全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第1期，2006年2月 43
转TrxS基因啤酒大麦种子中硫氧还蛋白h与淀粉酶活性变化
尹钧* 卫丽 姜玉梅 孔维威 任江萍 李磊
河南农业大学，国家小麦工程技术研究中心，郑州 450002
提要 导入 TrxS 基因后，转基因大麦籽粒的硫氧还蛋白 h 活性明显提高；淀粉酶活性也明显提高，其中 a- 淀粉酶活性在
开花后 30 d 提高了 3 倍以上，随着籽粒的发育，转基因对 a- 淀粉酶活性影响作用减少，对 b- 淀粉酶活性的影响有同样
的趋势；转基因大麦种子发芽势明显提高。说明 TrxS 基因有望改善啤酒大麦的制麦特性和品质特性。
关键词 转基因大麦; 硫氧还蛋白h; 淀粉酶活性
Changes in Thioredoxin h and Amylase Activities in Malting Barley (Hordeum
vulgare L.) Seeds with Transforming TrxS Gene
YIN Jun*, WEI Li, JIANG Yu-Mei, KONG Wei-Wei, REN Jiang-Ping, LI Lei
National Engineering Research Center for Wheat, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract The results indicated that the induction of TrxS gene into the malting barley (Hordeum vulgare L.)
plants increased the activity of amylase and thioredoxin h (Trxh) content in transgenic barley seeds, suggesting
over-expression of the TrxS gene in the transgenic barley. The activity of a-amylase was trip lication more than
that of control after anthesis for 30 d and its effect became weaker with seed development. There was the same
trend for b-amylase. The germination energy of transgenic barley seeds was obviously increased. These results
suggested that transgene could improve the quality of malting barley.
Key words transgenic barley (Hordeum vulgare L.); thioredoxin h; amylase activity
收稿 2005-07-11 修定 　 2005-11-21
资助 国家自然科学基金(30370877)和国家转基因植物研究与
产业化专项(JY03-B-19)。
* E-mail: xmzxyj@126.com, Tel: 0371-63558203
影响我国啤酒大麦生产发展的主要因素之一
是国内啤酒大麦品质较差(张五九 2002)，因此，
改善啤酒大麦的品质性状显得很迫切。而基因工
程技术可能是解决此问题的有效途径。
硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是一类广泛存在
于生物体内的多功能活性蛋白，分子量约为 1 2
kDa，含有一个氧化还原活性的二硫键，可通过
还原靶蛋白中的二硫键参与细胞包括酶活性的调节
(Holmgren 1989；Arnér和Holmgren 2000)、转录
因子的调控(Schenk等1994；Hirota等1999；Chae
等 1994)等在内的一系列生化反应。据报道，Trx
也能还原种子中一些蛋白质分子的二硫键，如小
麦 a- 淀粉酶抑制蛋白，大麦 a- 淀粉酶抑制蛋白
等，从而削弱这些抑制蛋白对淀粉酶的抑制作
用，进而提高淀粉酶的活性(Chae 等 1994；魏凌
基等2004)。而大麦的主要品质指标如糖化力、浸
出率和库而巴哈值等均与淀粉酶的活性有关，如
果能提高种子的淀粉酶活性，则种子的发芽势将
会提高，种子的碳、氮代谢增强，从而改善大
麦的品质。
