全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月 439
拟南芥保卫细胞中茉莉酸甲酯诱导的H2O2 产生与 MAPK 信号转导体系的
可能关系
薄惠 王棚涛 董发才* 宋纯鹏
河南大学生命科学学院，河南省植物逆境生物学重点实验室，河南开封 475001
提要 蛋白激酶 MEK1/2 的专一抑制剂 PD98059 可抑制茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的拟南芥保卫细胞中 H2O2 的产生和气孔
的关闭。MeJA 和 H2O2 诱导气孔关闭后，再用 PD98059 处理, 可使关闭的气孔重新开放，同样，外源 PD98059 处理，能
使 MeJA 诱导增强的 H2O2 探针的荧光强度降低。此结果表明，类属于 MAPKK 的蛋白激酶 MEK1/2 参与了 MeJA 诱导的
拟南芥气孔关闭的信号转导过程，其作用机制可能是通过调节 MeJA 诱导保卫细胞产生和积累 H2O2 而起作用。
关键词 拟南芥；MAPK；PD98059；茉莉酸甲酯；H2O2；保卫细胞
The Methyl Jasmonate-induced H2O2 Generation and Relation to MAPK Sig-
nal Transduction System in Arabidopsis thaliana Guard Cells
BO Hui, WANG Peng-Tao, DOND Fa-Cai*, SONG Chun-Peng
Key Laboratory of Plant Stress Biology of Henan Province, College of Life Science, Henan University, Kaifeng, Henan 475001,
China
Abstract The specific inhibitor PD98059 of MEK1/2 could inhibit the H2O2 production and stomatal closure
induced by methyl jasmonate (MeJA) in guard cells of Arabidopsis thaliana. After stomatal closure induced by
MeJA and H2O2, PD98059 treatment could induce reopening of close stomata, in the meantime, the fluores-
cence intensity of H2O2 probe dichlorofluorescein (DCF) decreased. These results indicated that the MEK1/2
involved in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction system of stomatal closure in-
duced by MeJA and mediated the H2O2 generation in guard cells of Arabidopsis thaliana.
Key words Arabidopsis thaliana; MAPK; PD98059; methyl jasmonate; H2O2; guard cells
收稿 2005-03-02 修定 　2005-07-08
资助 国家自然科学基金( 3 0 3 7 0 7 7 6 5 ) 和“9 7 3 ”项目
(200CB114305)。
*通讯作者(E-mail: dongfc@henu.edu.cn, Tel: 0378-
3881967)。
茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)在植物
诸多生理过程中起作用，如抑制幼苗和根的生
长、种子萌发，促进叶片衰老、气孔关闭、叶
绿素降解等[1]。同时，茉莉酸类物质(茉莉酸和
MeJA)作为内源信号分子在植物逆境生理中也起作
用，在多种胁迫条件(如机械伤害、虫害、病害、
干旱、高温等)下，植物细胞可在短时间内积累
茉莉酸类物质，诱导植物防御反应，从而产生系
统获得性抗性(system acquired resistance，SAR)[2,3]。
然而要真正理解 MeJA 的作用，还必须探讨 MeJA
信号转导的分子机制。近年来，这一问题备受关
注，并已取得一定的进展[4,5]。在机械伤害、病
虫害、渗透胁迫等条件下，胞质中Ca2+、H2O2 和
