全 文 ：植物生理学通讯 第 4 卷 第 l期 , 2 0 08 年 2 月
转几丁质酶基因的小麦后代遗传分析和抗病性鉴定
李新玲 , 徐香玲 ’ , 张楠楠
哈尔滨师范大学生命与环境科学学院 , 哈尔滨 15 0 0 2 5
提要 : 转 Ch i基因小麦的 T : 、 T : 及 T 3 代植株的遗传分析 、 抗白粉病鉴定和考察外源基因影响植株农艺性状的结果表明 ,
T . 和 T : 代中外源 ch i基因的分离比均接近 3: 1 , 符合孟德尔遗传规律 , so u th em bl ot 检测外源基因均为单拷贝整合 。 导入
Ch i基因的小麦对白粉病 田 间混合菌种的抵抗能力增强 。 除 了株高和生育期以外 , 转基因植株的其他性状与未转基因的植
株基本上相同 。
关键词 : 小麦 ; 几丁质酶基 因 ; 遗传分析 ; 白粉病
G e n etic A n a lysis a n d D isea se R e sista n c e Id e n tin c a tio n o f th e O fs Pr in g s o f
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e u m a es tiv u m ) w ith Ch i g
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T he re su lts in d ic a te d th at seg re g atio n r a tio o f
e x o g en o u s Ch i g
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E x o g
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Ch i g
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, e x c lu d in g Plan t h e ig ht an d Peri o d o f d u
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e a s e o m m o n o n e
’
5
.
K ey w o rd s : w h ea t : Ch i g
e n e : g e n e tie an alysis : Po w d e ry Ini ld e w
近十几年来 , 小麦育种学家们采用传统育种
手段己经培育出了很多抗病品种 , 但由于抗源单
一且病原生理小种太多 、 变异太快及育种周期偏
长和新小种不断出现而导致生产品种小麦的抗性丧
失 。 因此 , 如何拓宽小麦对白粉病等真菌病害的
抗源 , 尤其是采用基因工程技术将其他物种中的
抗真菌基因导入小麦 , 丰富小麦中的抗真菌病害
基因就成了人们关注的问题(吴成君等 2 0 0 5)。 本
文中采用的几丁质酶基因(e h irin a s e , c h i)来源于
菜豆 , 它编码 的几 丁质酶可 以水解真菌的细胞
壁 , 有效抑制真菌的生长和繁殖 。 迄今 , Chi 基
因转入农作物并可增强其抗病性己有所报道旧hfe ld
等 19 99 ; N ishiz aw a 等 1 99 9) , 但对于转基因植物
后代的遗传规律和抗病性的研究还较少 。 有报道
认为 , 外源基因在转基因小麦中符合 3 : 1 的分离比
(C h e n g 等 19 9 7 ; 叶兴国等 2 o 0 5 a , b ; 毕瑞明等
2 0 0 6 ; 丁文静等 2 0 07) , 但也有人认为偏离 3 : 1 的
分离 t匕归u 等 20 3 ; 徐琼芳等 2 0以 : G ao 等 20() 5 )。
本文将具有广谱真菌病抗性的 C hi 基因导入小麦
中 , 并在此基础上 , 对转基因小麦植株的 T , 、 T Z
和 T 3 代中外源基因的遗传 、 表达和抗白粉病能力
以及对农艺性状的影响作了鉴定 , 以期能够选育
出高抗白粉病且抗病性持久的小麦株系 。
材料与方法
小麦(Tri ric u m a e s riv u m L . )受体基因型 ‘东农
7 42
’ 由东北农业大学农学系小麦生理生物技术
室提供 。 于 2 0 0 3 年获得转 C hi 基 因的小麦植株 ,
前期遗传转化中所用到的发根农杆菌 R 10 0 O菌株
由日本筑波大学遗传子研究中心镰田博教授惠赠 ,
Ch i基因由中国科学院遗传研究所提供 , 重组质粒
pM LH7 1 3
一
c hi (含有 Ch i基因和NP tl 基因)由我校
生物系遗传学实验室构建(图 l) 。 T 。代转基因小麦
收稿
资助
2 0 0 7
一
1 0
一
2 2 修定 2 0 0 8 一0 1 一0 9
哈尔滨师范大学科研基金(K M 20 o6 一0 7) 和黑龙江省重大
攻关课题 (G A 0 6 B 一0 3 一 1 0 )。
通讯作者(E 一 m a il : x x ls7 6 一@ 1 2 6 . 。 o m : T e一: 0 4 5 1 -
8 6 8 4 0 5 7 0 )
。
植物生理学通讯 第 4 卷 第 l期 , 20 08 年 2 月
B amH I
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尸U卜于门立. 1陌幻子盗M了少
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实验结果
E C OR V
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一 / 户
图 l 质粒 pMLH 7 13 3一C hi 的T 一D N A 区示意
Fig
.
