全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月 1073
杂交方法获得的拟南芥蔗糖转运蛋白基因SUC3/SUC5 双突变体及其PCR
鉴定
吴晓丹 张立军* 白雪梅 李敏 阮燕晔
沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳 110161
提要 文章以拟南芥 T-DNA 插入纯合突变体 atsuc3 和 atsuc5 为亲本，采用传统杂交技术与 PCR 鉴定相结合的方法获得
了 atsuc3/atsuc5 纯合双突变体。
关键词 拟南芥；atsuc3/atsuc5 双突变体；杂交；PCR
Acquired Sucrose Transporter Gene SUC3/SUC5 Double-mutant of Arabidopsis
thaliana by Cross and Its PCR Identification
WU Xiao-Dan, ZHANG Li-Jun*, BAI Xue-Mei, LI Min, RUAN Yan-Ye
College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China
Abstract In this research, we crossed T-DNA inserted mutants atsuc5 with atsuc3 to produce atsuc3/atsuc5
double-mutant and used PCR to identify homogeneous double-mutant. In addition, the problems of cross and
PCR process were discussed.
Key words Arabidopsis thaliana; atsuc3/atsuc5 double-mutant; cross; PCR
收稿 2006-08-08 修定　 2006-11-07
*通讯作者(E-mail: ljzhang@syau.edu.cn, Tel: 024-
88487163)。
蔗糖是植物光合作用中最先形成的游离糖，
也是光合产物运输的主要形式。蔗糖转运蛋白在
蔗糖的跨膜转运、分配和在库组织中的代谢等过
程中均起重要作用(Barker 等 2000；Dreyer 等
1999)。目前，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中
已经鉴定出 9 个蔗糖转运蛋白基因( A t S U C 或
AtSUT)序列，同属一个基因家族(http://www.
arabidopsis.org/info/genefamily/sucrose.html)。其
中，研究较多的是 AtSUC1 和 AtSUC2。已发现
AtSUC2定位于伴胞质膜中(Stadler和Sauer 1996);
而 AtSUC1主要在叶柄的筛管中表达，这可能与外
渗蔗糖的回收有关(Stadler等1999)。近年来，也
有关于AtSUC3 和 AtSUC4 的报道，前者在维管组
织附近的细胞和心皮细胞中表达，它可能具有促
使种荚开裂的功能(Meyer 等 2000) ；后者主要在
较小的叶脉中表达，此蛋白对蔗糖具有高亲和力
(Weise 等 2000)。目前，多用反向遗传学的方法
探索基因的表达规律，而对蔗糖转运蛋白生理功
能和基因家族中各成员之间相互关系的报道尚未
见，多基因突变体的获得则是后者得以进行的重
要前提。本文以atsuc3、atsuc5纯合单突变体(均
为 T-DNA 插入引起的突变)为亲本，采用传统杂
交法并结合PCR技术获得atsuc3/atsuc5纯合双突
变体。此种突变体可为反向遗传学方法研究蔗糖
转运蛋白基因功能及其基因家族中各成员之间的相
互关系提供实验材料，同时也表明用杂交技术获
得拟南芥多基因突变体是可行的。
材料与方法
材料为我们实验室从拟南芥生物资源中心
(Arabidopsis Biological Resource Centre, ABRC)提供
的编号为 SALK_092412 和 SALK_077715 拟南芥