促细胞分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated pro-
tein kinase, MAPK)等多种信号转导体系都参与
MeJA 的信号转导[6~9]。
MeJA和脱落酸(abiscisic acid，ABA)生理
功能十分相近，其细胞信号转导途径也相同和交
叉[7,10]。Evans[11]的研究表明，MeJA 通过胞质碱
化激活蚕豆保卫细胞质膜的外向K+ 通道，导致保
卫细胞的膨压降低，引起气孔关闭，这与 ABA 诱
导气孔关闭的机制相似[12,13]。另外，胞质中Ca2+[14]、
蛋白质磷酸化和脱磷酸化[15,16]和活性氧[17~19]也均参
与 ABA 的信号转导。Jia n g 等[20]的研究证实，
MAPK 信号转导系统参与了 ABA 诱导的蚕豆气孔
关闭，并促进 ABA 诱导的 H 2O 2 产生和积累。令
人感兴趣的是，MeJA也同样可以诱导保卫细胞产
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生和积累 H2O2[7]。如前所述，其对气孔运动的调
节与 ABA 相似。那么，MAPK 信号转导系统是否
同样参与 MeJA 诱导的气孔关闭过程，对 MeJA 诱
导保卫细胞产生和积累 H2O2 有否影响？本文以拟
南芥表皮条为实验材料，研究 MAPK 信号转导系
统是否参与 MeJA 诱导的气孔关闭过程，并进一
步阐明 MeJA 和 ABA 在促进气孔关闭时，它们的
信号转导分子机制是否也有共同途径。
材料与方法
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子经
0.1%升汞表面消毒6~7 min后, 用无菌水冲洗3~5
次, 再种植在光照充足的培养室中, 生长条件为：
光/暗周期为16/8 h, 温度18~23℃, 相对湿度80%
左右，光照度 90 mmol·m-2·s-1，植物生长期间不
受任何逆境因素的胁迫。
作表皮条生物分析时，气孔开度测定按照
McAinsh等[21]的方法, 略加修改。取四至六周龄未
抽苔的WT col拟南芥叶片(一般取第3层平展的叶
片)，用蒸馏水洗涤, 撕取下表皮, 用毛刷刷去叶
肉细胞，新鲜的表皮条置于不含 CO2 的 Mes-KCl
缓冲液(50 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 Mes、0.1
mmol·L-1 CaCl2, pH 6.24)中，于23℃下光照约3 h,
诱导气孔张开, 处理前在倒置显微镜(10×40)下用测
微尺测量气孔开度大小。每个处理至少用 3 个表
皮条, 每个表皮条随机选取5个视野, 每个视野随
机测10个气孔开度。 每个处理重复至少8次(不少
于400 个气孔开度)，统计其平均值和标准误差。
最后用柱状图表示不同试剂处理前后气孔开度的变
化。
荧光探针导入时, 预先将 H2O2 探针 H2DCF-DA
配成 50 mmol·L-1 的二甲亚砜(DMSO)母液，分装
冷冻保存，负载时撕取拟南芥叶片下表皮并切成
约 5 mm 长的表皮条，培养在 5 mL 负载液(50
mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 Tris, pH 7.18)中, 然后
加入 5 mL 的 H 2D C F - D A 的 DM S O 母液混匀,
H2DCF-DA的最终浓度为 50 mmol·L-1, 于室温下避
光孵育10~15 min。蛋白激酶MEK1/2专一抑制剂
PD98059 配成 10 mmol·L-1 的 DMSO 母液，分装冷
冻保存，使用时的最终浓度为 10 mmol·L-1。
用激光扫描共聚焦显微镜成像技术(Bio-Rad
MicroRadiance claser scanning confocal microscope，
CLSM)记录表皮条保卫细胞的荧光变化。将负载
有 H2DCF-DA 的表皮条用新鲜的负载液漂洗 2 次，
以洗去细胞表面多余的探针，然后用盖玻片迅速
将表皮条固定在显微镜(Nikon TE-300)载物台上，
采用激光扫描共聚焦显微镜观察。CLSM 的工作
条件为: Ex=488 nm, Em=515~530 nm，Power
10%，Zoom 8~10，中速扫描，Frame 512×512；
软件为Time-course，分析软件使用的是confocal
assistant system (CAS) 和 photoshop。为确保不同
实验之间具有一定的可比性，所有的荧光图像都
