全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 443
粳稻 SRAP分子标记遗传群的构建与分析
张丽1，姜树坤1，张喜娟2，李丽1，郭志富1，马慧 1，陈丽静1，王学英1，徐正进2，钟鸣1,*
沈阳农业大学 1辽宁省农业生物技术重点实验室，2辽宁省北方粳稻育种重点实验室，沈阳 110161
提要：用超级稻品种‘沈农 606’和普通粳稻‘丽江新团黑谷’为亲本杂交获得的 102份 F2代单株，通过 SRAP分子标
记遗传分析，构建了包含14个连锁群，由129个多态性位点组成的水稻连锁图谱，此图谱覆盖基因组长度1671.5 cM，平
均图距 13.0 cM。连锁群上有 17.2%的多态性位点表现偏分离，偏分离标记在连锁群上存在热点区域。
关键词：粳稻；遗传图谱；相关序列扩增多态性
Construction and Analysis of a SRAP Molecular Genetic Map of japonica
Rice (Oryza sativa L. sp. japonica)
ZHANG Li1, JIANG Shu-Kun1, ZHANG Xi-Juan2, LI Li1, GUO Zhi-Fu1, MA Hui1, CHEN Li-Jing1, WANG Xue-Ying1, XU
Zheng-Jin2, ZHONG Ming1, *
1Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Liaoning Province, 2Key Laboratory of Rice Breeding of Liaoning Province,
Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China
Abstract: A molecular genetic map of rice (Oryza sativa) was constructed with a 102 F2 population from a
cross of two rice cultivars ‘Shennong 606’ and ‘Lijiangxintuanheigu’ by using SRAP markers. The map con-
sisted of 14 linkage groups, which include 129 genetic markers, and covers 1671.5 cM with an average genetic
distance of 13.0 cM. A total of 17.2% distorted markers distributed in the map as Segregation Distortion
Regions.
Key words: rice (Oryza sativa); molecular genetic map; sequence related amplified polymorphism (SRAP)
收稿 2007-01-11 修定　 2007-04-26
资助　 辽宁省重点实验室专项资金计划、沈阳农业大学青年基金。
* 通讯作者(E-mail：zhming@syau.edu.cn；Tel： 024-
8 8 4 8 7 1 6 4 )。
遗传图谱既是遗传学研究的内容，又是作物
育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据和基
础。近年来，分子标记的迅速发展极大地促进了
水稻遗传图谱的构建，自McCouch等(1988)建立
第一张水稻的 RFLP标记连锁图(135个标记)以
来，其染色体上的标记数不断增多，据日本水稻
基因组计划研究项目发表的水稻新连锁图，已定
位的标记达 2 275个(Sakata等 2000)。McCouch等
2002年又发表了新增的 2 240个 SSR标记。但目
前构建图谱所用的群体主要是亚种间杂交得到的群
体，少数为籼—籼交群体，至今仍未发现使用两
粳稻为亲本材料的连锁图谱的报道。本文尝试采
用超级粳稻和地方特异粳稻材料构建图谱，为研
究超级粳稻高产的机制提供参考，同时为进一步
将地方种质优良基因导入超级稻品种建立基础；
目前，SRAP标记已经应用于马铃薯、苹果、辣
椒、樱桃、梅子、油菜、大蒜、莴苣、芹菜、
棉花以及柑橘类果树等植物的研究(林忠旭等
2003；任羽等 2004；Li等 2003；Riza等 2001)，
本文将 S RAP 用于水稻连锁群的构建，以探讨
SRAP在水稻中应用的可行性。
材料与方法
材料为超级粳稻(Oryza sativa L. sp. japonica)
品种‘沈农 606’(本校徐正进先生惠赠)和普通粳
稻品种‘丽江新团黑谷’(本校植保学院刘志恒先
生惠赠)。2004年以两品种为亲本配制杂交组合，
F1自交获得 F2代群体。
基因组DNA的提取采用 CTAB法(奥斯伯等
2005)。
