪酸的氧化作用，
从而保证质膜的完整性(李玉全等 2002)。其中，
SOD是抗氧化系统中一种在生物体内普遍存在的
金属酶，处于核心地位。植物MnSOD与酵母和
动物体内的MnSOD一样，都与线粒体密切相关，
由核基因编码，在细胞质中合成蛋白质前体，蛋
白质前体在线粒体前导肽作用下运输到线粒体内发
挥功能(White和 Scandalios 1987)。其生理功能主
要是清除超氧自由基。据报道，经过 1% 和 3%
NaCl处理后的耐盐大麦品种比不耐盐的小麦品种
更能维持相对较高的 SOD活性，从而削弱膜脂质
过氧化作用和减轻膜伤害(龚明等 1989)。近年来
通过 SOD基因工程改良植物抗干旱和耐盐碱的研
究已有所报道。韩利芳和张玉发(2004)采用农杆
菌介导的转基因方法，将烟草 MnSOD 基因的
cDNA 序列导入苜蓿中，成功诱导了转基因植株
的再生，部分转基因植株的MnSOD活性有显著
提高。Mckersie等(1993)将烟草的MnSOD的cDNA
序列转入苜蓿，得到的转基因植株其总SOD酶活
性提高 2倍，它的干旱耐受性和下一年的产量均
有提高。以后Mckersie等(1999)将获得的转基因
苜蓿进行田间试验，进一步证明转基因苜蓿中
MnSOD的表达能通过调控叶绿素荧光、电解质渗
漏和茎尖再生以减弱水分亏缺的伤害，从而增强
了苜蓿的抗旱性。MnSOD基因在烟草和玉米叶绿
体中的过量表达也可增强两种植物对质膜和光系统
Ⅱ的保护作用以及对除草剂引起的氧胁迫耐受性
(Bowler 等 1991；Slooten 等 1995；van Breusegem
等 1999)。Tanaka 等(1999)报道，酵母线粒体
MnSOD在水稻叶绿体中的过量表达可提高转基因
植株对盐胁迫的耐受性，盐胁迫下的转基因植株
中 SOD和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性都提
高 1 . 5 ~ 2 倍。本文将从紫杆柽柳中克隆获得的
MnSOD基因构建到酵母表达载体 pYES2中，并
转化酵母后，检测了转MnSOD基因酵母对各种非
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生物胁迫的抗逆能力。
材料与方法
紫杆柽柳(Tamarix androssowii Litw.) MnSOD
基因(AY573576)为本实验室克隆；大肠杆菌感受
态 TOP10；酵母表达载体 pYES2 (含有URA3基
因、氨苄霉素选择抗性基因、多克隆位点等) ；
酵母菌菌株 INVSc1 (表现型为Ura-) ；限制性内切
酶 XbaI和 KpnI、高保真 Pfu Taq酶、T4 DNA 连
接酶等购自 Promega公司，胶回收试剂盒、PCR
产物纯化试剂盒购自上海华舜公司，Ex Ta q、
DNA Marker DL2000和 λHindIII购自宝生物工程
(大连)有限公司。氨苄霉素(Ampicillin，Amp)购自
Sigma公司，其他化学试剂等购自国内生产厂家，
均为分析纯。根据MnSOD基因的 cDNA序列，设
计酵母表达引物，引物序列见表 1。
构建酵母表达载体时，用PCR的方法引入带
酶切位点的MnSOD全基因，然后将目的片段和
pYES2酵母表达载体同时用 XbaI和 KpnI进行酶
切，再将酶切后的产物进行纯化(cycle-pure Kit)，
在 T4 DNA连接酶的作用下，将MnSOD基因和
pYES2连接并转化大肠杆菌 TOP10F感受态细
胞。随机挑选单克隆转化子提取质粒，用XbaI和
KpnI双酶切进一步检测插入位点的正确与否。
重组质粒 pYES2-MnSOD和载体 pYES2的酵
母遗传转化时，将载有MnSOD基因的重组质粒
(pYES2-MnSOD)和空载体(pYES2)分别转化酵母菌
I N VS c 1，获得的转化子分别命名为 I N V S c 1
(pYES2-MnSOD)和 INVSc1 (pYES2)，并接种在
SC-U [0.67% 酵母氮基质(不含氨基酸) ；2%葡萄
糖 ；0.01% (腺嘌呤﹑精氨酸﹑半胱氨酸﹑亮氨酸﹑
赖氨酸﹑ 苏氨酸﹑色氨酸﹑ 尿嘧啶) ；0.005% (天
冬氨酸﹑ 组氨酸﹑异亮氨酸﹑甲硫氨酸﹑苯丙氨
酸﹑脯氨酸﹑丝氨酸﹑酪氨酸﹑缬氨酸)] 固体选
择培养基上，30 ℃培养 24 h。然后用 PCR的方