(Arabidopsis thaliana)种子中分别筛选并扩繁得到
的atsuc5和atsuc3纯合单突变体种子(原种为Co-
lumbia-0型)，均为T-DNA插入倒置的突变体株系
种子。野生型(Columbia-0型)种子，由英国伯明
翰大学提供。
种子置于湿润滤纸上并于 4℃下春化 3~4 d
后，播种于盆土(营养土:草炭土:蛭石=1:1:1)中，室
内培养，温度18~25℃，相对湿度50%~80%，每
天10 h光照/14 h黑暗，光强约150 mmol·m-2·s-1。
亲本植株开花后，进行人工杂交。以atsuc5
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纯合单突变体为母本，atsuc3纯合单突变体为父
本。在解剖镜下，用镊子除去前一日开花的母本
的全部萼片、花瓣和雄蕊。若去雄花的雌蕊柱头
已有花粉，说明该雌蕊已授粉，不用作为杂交的
母本，即予以除去。对解剖镜下未见沾染其他花
粉的雌蕊于10 h后再观察，若柱头毛失去光泽并
开始萎蔫，则说明该雌蕊已授粉，也予以除去。
若柱头毛密集、润泽，表明该雌蕊未接受其他花
粉，即用作为杂交的母本。操作时，用镊子挑
取父本的雄蕊，在解剖镜下将花粉涂布在母本柱
头上，注明杂交亲本的代码。通常柱头授粉10 h
后柱头毛开始萎蔫，3 d 后种荚即伸长，据此判
定杂交成功与否。杂交成功后，将母本植株的其
他花蕾除去，杂交的种荚变黄时，收获 F1 种子。
对F1 植株进行PCR检测，确认杂交成功的F1进行
自交，收获 F 2 种子。
PCR 法检测时，采用杨双等(2005)的方法提
取拟南芥幼苗的总 D N A，用作 P C R 的模板。参
考李敏等(2006)对拟南芥 T-DNA 插入突变体的
PCR 鉴定方法，进行检测和筛选。PCR 引物设计
参照SIGnAL的相关资料(http://signal.salk.edu/
isectprimers.html)。AtSUC5基因引物和T-DNA的
引物 L B a l由上海博亚生物技术有限公司合成，
AtSUC3基因引物由北京三博远志生物技术有限公
司合成。PCR 反应总体系均为 20 mL：1 mL 模
板、引物各1 mL (20 mmol·L-1)、0.4 mL dNTPs
(10 mmol·L-1)、2 mL 10×PCR 缓冲液、3.6 mL
MgCl2 (25 mmol·L-1)、1 U Taq-DNA聚合酶、10.8
mL ddH2O。反应程序为：94℃变性5 min；94℃
变性 1 min，退火 1 min，72℃延伸 2 min，35
个循环；再于 72℃延伸 7 min。
通过2次引物不同的PCR (分别称为PCR 2和
PCR 3，同样的名称和体系也用于下述对 F2 群体
的筛选)，对 F1 植株进行检测，以确定杂交结果。
PCR 2的引物为AtSUC5基因的LP (5 gcaaataatt-
agaattttctcgca 3)和RP (5 tcaaagtcttttcttgttaatgtgg
3)，对目的基因 AtSUC5 进行扩增。杂交母本为
atsuc5纯合突变体，其AtSUC5基因由于已插入了
T - D N A，P C R 结果为阴性，但杂交成功后，F 1
从父本处获得未突变的 AtSUC5 基因，因而 PCR
结果呈阳性，而未杂交成功的 F1，无 PCR 产物。
PCR 3的引物为T-DNA的 LBa1 (5 tggttcacgta-
gtgggccatcg 3)和AtSUC3基因的LP (5 tcgacaccg-
agtcactcatcg 3)，目的是检测AtSUC3基因中是否
含有插入的 T-DNA，用以验证 PCR 2 的结果，从
而防止假阳性的出现。母本atsuc5纯合突变体的
AtSUC3 基因中未插入 T-DNA，因而对于未杂交
成功的 F1 来说，无 PCR 产物，但杂交成功的 F1
可从其父本atsuc3纯合突变体中获得插入T-DNA
的 AtSUC3 基因，因而PCR 结果呈阳性。2次 PCR
的退火温度分别为 50 和 58℃。
PCR筛选F2植株时，通过4次引物不同的PCR
(分别称为 PCR 1、PCR 2、PCR 3 和 PCR 4)从