为此，我们用基因枪转化方法将蓝色黑鸭草
(Phalaris coerulescens L.)中的硫氧还蛋白S 基因
(TrxS，与硫氧还蛋白h基因有94%的同源性，蛋
白质表达产物与之有相同的生物活性) (Li等1995)
导入啤酒大麦，获得了可稳定遗传并能正常表达
的转基因大麦(任江萍等 2004；Wei 等 2005)。
材料与方法
以转TrxS基因大麦(Horrdeum vulgare L.)和未
转化的大麦品种‘晋引 6 号’(对照)为材料，于
2003~2005 年播种于河南农业大学试验农场。
参照Cho等(1999)的方法制备Trxh。将转基
因大麦籽粒的胚除去，研磨粉碎后取 0.5 g 加入
2.5 mL提取液(50 mmol·L-1 Tris-HCl 缓冲液，pH 8.0，
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1 mmol·L-1 EDTA, 0.5 mmol·L-1 PMSF)振荡浸提
2 h，于 4℃下以25 000×g 离心20 min，取上清
液。重复提取 1 次，合并上清液，用 H C l 调到
中性，加入(NH4)2SO4 盐析，离心去除 30%~90%
相对饱和度时析出蛋白质后，取上清液。上清液
经蔗糖溶液透析除盐后，透析袋埋在干燥的交联
葡聚糖凝胶G-50 (Sephadex G-50)中吸水浓缩(4℃
下)，定期更换Sephadex G-50。浓缩后的提取液
于65℃水浴中处理15 min, 于4℃下以25 000×g离
心，收集上清液作为 Trxh 样品，于 -20℃下保
存。在反应缓冲液(100 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液，
pH 7.0，含 2 mmol·L-1 EDTA)中依次加入20~40
mL 样品、牛胰岛素(终浓度为 0.13 mmol·L-1)、
DTT(终浓度为0.33 mmol·L-1)后混匀，于25℃下
反应10 min，用UV-2000紫外分光光度计测定650
nm 吸光值(OD650)，每 5 min 记录 1次，在相同时
间内 OD 值的高低代表 Trxh 的活性大小。
淀粉酶活性的测定是开花后30 d取未成熟的
大麦籽粒，每 5 d 1 次，共 5次，以浸种1 d 未
发芽的籽粒和发芽3 d的籽粒为材料(包括转基因种
子和非转基因种子)。取0.5 g不同处理的种子置
于研钵中，加少量蒸馏水和石英砂，研磨成匀浆
后加蒸馏水 5 mL·g-1，继续研磨 5 min，常温下
静置60 min后,于4℃下以15 000×g离心10 min，
取上清液作为总淀粉酶提取物。用DNS (3,5- 二
硝基水杨酸)法测定 a- 淀粉酶活性(Cui等 2002)，
取20 mL总淀粉酶提取物于70℃中加热15 min后
与 80 mL 1% 的淀粉溶液混合，于 37℃下反应5
min 后迅速加入 DNS 溶液，置于沸水浴中 5 min
显色，再以水稀释至 10 mL，用 UV-2000 紫外分
光光度计在波长 520 nm 处比色，求出还原糖含
量，并计算出 a- 淀粉酶活性。活性单位(mg ·g-1·
min-1)按 1 g植物材料于1 min内水解淀粉产生的
麦芽糖量(mg)计算。另取20 mL 总淀粉酶提取物
加入2 mL 0.5 mol·L-1的EDTA溶液混匀使a-淀粉
酶失活(Tuomas和Christiane 1989)，其它步骤同
a- 淀粉酶活性的测定，求出 b- 淀粉酶活性。以
不加酶提取物的反应为对照。
测定发芽势时，先将种子进行表面消毒，用
70% 的酒精浸泡 1 min 后以无菌水冲洗 3 次，再
用0.1%的 HgCl2 浸泡 5 min，以无菌水冲洗3次。
经表面消毒和浸种处理后的种子置于24℃培养箱
中发芽，连续 3 d 的观察记录发芽情况。
实验结果
1 转基因大麦种子中Trxh活性变化
测定结果表明(图1)，虽然转基因与未转基因
种子都表现 Trxh 活性，但 Trxh 催化活性出现的
时间和强度上明显不同。转基因种子在10 min后
表现出活性，未转基因的则在 25 min 以后才出
现；转基因种子Trxh的活性明显高于未转基因种
子的活性。说明由于TrxS基因编码蛋白具有Trxh
活性，TrxS基因的导入与表达可显著增强Trxh的
活 性 。
2 转基因大麦籽粒中淀粉酶活性变化
表 1 表明，在开花后 30 d 到种子成熟过程
中，a- 淀粉酶活性的变化为先升后降，开花后
40 d时 a-淀粉酶活性达到最高；而 b-淀粉酶活
性的变化趋势是随着种子成熟的进程不断提高，