引物采用 Li和Quiros (2001)已发表的引物组
合：me1~me10/em1~em11，共计 110对，引物
由北京赛百胜生物公司合成(表 1)。PCR扩增总体
积为 15 µL，包括 25 ng DNA模板、引物各 0.3
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µmol·L-1、200 mmol·L-1 dNTP、1 U Taq DNA聚
合酶、2.5 mmol·L-1 Mg2+，不足部分用双蒸水补
充。扩增程序参照 Li和 Quiros (2001)文中的方
法：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，
72 ℃ 2 min，5个循环；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1
min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 5 min。
扩增产物用 6 % 的变性聚丙烯酰胺凝胶分
离，电泳缓冲液为 0.5×TBE。电泳时，先用 70
W预电泳至 50 ℃，上样后用 50 W恒功率电泳至
二甲苯青为胶板的2/3处，电泳过程中确保胶板温
度不高于 55 ℃以免玻璃板破裂。电泳后采用银染
法进行染色(Panaud等 1996)。多态性位点的命名
采用“引物组合 + 标记片段长度”的方法，如
“M4E3-600”表示引物组合me4和 em3，“600”
表示该标记片段长度为 600 bp。
根据聚丙烯酰胺电泳谱带结果，将其转换为
数据结果；共显性位点的记载，与父本‘沈农
606’相同的带型记为 A，与母本‘丽江新团黑
谷’相同的带型记为 B，杂合(F1)带型记为H，缺
失或模糊记为 -。显性位点的记载，相同于‘沈
农 606’的纯合带型(无带)记为 A，和 F1相同的
其他纯合或杂合带(有带)型记为 C，相同于‘丽
江新团黑谷’的纯合带型(无带)记为 B，和 F1相
同的其他纯合或杂合带型(有带)记为 D，缺失或
模糊带型记为-。对所有 F2单株带型按孟德尔分
离比 3:1 (共显性标记按 1:2:1)进行 χ2检验，分析
标记是否偏分离。
应用Mapmaker/exp 3.0软件(Lander 1993)在
PC机上构建连锁图谱，先用Group命令进行标记
间连锁分组(LOD=3，最大图距 50 cM)，然后用
Order和 Ripple命令进行排序，用 Try和 Build命
令插入标记。采用Kosambi函数将重组率转换成
图距单位(cM)。
实验结果
1 SRAP标记的多态性筛选
用 110对 SRAP引物组合在 2个亲本间进行
PCR扩增，其中 35对引物能在两亲本间检测到多
态性，约占所用引物对的 31.8%。35对引物共扩
增出 1 683个位点，平均每对组合扩增出 48个位
点，其中多态性位点 143个，平均每对组合扩增
出 4.09个多态性位点，占总位点数的 8.5%，集
中在 550~900 bp之间；显性位点 109个，占76.2%，
共显性位点 34个，占 23.8% (图 1)。
2 偏分离位点的分布
143个多态性位点中有 24个位点在F2群体中
的分离显著或极显著地偏离了理论比值而表现异常
分离，比率为 16 .8%，其中呈极显著性的有 21
个，比率为 14.7%。这些偏分离位点中偏向‘沈
农 606’(A)基因型的有 11个，比例为 45.8%；
偏向‘丽江新团黑谷’(B)基因型的有 12个，比
例为 50%；仅有 1个都是偏杂合体类型(H)，比
例为 4.2%。在所有引物对中，以me2为前引物
和以 em5、em6为后引物的引物组合表现出偏向
‘丽江新团黑谷’偏离程度最高，其占偏分离位
点的频率分别为 25%、16.7%、16.7%，以me4
表 1 实验所用的 SRAP引物
Table 1 The SRAP primers used in the experiment
引物编号 序列(5→ 3) 引物编号 序列(5→ 3)
me1 TGAGTCCAAACCGGATA em1 GACTGCGTACGAATTAAT
me2 TGAGTCCAAACCGGAGC em2 GACTGCGTACGAATTTGC
me3 TGAGTCCAAACCGGAAT em3 GACTGCGTACGAATTGAC
me4 TGAGTCCAAACCGGACC em4 GACTGCGTACGAATTTGA
me5 TGAGTCCAAACCGGAAG em5 GACTGCGTACGAATTAAC
me6 TGAGTCCAAACCGGTAA em6 GACTGCGTACGAATTGCA
me7 TGAGTCCAAACCGGTCC em7 GACTGCGTACGAATTCAA
me8 TGAGTCCAAACCGGTGC em8 GACTGCGTACGAATTCTG
me9 TGAGTCCAAACCGGTAG em9 GACTGCGTACGAATTCGA