在相同的设置下获得( 即通过人工将仪器中相关参
数如 Iris、Gain、Offset、Power等设置为固定
值)。每个处理至少重复 15 次，结果一致，取其
中 1 个细胞进行分析。
实验结果
1 PD98059 对 MeJA 和 H2O2 诱导气孔关闭的影响
将气孔完全张开的表皮条分别放在含有
MeJA、H2O2、MeJA+PD98059、H2O2+PD98059
的缓冲液里，在诱导开放的条件下，继续处理 3
h，结果如图 1所示：0.1 mmol·L-1 MeJA 和 0.1
mmol·L-1 H2O2 处理的气孔开度降低约 82%；与之
相反的是，相应浓度的 MeJA、H 2O 2 分别和 0.1
mmol·L-1 的 PD98059 共同处理后，气孔开度变化
很小。这初步说明，PD98059 不但阻断 MeJA 诱
导的气孔关闭，而且也阻断 H 2O 2 诱导的气孔关
闭。同时, 我们分别以在缓冲液或在含有MeJA和
H2O2 的缓冲液中诱导气孔关闭 3 h 后，所测得的
气孔开度为对照，然后把气孔已关闭的表皮条分
别移到含有 PD98059、MeJA 和 H2O2 的新鲜介质
中，继续诱导关闭2.5 h，结果表明，PD98059对
MeJA及 H2O2 诱导的气孔关闭具有逆转作用(图 2)。
2 PD98059 对 MeJA 诱导的保卫细胞H2O2 产生的
影响
首先用 M e J A 和 P D 9 8 0 5 9 共同处理导入
H2DCF-DA 的表皮条，其 H2O2 产生的情况如图 3-
d~f 所示，结果荧光不增强。图 3-a~c 中, MeJA
处理的由弱增强；在外施 P D 9 8 0 5 9 的条件下，
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MeJA 处理不仅不诱导 H2O2 的产生，反而随着处
理时间的延长，荧光有减弱的趋势。在另外两组
实验中，先用 MeJA 诱导 H2O2 产生 5 min，然后
外施 PD98059，结果 DCF 荧光逐渐减退(图 3-
g~i)。在单独加PD98059 处理时，荧光变化不大
(图3-j~l)。这与过氧化氢酶(catalase, CAT)对H2O2
的清除作用(图 3-m~o)很相似。因此我们认为，
PD98059 对 MEK1/2 活性的调节，不仅抑制 MeJA
诱导的 H2O2 产生，同时也有可能解除 MAPK 对活
性氧清除酶系统的抑制, 清除已有的H2O2。
讨　　论
近年来的一些研究表明，MeJA 可以调节气
孔运动而影响植物的蒸腾、光合和呼吸作用，在
植物的生长发育和抗逆反应中起作用。MeJA调节
气孔运动的信号转导和分子机制是人们非常关注的
图3 PD98059 对 MeJA 诱导的保卫细胞H2O2 产生的影响
Fig.3 Effect of PD98059 on MeJA-induced
H2O2 generation in guard cells
　　最左边为透射图。a~c：0.1 mmol·L-1 MeJA 单独处理 0、
5、10 min；d~f：0.1 mmol·L-1 MeJA+0.1 mmol·L-1 PD98059
共处理 0、5、10 min；g~i：先加 0.1 mmol·L-1 MeJA 诱导
H2O2 产生 5 min, 再加入 0.1 mmol·L-1 PD98059 处理 0、5、10
min；j~l：单独加 0.1 mmol·L-1 PD98059 处理 0、5、10 min；
m~o：单独加 100 U·mL -1 CAT 处理 0、5、10 min。图中
色柱表示荧光强度 0~25 5。
图 2 PD98059 对 MeJA 或 H2O2 抑制气孔开放的作用
Fig.2 Effect of PD98059 on the MeJA-
or H2O2-inhibited stomatal opening
在促进气孔关闭的条件下，分别在缓冲液或含有MeJA和
H2O2 的缓冲液中将气孔诱导关闭 3 h 后，所测得的气孔开度为
对照。然后把气孔已关闭的表皮条分别移到含有 0.1 mmol·L-1
PD98059、0.1 mmol·L-1 PD98059+0.1 mmol·L-1 MeJA、0.1
mmol·L-1 PD98059+0.1 mmol·L-1 H2O2、0.1 mmol·L-1 MeJA、0.1
mmol·L-1 H2O2 的新鲜介质里。继续诱导关闭 2.5 h 后，再测
量气孔开度。测定数值为 450 个(9 次，每次 50 个气孔)气孔
测量值的平均值(±SE)。
图 1 PD98059 对 MeJA 或 H2O2 诱导的气孔关闭的抑制