l Th e T
一
D N A sk e tc h m ap o f Pla slni d PML H 7 13 3
一
Ch i
种子播于温室花盆内 , 观察植株生长情况 , 收获
T l
、
T Z
、
T : 代的种子 。
根据外源基因的全长序列设计引物 。 C hi 基
因引物为 : 引物 1 , 5 ’ G CA G T G T G G A A G G CA A -
G CA G 3
, ; 引物 2 , 5 , C T G A G A G G T G A CAA G G T -
CA G 3
, 。
NP tl 基因引物为 : 引物 3 , 夕 G A A CG -
A C G C C C G G C C G A C A T C C 3
’ ; 引物 4 , 5 ’
CA CC CA A A G A CC G T CG A CC T G 3
’。 扩增条件
为 : 9 4 oC 5 m i n ; 94 oC 30 5 , 5 8 oC 3 0 5 (NP tl
基因是 6 0 ℃ ) , 7 2 oC 1 m in , 30 个循环 ; 7 2 oC
7 m in
。 扩增产物进行 0 . 8 % 琼脂糖凝胶电泳 。
s o u th e rn blo t检测时 , 以 pM LH 7 133 一Chi 重组
质粒为模板扩增出 Chi 基因片段 , 回收后经地高
辛标记作为杂交探针 。 转基因小麦基因组 D N A 经
B a m H I 酶切 、 电泳 、 转膜后 , 与 Chi 基因探针
进行杂交 , 然后洗膜 、 显色 。
NP
r刀 基因的酶联免疫检测 ( e n z ym e 一 li n k e d
im m u n o s o rb e n t a ss a y
,
E L I SA ) (试剂盒购自美国
A g d ia 公司)时 , 取 5 0 一 10 0 m g 小麦叶片 , 加入 5
倍体积的蛋白质提取液 , 充分研磨 , 再用抽提液
稀释 10 倍 , 每个酶标孔加入 10 0 林L 与抗体 4 ℃
下反应 , 24 h 后用 PB S T 冲洗酶标孔 5、6 次 , 充
分吸干后加入 10 0 林L PB ST 一M R S 酶祸联剂 , 室
温下放置 Z h , 再次洗涤 、 干燥 , 然后每个酶标
孔中加入 10 匹 T MB 底物 , 15 而n 后加入 50 林L
3 m of
.
L ’硫酸终止反应 。
鉴定白粉病抗性时 , 于孕穗期 , 采用叶片摩
擦法 (Li 等2 0 2) 将上一生长季于田间收集的白粉病
菌接种 , 灌浆初期白粉病发病充分时进行调查 。
白粉病调查标准采用盛宝钦等 ( 1 9 9 3) 改进后的
,’ 0 一 9 级 ” 法 。
I T , 代和 T : 代转基因植株的 p C R 检测
用Pc R 检测65 株T I代转基因小麦中的外源Ch i
基因和吻tI 基因 , 其中Ch i基因呈阳性的植株有
47 株 , 如 tH 基因呈阳性的植株有 4 9 株 , 这两个
基因在T , 代植株中的分离比分别为 2. 61 : 1和 3. 06 :l ,
符合孟德尔分离规律 。 选择 Ch i 基因和NP tl 基因
均呈阳性的T , 代小麦植株 , 收获 T Z代种子并单株
播种 , 成苗后以PC R 检测 lro 株 T : 代小麦的结果
(表 l) 表明 , 6 株 T , 代转基因小麦中有 1 株的自交
后代(T Z )表现为 10 0% 阳性 , 说明该株系已稳定不
再分离 , 其他 5 株 自交后代的分离比与理论预期
值 (3 : l) 差异的发生概率在 7 5 % 一9 5 % 之间 , 说明
上述实验结果和理论值是相符的 , 遵循孟德尔的
遗传分离规律 。
表 I T : 代转基因小麦的Pc R 检测
T ab le 1 PC R de te e ti o n o f T
Z tr a n sg e ni e w he at
株系 Ch i阳性 Ch i 阴性 分离比
6
一
2
6 一6
8
1 5
l3
l7
l4
l9
2
.
6 7 : l
全阳性
3
.
2 5 : l
2
.
8 3 : l
3
.
5 0 : l
2
.
7 1 : l
才检测
P> 9 5%
P> 8 0%
P> 9 0%
尸> 7 5%
P> 8 0%
046门z
0
内飞,1‘.且心
一心
、9
‘.1,l且
2 T l代和 T : 代转基因植株的 S o u th e m b lot 检fiIJ
转基因植株的 D N A 经 B a m H I 酶解 、 电泳后
转移到尼龙膜上 , 以地高辛标记的 Chi 基因为探
针 , 与尼龙膜上的酶解产物进行杂交的结果 (图 2)
显示 , 无论是 T I 代还是 T : 代转基因植株均明显表
现出杂交信号 , 而且都是单拷贝 , 阴性对照株无
杂交信号 。 这进一步验证了 PC R 检测的结果 。
3 NP tl 的 E LE A 检测
EL is A 检测的63 株 T , 代转基因植株中 , 阳性
植株有 4 6 株 , 阴性植株有 17 株 , NP tl 基因的分
离比为 2 . 7 1 : l , 这与 PCR 检测 、 S o u the r n blo t 检
测的结果基本上一致 。 说明外源Ch i基因在转基因
小麦后代中正常表达 , 未发生基因沉默现象 。
4 T 3 代转基因株系抗白粉病能力的鉴定
T 3 代纯合转基因株系在孕穗期接种 白粉病
菌 , 以未转基因植株为感病对照 , 调查发病的情
植物生理学通讯 第 44 卷 第 l期 , 2 00 8 年 2 月
图 2 转基因植株的 S o u th ern b lo t杂交
Fig
.