me10 TGAGTCCAAACCGGTCT em10 GACTGCGTACGAATTCAG
em11 GACTGCGTACGAATTCCA
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为前引物的引物组合表现出偏向‘沈农 606’偏
离程度最高，其频率为 16.7%。
3 遗传图谱的构建
应用在 F2群体中按 3:1或 1:2:1分离的 120个
SRAP位点进行连锁分析，得到 1张包含 14个连
锁群的遗传图谱框架，其中包括 92个显性位点，
28个共显性位点。然后在连锁群图距增加不大于
10 cM 的条件下，将偏分离位点逐个进行插人，
最终插人偏分离位点 9个。最后得到 1张由 129个
SRAP位点组成的粳稻连锁图谱(图 2)，该图谱覆
盖长度 1 671.5 cM ，平均图距 13.0 cM。每个连锁
群上的位点数在 3~15个之间，连锁群长度在 27.8~
226.1 cM范围内。
从连锁分析可以看出，偏分离的位点被分别
定位到两个连锁群，在每个连锁群上各有 1个偏
分离的热点区域(segregation distortion regions，
SDR)，在 9号连锁群上，M2E4-850、M1E7-
600、M7E5-600、M2E5-650所在的位点形成了
第 1个 SDR，暂命名为 SDR1；在 13号连锁群
上，M10E8-1000、M4E3-800、M4E1-900所在
的位点形成了第 2个 SDR，暂命名为 SDR2。13
号连锁群上的M4E1系列引物有共分离的趋势。
1 3 号连锁群上的偏分离位点偏向于‘沈农
606’，而 9号连锁群上的偏分离位点偏向于‘丽
江新团黑谷’。这两个 SDR位点与已经定位的偏
分离位点的关系有待进一步研究。
讨　　论
SRAP标记是一种基于PCR的新型的分子标记
技术，与其他几种分子标记相比，其在水稻基因
定位和克隆中有较高的应用价值。首先，它的引
物设计简单，17 bp的正向引物、18 bp的反向
引物以及50 ℃的退火温度都可保证其扩增结果的
稳定性。经多次体系优化实验证明 SRAP标记的
扩增产物重复性高，受反应条件影响小，能够保
证实验结果的准确性。其次，SRAP标记合成引
物的费用低，扩增产物多态性高且在基因组上分
布均匀，这些特点都可大大降低实验成本及劳动
强度。再次，SRAP有较高的多态性，SSR标记
在本文中的两亲本间的多态性情况为平均为每5对
引物中能筛选出 1个多态位点(私人通讯)。最重要
的是Li和Quiros (2001)对SRAP标记的测序结果表
明多数标记为外显子区域，这为农艺性状基因的
克隆提供了一条捷径。本文所构建的图谱中位点
间距较大，这可能是由于所选亲本同为粳稻，亲
缘较近引起的。
关于本文中的14个连锁群与水稻12条染色体
的锚定关系，我们提出两种锚定策略：其一，用
已经有固定染色体位置的分子标记进一步增加图谱
密度并进一步将 14个连锁群锚定于染色体上，目
前能满足要求的分子标记有 RFLP和 SSR两种，
RFLP操作复杂，我们认为 SSR应该是一个较好
的选择，但本文所用的两个亲本都是粳稻，所以
可能筛选到足够数量标记是一个瓶颈；其二，我
们在每个连锁群上随机选择 3个标记位点，对其
相应片段进行测序，将测序结果与已经完成测序
的粳稻品种‘日本晴’的序列数据比对后完成锚
定，此步工作正在进行中。
遗传偏分离是自然界非常普遍的现象，并被
认为是生物进化的动力之一，产生偏分离的原因
主要是由配子体或孢子体选择以及基因型分类错误
等引起的，基因型分类错误主要是由表型鉴别错
图 1 引物组合me4-em1在部分 F2群体中的扩增图
Fig.1 The amplication result of primer combination me4 and em1 in some F2 individuals
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图 2 水稻 SRAP连锁图谱
Fig.2 Rice linkage map based on SRAP
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误或不完全外显率造成的(张德水等 1997)。水稻
和大麦等的偏分离标记在染色体上的分布并不是随
机的，而是存在着一些热点区域(Matsushita 等
2003；Konishi等 1992；Harushima 等 1996；
Kinoshita 1991，1993，1995；徐云碧等 1995)。
本文中也发现了两个偏分离热点区域，这可能是
由于固有的遗传差异导致的，同时由于 SRAP揭
示的是ORF区的多态性，这为我们将来进一步研
究有关机制奠定了基础。同时，在本文中我们还
发现，偏分离的方向主要偏向于双亲，只有一个
偏向杂合体，由此我们认为这种配子体选择作用
应该是在基因纯合状态下发生的，这与徐云碧等
(1995)的报道基本一致。
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