Fig.1 The inhibitory effect of PD98059 on the MeJA-
or H2O2-induced stomatal closure
　　在促进气孔开放的条件下，把表皮条侵入不含 CO2 的 Mes-
KCl 介质中诱导开放 3 h 后，测量气孔开度，作为起始值。然
后把气孔已开放的表皮条转移到分别含有缓冲液、0.1 mmol·L-1
MeJA、0.1 mmol·L-1 H2O2、0.1 mmol·L-1 MeJA+0.1 mmol·L-1
PD98059、0.1 mmol·L-1 H2O2+0.1 mmol·L-1 PD98059 的新鲜介
质里。继续诱导开放 2.5 h 后，再测量气孔开度。测定数值
为 450 个(9 次，每次 50 个气孔)气孔测量值的平均值(±SE)。
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问题。Suhita等[7]的研究表明，在MeJA诱导气孔
关闭过程中，确有 H2O 2 的产生和积累，且 H 2O 2
为 MeJA 促进气孔关闭的必要成分。我们的实验
进一步证实了他们的结果(数据未列出)。前已述
及，MeJA 调节气孔运动的作用与 ABA 相似，且
胞质中 Ca2+、H2O2、胞质碱化均参与二者促进气
孔关闭的信号转导[7,10,12,19]。
本文着重研究了 MAPK 信号转导系统在 MeJA
诱导气孔关闭中的作用。结果表明，类属于细胞
分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein
kinase kinase，MAPKK)的蛋白激酶MEK1/2是通
过调节MeJA诱导拟南芥保卫细胞H2O2的产生而参
与 MeJA 对气孔运动调节的。PD98059 是 MEK1/2
专一抑制剂，用 PD98059、MeJA 和 H2O2 处理拟
南芥表皮条时，PD98059 可有效地消除 MeJA 和
H2O2促进气孔关闭的作用(图1和 2)。由此可以认
为，MAPK 信号转导体系是参与 MeJA 对气孔运动
调节的。为了了解 MeJA 调节气孔运动中 H2O2 和
M A P K 信号转导体系之间的相互关系，我们用
H2O2 探针 H2DCF-DA 和激光扫描共聚焦技术研究
PD98059对 MeJA诱导拟南芥保卫细胞产生H2O2 影
响的结果(图 3)表明，PD980 5 9 可有效地抑制
MeJA 诱导的 H2O2 产生，并对已经产生的 H2O2 有
一定的清除作用。此结果与Jiang等[20]有关 MAPK
在 A B A 诱导气孔关闭中的信号转导作用极为相
似。据此可以认为，MEK1/2 对 ABA 和 MeJA 诱
导保卫细胞产生 H2O2 有抑制作用，同时可激活保
卫细胞对 H2O2 的清除能力。我们推测，MEK1/2
还可能参与H2O2产生酶和清除酶活性的调节和诱导
某些相关基因的表达。这个问题尚需进一步探
讨。
在植物中已经鉴定出许多编码 M A P K 的基
因，编码的蛋白质包括细胞分裂原活化蛋白激酶
激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase
kinase，MAPKKK)、MAPKK 和 MAPK，它们组
成级联信号转导体系。已有的实验证据表明，植
物细胞中 MAPKs 可为非生物胁迫、病原菌侵染和
植物激素等多种因素激活，而在植物生长发育和
适应环境中起调节作用[22]。Burnett等[23]的研究表
明，PD98059 可有效地抑制 ABA 诱导豌豆气孔的
开放，且10~100 mmol·L-1 ABA处理即可导致豌豆
表皮条中MAPK活性迅速升高。Jiang等[20]的研究
证实，在拟南芥保卫细胞中 MAPKs 信号转导系统
参与 A B A 诱导的 H 2O 2 产生和积累。前已述及，
MeJA同样可以诱导植物气孔关闭，且其信号转导
机制与ABA 也非常相似。Suhita 等[7]研究广谱性
蛋白激酶抑制剂 K252 对 MeJA 调节拟南芥气孔关
闭作用的结果表明，K252 可有效地抑制 ABA 和
MeJA 诱导保卫细胞产生和积累 H2O 2，据此他们
推测，蛋白磷酸化是 ABA 和 MeJA 诱导保卫细胞
产生和积累 H2O2，引起气孔关闭所必需的。本文
结果进一步证实了他们的推测，并且更加确证
MEK1/2 参与 MeJA 诱导的拟南芥气孔关闭的信号
转导过程，其作用机制可能是通过调节 MeJA 诱
导保卫细胞产生和积累 H2O 2 进行的。
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