法检测是否将 pYES2-MnSOD质粒转入酵母。以
随机挑选的4个INVSc1 (pYES2-MnSOD)的酵母单
菌落总DNA为模板，以MnSODL和MnSODR为
引物，对MnSOD基因是否转入酵母进行 PCR扩
增检测。20 µL PCR反应体系：2.0 µL 10×PCR
缓冲液，MnSODL和MnSODR引物各 1.0 µmol·L-1，
1.6 µL dNTP (2.5 mmol·L-1)，0.2 µL Ex Taq (10
U·µL-1)，加入 200 ng酵母DNA。PCR反应程序
为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃
退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，30个循环；72 ℃
保温 7 min。产物检测：PCR产物用 1.2%的琼
脂糖凝胶电泳检测。
为了分析紫杆柽柳MnSOD基因的抗逆能力，
将重组酵母 INVSc1 (pYES2-MnSOD)和对照酵母
INVSc1 (pYES2) 分别用 5 mol·L-1 NaCl、8%和 10%
(W/V) Na2CO3、5 % (W/V) NaHCO3以及紫外线照
射 12 s和 16 s的胁迫来观察菌落存活的机率。处
理有：(1) NaCl 胁迫：4 ℃条件下，用 5 mol·L-1
NaCl溶液分别胁迫等摩尔数的 INVSc1 (pYES2-
MnSOD)和 INVSc1 (pYES2)，分别处理 4 h和 24 h
后，将菌液稀释 1 000倍接种于 SC-U固体选择培
养基(含 2%葡萄糖)上，于 30 ℃恒温中培养 40 h
左右直至长出单菌落；(2) Na2CO3胁迫：配置 8%
和 10%的Na2CO3溶液，于 30 ℃条件下分别胁迫
等摩尔数的 INVSc1 (pYES2-MnSOD)和 INVSc1
(pYES2) 3 h，等量接种于 SC-U固体选择培养基
(含 2%葡萄糖)上，于 30 ℃恒温中培养 40 h左右
直至长出单菌落；(3) NaHCO3胁迫：用 5% 的
NaHCO3溶液，于 30 ℃条件下分别胁迫等摩尔数
的INVSc1 (pYES2-MnSOD)和INVSc1 (pYES2) 4 h
和 24 h后，将菌液稀释 1 000倍接种于 SC-U固体
选择培养基 (含 2%葡萄糖)上，30 ℃恒温中培养
40 h左右直至长出单菌落；(4)紫外线胁迫：将等
摩尔数的 INVSc1 (pYES2-MnSOD)和 INVSc1
(pYES2)接种于固体SC-U固体选择培养基(含2%
葡萄糖)上，在紫外线下分别照射 12 s 和 16 s后，
30 ℃恒温中培养 40 h左右直至长出单菌落。
表 1 构建酵母表达载体所用引物序列
Table 1 The primer sequences used in constructing yeast expression vector
引物名称 引 物 序 列
MnSODL 5 AGTCTCTAGAATGGCGCTTCGCACATTGGCGGCC 3 (下划线为 XbaI酶切位点)
MnSODR 5 TTGCAGGTACCTTACAGTTGTGGGCACTCCTTGTC 3 (下划线为 KpnI酶切位点)
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实验结果
1 酵母重组表达载体(pYES2-MnSOD)的获得
用KpnI和XbaI两种限制性内切酶对重组质粒
pYES2-MnSOD进行双酶切，于 0.8%的琼脂糖凝
胶上电泳检测，结果在 5.9 kb和 699 bp均得到了
特异性条带(图 1)，说明目的基因已正确连接。
分析，其扩增片段与预期的 699 bp长度相吻合(图
2)。P CR 结果呈阳性证明了重组质粒 pYE S2 -
MnSOD已经转入酵母 INVSc1。
图 1 重组质粒双酶切鉴定
Fig.1 Identification of recombinant plasmid
with restrictive enzyme digestion
1：D N A M a rk er D L 2 0 0 0；2、3：重组质粒 p Y E S2 -
M nS O D 双酶切产物。