F2 群体中筛选出纯合双突变体。PCR 1 的引物
为AtSUC3基因的LP和RP (5 tcaccttcacaatcac-
acaca 3)，以检测在F2群体中是否存在AtSUC3基
因的纯合插入，无扩增产物的植株用于下一轮筛
选；PCR 2的目的是检测F2群体中是否存在AtSUC5
基因的纯合插入，对两轮 PCR 均无扩增产物的植
株进行下两轮验证；PCR 3和PCR 4 (引物为LBa1
和 AtSUC5基因的 LP)，分别确证T-DNA在 AtSUC3
和 AtSUC5基因中的插入情况，进一步验证PCR 1
和 PCR 2的结果。PCR 1和 PCR 4退火温度分别为
50和58℃。本文为便于说明F2 所有可能的PCR结
果及基因型，在实验过程中仍保留了非目标株。
以琼脂糖电泳检测 PCR 产物时，用 1.7% 琼
脂糖凝胶(内含0.5 mg·mL-1 Goldveiw)检测扩增结
果，于波长300 nm处观察，照相记录。所用DNA
分子量标准为GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus
(MBI，购自上海生物工程有限公司)。
实验结果
1 F1植株的PCR检测
图1显示 ：(1)泳道2和3分别为野生型和atsuc3
纯合单突变体，其 AtSUC5 基因未突变，可见条
带清晰的扩增产物，分子大小介于900~1 031 bp
之间；泳道4为atsuc5纯合单突变体，其AtSUC5
基因由于插入了 T-DNA 而无扩增产物；泳道 5 和
6显示出AtSUC5 基因特有的扩增条带，因而判断
这 2 个植株已通过杂交，从父本获得了未突变的
AtSUC5 基因；泳道 7 无扩增产物，说明杂交未
成功(图1-a)。(2)泳道2和4无扩增产物，说明野
生型和atsuc5纯合单突变体的AtSUC3基因中无T-
DNA 插入；泳道3为 atsuc3 纯合单突变体，有条
带清晰的扩增产物，分子大小介于600~700 bp之
间；泳道 5 和 6 的 PCR 结果呈阳性，因而判断这
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2 个植株已通过杂交从父本获得插入了 T-DNA 的
AtSUC3 基因；泳道 7 无扩增产物，说明杂交未
成功(图 1-b)。
2 F2植株的PCR筛选
图 2 显示：(1)泳道 6~9、11、12 的 F2 和泳
道 2 的野生型可见清晰的产物条带，产物分子大
小为900 bp 左右，说明它们的AtSUC3 基因未突
变；泳道4、5、10 的 F2 与泳道 3的 atsuc3 纯合
突变体均无条带，说明这些 F2 的 AtSUC3 基因发
生了突变，其中可能含有双突变体(图2-a)。(2)泳
道 5、7、8、10~12 的 F2 和泳道 2 的野生型可见
清晰的产物条带，产物分子大小介于900~1 031 bp
之间，说明它们的 AtSUC5 基因未突变；泳道 4、
6、9的F2与泳道3的atsuc5纯合突变体一样无条
带，说明这些 F2 的 AtSUC5 基因发生了突变，其
中可能含有双突变体(图 2-b)。(3)泳道 6、8、12
的F2和泳道2野生型无大小介于600~700 bp之间
的 PCR 产物，说明无 T-DNA 插入到 AtSUC3 基因
中；泳道4、5、7、9~11的 F2 和泳道 3的 atsuc3
纯合突变体有 PCR 产物，说明 AtSUC3 基因中插
入了T-DNA (图 2-c)。(4)泳道 5、7、12 的 F2 和
泳道 2 的野生型无 PCR 产物，说明无 T-DNA 插
入到 AtSUC5 基因中；泳道 4、6、8~11 的 F2 和
泳道 3 的 atsuc5 纯合突变体有 PCR 产物，说明
AtSUC5 基因中插入了 T-DNA (图 2-d)。
通过上述 PCR 1、2 的筛选和 PCR 3、4 的
验证，可知图 2 中泳道 4 因无 AtSUC3 和 AtSUC5
基因的 PCR 产物，且 T-DNA 插入情况的验证结
果呈阳性，确定其为AtSUC3/AtSUC5 基因的纯合
双突变体(表 1的 b型)。其余的F2 也可通过对比