成熟期达到最高。转基因与未转基因大麦种子中
淀粉酶活性变化趋势完全一致。各个时期转基因
大麦种子淀粉酶活性明显地高于未转基因的，表
明转TrxS基因对提高a-淀粉酶和b-淀粉酶活性都
有明显的促进作用。由表 2 还可以看出，种子完
全成熟后转TrxS基因的淀粉酶活性仍有提高，在
未发芽种子中a-淀粉酶活性提高12.5%，b-淀粉
酶活性提高 9.4%；发芽 3 d 的种子中 a- 淀粉酶
活性提高 11.6%，b- 淀粉酶活性提高 13.7%。这
对提高种子发芽势和改善麦芽品质特性是有利的。
图1 转基因与未转基因大麦种子中Trxh活性比较
Fig.1 Comparison on Trxh activities in transgenic
and non-transgenic barley seeds
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3 转基因大麦种子的发芽率变化
由图2 可以看出，转基因大麦籽粒在发芽的
第 1、2、3 天中发芽率分别为 40%、72%、90%，
分别为未转基因大麦籽粒的 2 6 7 % 、1 4 1 % 和
119%。表明转 TrxS 基因种子的发芽启动快、发
芽率高。
讨　　论
本文中所用的TrxS基因与Trxh基因同属Trx
家族，与小麦的 Trxh 基因有 94% 的同源性，其
表达产物也有Trxh 的生物活性(Li 等 1995)。因
此，TrxS基因的导入将会产生Trxh基因的过表达
效应，从而导致转基因大麦籽粒的 Trxh 活性提
高。我们所用的转TrxS基因大麦籽粒的Trxh活性
明显提高，这与Cho等(1999)将小麦Trxh基因导
入大麦后产生 Trxh 基因过表达的结果相似。
无论成熟种子或未成熟种子，TrxS基因都能
提高大麦籽粒淀粉酶活性(包括a-淀粉酶和b-淀粉
酶活性)。这与Wong等(2002)的 Trxh活性上升的
大麦种子中a-淀粉酶活性提高的结果似乎是一致
的。成熟的大麦籽粒中 b- 淀粉酶活性高于 a- 淀
粉酶活性，这又与徐绍英和徐新宇(1999)认为 b-
淀粉酶是大麦中最为丰富的淀粉水解酶的看法一
致。
还有，本文中转基因大麦种子的发芽率比未
转基因的高，这既是基因导入效应的一个印证，
也说明采用转TrxS基因技术可能有助于改善啤酒
大麦的制麦特性。另外，根据林亚康和俞志隆
(1990)的大麦籽粒中碳氮代谢直接影响大麦品质特
性，以及糖化力高低主要取决于b-淀粉酶的活性
的结果，可以认为采用转基因技术获得转基因大
麦新品系改善啤酒大麦品质是有可能的。
表1 转基因与未转基因的大麦开花后种子中淀粉酶活性变化的比较
Table 1 Comparison on changes in transgenic and non-transgenic barley seeds after anthesis
开花后 a-淀粉酶活性 /mg·g
-1 (FW)·min-1 b-淀粉酶活性 /mg·g-1 (FW)·min-1
时间/d 未转基因大麦 转基因大麦 活性增加/% 未转基因大麦 转基因大麦 活性增加/%
30 3.8 15.4 305.3 2.1 3.7 76.2
35 15.1 53.5 254.3 3.2 4.3 34.4
40 42.4 63.0 32.7 4.0 5.2 30.0
45 11.0 12.6 14.5 4.8 6.3 31.2
50 5.4 6.2 14.8 11.6 17.0 46.6
表2 转基因与未转基因大麦成熟种子中淀粉酶活性比较
Table 2 Comparison on amylase activities of transgenic and non-transgenic seeds in ripening barley
a-淀粉酶活性 /mg·g-1 (FW)·min-1 b- 淀粉酶活性 /mg·g-1 (FW)·min-1
种子类别
未转基因大麦 转基因大麦 活性增加/% 未转基因大麦 转基因大麦 活性增加/%
成熟种子 4.8 5.4 12.5 32.0 35.0 9.4
发芽种子 11.2 12.5 11.6 78.7 89.5 13.7
图2 转基因与未转基因大麦种子的发芽率比较
Fig.2 Comparison on seed germination rate of
transgenic and non-transgenic barley
植物生理学通讯 第42卷 第1期，2006年2月46
参考文献
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