2 S o u the rn b lo t in g o f tra n sg e n ic Plan t
: 阳性对照 : 2 : 未转基因小麦 : 3 一 7 : 转基因小麦植株 。
况表明 , 灌浆初期转基因植株的白粉病病害均在
倒四叶以下 , 对结实并不产生影响 , 而未转基因
植株发病情况较严重 , 小穗部分也感染了白粉病
菌。 5 个转基因株系的反应型和发病率均明显下
降(表 2) , 都对白粉病表现高抗 。 说明导入 C hi 基
因的小麦抗白粉病 田间混合菌种的能力增强 。
表 2 T 3 代纯合系植株自粉病抗性鉴定
T ab le 2 Po w de ry m ilde w re s istan
e e ide n tifi e ati o n
o f T 3 ho m o z yg o u s Pla n t
株系 反应型 严重度 /% 发病率I%
八曰亡J0、0,工飞‘4劝.止6,‘l勺J,J‘东农 7 7 4 2 ’ ( 对照 )
Ch i
一
1
Ch i
一2
Ch i
一
3
Ch f
一
4
Ch i
一
5
5 0
l0
l0
l5
l0
2 0
5 T 3代转基因株系的主要农艺性状分析
调查 T 3代纯合系转基因小麦植株的株高、 穗
长 、 分孽数 、 千粒重 、 成熟期等性状 (表 3) 的结
果显示 , 转基因植株的株高均高于未转基因植
株 , 抗倒伏能力差 , 生育期均长于未转基因植
株 , 其他性状则与未转基因植株基本上相同 。
讨 论
采用基因工程技术提高小麦抗病性的关键点有
二 , 一是应向小麦转入 具有重要价值的功能基
因 , 二 是外源基因在转基因小麦中能稳定地遗传
和表达 , 且应是对小麦的主要农艺性状没有太大
的影响 。 本文所使用的外源基因属于 Cl as s l类碱
性 Chi 基因 , 它的抗真菌谱较广泛 , 且来源于植
物 , 生物安全性风险较小 。 迄今为止 , 人们已将
来自多种植物的Ch i基因转入油菜(Gri son 等 19 9 6) 、
桦木(P as o ne n 等 20 04) 等植物 , 并在防治真菌病害
中显现出抗病效应 。 由于植物自身具有独特的防
御系统 , 转入的外源基因常会发生丢失及不表达
等现象 , 根据本文结果 , 我们认为 , 外源基因
可能以单拷贝或寡拷贝的形式整合 , 转基因植株
的后代方可符合孟德尔遗传规律 , 并稳定地表达
出抗病蛋 白 , 是否 如此 , 尚应深入探讨 。
转基因植物中外源基因的遗传效应和遗传行为
比较复杂 , 许多情况下并不遵循经典的遗传规律
(王守才等 2 0 00) 。 本文结果表明 , 外源基因在转
基因小麦后代中均表现显性遗传 , 其遗传规律符
合 孟德尔分离比 , 没有发生外源基因的沉默现
象 , 且 T 3 代纯合转基因植株对白粉病田间混合菌
种的抵抗能力均有提高 。 此外 , 本文中转基因小
麦植株的株高和生长周期均有明显变异 , 其他性
状则与未转基因小麦植株基本上一致 , 但株高高
于未转基因小麦植株 , 这与徐琼芳等 (2 0 4 )报道的
转基因小麦植株普遍矮化的结果不一致 , 这是否
与外源基因的整合位置 、 拷贝数 、 小麦的品种 、
表 3 T 3 代纯合系小麦植株与未转基因植株的主要农艺性状比较
T ab le 3 T h e e o m Pari so n o n m aj o r a gr o n o lni e ehar ac te rs o f T
3 h o m o zyg o te w he at an d n o n
~
tr a n s g e n ie w he at
株系 株高 /c m 穗长 Ic m 分粟数 千粒重 /g 生长周期 /d
8 8
9 6
9 5
9 6
9 9
4-
t7只.
.⋯00少1八4,、内」,、4伟
‘ 东农 7 7 4 2 ’ ( 对照 )
Ch i一6
Chi
一
7
Chi
一
8
Ch i
一9
1 0 2 4
1 0 6
.
1
1 0 4
.
8
1 0 7
.
5
1 0 9
.
4
9
.
2
9
.
3
9
.
0
9
.
1
9
.
2
6 8 植物生理学通讯 第科 卷 第 1 期 , 2 0 08 年 2 月
基因的类型及转基因方法有关 , 也应深入研究 。
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c e to fu n g a l d ise a se s
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: 5 6 2 ~5 7 0