图1 F1植株PCR检测的电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR products of F1
1：D N A 分子量标准；2：野生型；3：a t s u c 3 纯合单突变体；4：a t s u c 5 纯合单突变体；5 ~ 7：F 1。
图2 F2植株PCR筛选的电泳图谱
Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR products of F2
　　a 、c 中，1 ：D N A 分子量标准；2 ：野生型；3 ：a t s u c 3 纯合单突变体；4 ~ 1 2 ：F 2。b 、d 中，1 ：D N A 分子量标
准；2 ：野生型；3：a t s u c 5 纯合单突变体；4 ~ 1 2 ：F 2。
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表1确定相应的基因型；泳道5对应c，为atsuc3
纯合单突变体；泳道6对应 d，为 atsuc5 纯合单
突变体；泳道 12 对应 a，为野生型；泳道 7~10
分别对应 e~h，基因型为一对纯合和一对杂合；
泳道 11 对应 i，即同 F1 的基因型，为双杂合。
表1 基因型与PCR检测的对比
Table 1 Contrast between genotypes and PCR identifications
基因型 PCR 1 PCR 2 PCR 3 PCR 4
a + + - -
b - - + +
c - + + -
d + - - +
e + + + -
f + + - +
g + - + +
h - + + +
i + + + +
　　 ：AtSUC3； ：AtSUC5；Ñ：T-DNA；+：有
P C R 产物；- ：无 P C R 产物。
雄配子可能的组合方式中，有 4 种组合的基因型
是纯合的，即为野生型、atsuc3单突变体、atsuc5
单突变体和atsuc3/atsuc5双突变体。因此，在F2
群体中筛选出atsuc3/atsuc5双突变体的概率为
1/16。虽然概率不高，但只要筛选得到 1 株双突
变体，其产种量即足以满足实验需要。
如果试验无需保留和分辨非双突变体植株，
则通过每次的 PCR都可以及时排除非目的植株，
以减少进行下一组 PCR时的工作量。鉴定 F2群体
时，一般通过 PCR 1和 PCR 2就能将纯合双突变
体筛选出来，本文结果中只有纯合双突变体在这2
次电泳检测中都不会出现条带，但由于 PCR方法
本身的原因，以及为避免 PCR 1和 PCR 2出现假
阳性结果起见，应分别用 PCR 3和 PCR 4来验证
它们的真实性。用双 PCR方法检测 F1，也是出于
这一考虑。这除能防止 PCR出现假阳性外，通过
对 F2群体 4张电泳图谱的比较，还可以分辨出所
有 F 2的基因型。
参考文献
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讨　　论
拟南芥为长日植物，长光照下提早开花(韩
玉珍等1998)，因此用作杂交的植株其光照时间不
宜过长，以免营养生长不充分，这样开出的花较
小，不易进行杂交操作。去雄时只要不损伤雌
蕊，即使去除全部的花瓣和萼片，也不影响杂交
的进行。每个花序轴上所开的第 1~2 朵花，通常
是不结实的，不宜用其杂交，以后生长的几朵花
方适于杂交。另外，随着植株的衰老，花逐渐
变小，杂交的成功率下降。几个杂交种荚中的 F1
种子即足以满足实验需要，所以一旦确定杂交成
功，即可将母本植株的其他花蕾除去，以避免花
粉和种荚的混杂，并保证杂交种荚能够得到足够
的营养而可充分发育。
A t S U C 3 和 A t S U C 5 基因分别位于拟南芥
(2n=10)的第 1 和第 2条染色体上(http://www.
arabidopsis.org/info/genefamily/sucrose.html)，因
此在F1自交产生F2的过程中，符合孟德尔的独立
分离规律，即在减数分裂形成配子时，每对同源
染色体上的每一对等位基因发生分离，而位于非
同源染色体上的基因间可以自由组合。F2 代群体
中共有9种基因型(表 1)。在 F1 所产生的16种雌