图 2 pYES2-MnSOD转酵母 INVSc1 的 PCR鉴定
Fig.2 PCR identification of pYES2-MnSOD
transformed yeast INVSc1
1：DN A M a rk er DL 2 0 0 0；2 ~ 5：IN VSc 1 (p YES 2 -
MnSOD )的菌落 PCR 产物。
2 酵母的压力实验
在 NaCl胁迫时，非胁迫条件下的重组酵母
INVSc1(pYES2-MnSOD)和对照酵母 INVSc1
(pYES2)的菌落数量相同，但NaCl胁迫下的菌落
存活率明显高于对照酵母 INVSc1 (pYES2)，且胁
迫时间越长，菌落存活的差异越明显。说明在相
同盐胁迫条件下，MnSOD基因的表达可明显提高
酵母细胞对 NaCl胁迫的耐受能力(图 3-a) ；在
图 3 不同胁迫条件下转基因酵母的生长
Fig.3 Growth of transgeneic yeast under different stress conditions
以随机挑选的 4个 INVSc1 (pYES2-MnSOD)
的酵母单菌落总 DNA为模板，以特异引物进行
PCR扩增，扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳
植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月214
Na2CO3胁迫下，重组酵母INVSc1 (pYES2-MnSOD)
生长量明显优于对照酵母 INVSc1 (pYES2)，而
且，N a 2C O 3溶液浓度达到 1 0 % 时，IN V S c1
(pYES2)几乎全部死亡，而 INVSc1 (pYES2-
MnSO D)却仍有一定的存活率。说明紫杆柽柳
MnSOD基因的表达可明显增强酵母细胞的抗盐碱
能力(图 3-b) ；NaHCO3胁迫下，随着胁迫时间的
延长，重组酵母 INVSc1 (pYES2-MnSOD)单菌落
缓慢减少，而对照酵母 INVSc1 (pYES2)单菌落迅
速减少，且受胁迫影响明显。说明紫杆柽柳
MnSOD有明显的抗NaHCO3胁迫的能力(图3-c) ；
紫外线胁迫下，虽然酵母生长受到抑制，但紫外
线照射 12 s和 16 s后，重组酵母 INVSc1 (pYES2-
MnSOD)的存活数比对照酵母 INVSc1 (pYES2)的
多，说明 INVSc1 (pYES2-MnSOD)比 INVSc1
(pYES2)更能抵抗紫外线胁迫(图 3-d)。
讨 论
干旱( Da t 等 2 0 00 )、盐碱( He r na ndez 等
1993)、低温或高温(Dat等 1998)等，都可以加剧
植物活性氧的产生，破坏植物体内活性氧产生和
清除之间的平衡，最终导致植物体内活性氧的大
量积累，从而对植物产生伤害。因此，采用分
子生物学手段，对植物的氧化代谢进行修饰，提
高植物抗氧化胁迫的能力，是植物抗性研究的方
向之一 (秦小琼和贾士荣 1997)。超氧化物歧化酶
是生物体内的自由基清除剂，其活性高低与植物
的抗逆能力密切相关，是生物有机体内清除多余
超氧阴离子的一种保护酶。目前已有几种植物的
SOD基因得到克隆并用来转化不同的植物，以获
得SOD活性增强的转基因植株。SOD在转基因烟
草、苜蓿和棉花等植物中的过量表达可以提高它
们对氧化胁迫的耐受性(Bowler等 1991；秦小琼
和贾士荣 1997；Foyer等 1994)。说明 SOD基因
在植物抗氧化胁迫过程中是重要的。
MnSOD基因有耐盐能力，已经有较多的报
道，如，Tanaka 等(1999)的工作表明，酵母线
粒体MnSOD在水稻叶绿体中的过量表达可提高转
基因植株对盐胁迫的耐受性；Wang等(2004)的工
作也表明，MnSOD在拟南芥中的超量表达可提高
转基因植株的耐盐能力。但M nSO D 具有抵抗
Na2CO3、 NaHCO3和紫外线胁迫能力的报道迄今尚
未见。本文结果表明，紫杆柽柳MnSOD具有良
好的抗Na2CO3、 NaHCO3和紫外线胁迫的能力，
说明MnSOD基因的抗逆能力较为广泛，这对深入
认识MnSOD基因的抗逆性和将该基因用于基因工
程育种来说是有参考意义的。
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