全 文 ：第 22 卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2002 年　10 月
Vol.22　No.4　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2002
斯卑尔脱小麦 1B染色体的显微分离及其 DNA的 PCR扩增
郭东林　王同昌　王　宁　徐淑红　李集临
(哈尔滨师范大学生物系 ,哈尔滨　150080)
摘　要　以斯卑尔脱小麦的一个变种及其近等基因系为材料 ,玻璃针法进行显微操作在减数分裂
中期 I 分裂相中获得 G 型细胞质雄性不育的育性恢复基因 R f 3 所在的 1B染色体 DNA 。LA-
PCR方法扩增DNA ,斑点杂交的方法检测证明扩增产物来源于斯卑尔脱小麦基因组的 1B染色体
DNA 。
关键词　染色体显微操作;小麦G 型细胞质雄性不育;R f 3 基因;1B染色体;LA-PCR
MICRODISSECTION OF CHROMOSOME 1B OF TRITICUM SPELTA VAR.
DUHAMELIANCUM AND AMPLIFICATION OF THE CHROMOSOME DNA
GUO Dong-lin　WANG Tong-cang　WANG Ning　XU Shu-hong 　LI Ji-lin
(Harbin Normal Univ ersity , Harbin 150080)
Abstract 　 Objective Gene Rf 3 originated f rom chromosome 1B of Triticum spelta
var.Duhamel iancum is a fert ility -restorer gene fo r G-type cy toplasmic male sterility.Microdis-
sected chromosome 1B by glass needles from cells in duration of meiotic metaphase.The DNA frag-
ments w as amplif ied by means of LA-PCR.By dot hybridization , the product w as confirmed as the
amplified DNA from chromosome 1B of T.spelta var.duhameliancum.
Key words　microdissection;G-ty pe cytoplasmic male sterlity ;gene R f 3;Chromosome1B ;LA -
PCR
　　小麦是我国第二大粮食作物。杂种优势利用
的研究一直受到重视 ,G型细胞质不育类型的利用
主要受到恢复系少 ,恢复力不理想的限制[ 1] 。由
于染色体显微操作技术日益完善 ,构建亚基因组文
库进而分离并克隆特定基因的工作取得了令人瞩
目的进展。建立在分子标记基础上的小麦育性恢
复基因的定位 、克隆和使其做探针筛选恢复系 ,可
能是利用小麦杂种优势的最佳途径 。
到目前为止共发现 7 个 G 型育性恢复基因 ,
分布在不同染色体上(1A 、Rf 1 , 7d 、R f 2 , 1B 、R f 3 ,
6B 、Rf 4 , 6D 、R f 5 , 5D 、R f 6 , 7B 、R f 7),其中 R f 3 定
位于 1B 染色体上[ 2 , 3] , Ma和 Sorrells用限制性片
段长度多态性(RFLP)技术对小麦品系 Prempi和
Rll3进行了分析 , 结果表明探针 Xbcd249 和 Xc-
do442与 Rf 3 连锁[ 4] 。我实验室的曹海明等人利
用近等基因系 1031 -1 、1031-2 、1031-3 进行
RAPD分析 ,确立了与被导入到普通小麦品种 S -
615 的 R f 3 基因来源于 Triticum spelta var.
duhamel ianum 小麦 ,并做出与育性恢复基因 R f 3
第一作者简介:郭东林(1973-),硕士 ,助教 ,主要从事分子遗传学研究。
收稿日期:2002-03-15
连锁的分子标记 。
染色体切割技术最早建立于动物遗传研究 ,
1981年德国欧洲分子实验室 Edstrom 领导的研究
小组在果蝇中进行了尝试并获得成功[ 5] 。1992年
Jung 等以含有 18 条甜菜染色体和 1条野甜菜染
色体的单体附加系为实验材料 ,共获得 15000个有
效克隆 , 并从中找到了抗根部孢囊线虫的克隆
株[ 6] 。随后Albani和 Pich 等创立了将植物 DNA
放入 Eppendorf 管中并进行 PCR反应的方法[ 7] 。
我国的周奕华等以玻璃针法分离 2条大豆染色体
并扩增[ 8] ;马有志等对小麦染色体进行激光切
割[ 9] ;胡赞民等建立了玉米单染色体的分离及体
外扩增技术 , 并对王百合 、大麦等材料进行分
离[ 10 , 11] 。染色体显微操作方法主要有激光微束
法 、流式染色体分级分离法和玻璃针法 。其中璃针
法具有简便 、快捷的优点[ 11] 。对未知核苷酸顺序
的DNA 片断扩增的 PCR 方式有加接头法 、锚定
PCR 、通用引物 PCR 、简并引物 PCR、反向 PCR 、单
一特异引物 PCR 、单侧 PCR 、臆断 PCR等。LA-
PCR(Linker-adapter PCR)的方法是以人工合成
的互补寡聚核苷酸链作连接接头(具粘性未端),选
用产生相同粘性末端的内切酶酶切染色体 DNA ,
然后与连接接头连接 ,利用连接接头的一条链作为
引物进行二次 PCR扩增 ,最后将扩增产物克隆至
质粒载体中 。此种方式 ,可以从单区段 DNA 扩增
出微克级 DNA量 ,许多学者利用这种方法成功获
得扩增片段 。显微切割及微克隆的主要鉴定内容
为 PCR产物的来源 、插入片段的来源 。我们认定
1031-1近等基因系的 R f 3基因位于1BS的远端 ,
企图用显微分离的方法将这一端染色体分离 ,再将
分离的染色体用 LA-PCR的方法进行扩增 ,最后
将扩增产物克隆至质粒载体中 ,为进一步进行 Rf 3
基因的分离打下基础 。
1　材料与方法
1.1　显微操作设备
国产梧光倒置显微镜与德国手动显微操作器
组装 ,用拉针仪将 1 mm毛细玻璃管拉制成尖端直
径为 0.2μm 左右的玻璃针 ,装于显微操作器上 。
1.2　实验材料
斯卑尔脱小麦及 Rf 3 近等基因品系 1031-1 、
“中国春”小麦 1B缺体-1A 四体(N1BD1A)均由日
本京都大学 Tsunewaki教授惠赠;小麦 rDNA 为本
系李瑞军教授惠赠。
1.3　染色体的显微分离
以斯卑尔脱小麦为父本 、“中国春” N1BD1A为
母本按常规法杂交 ,收获 F1 种子 ,次年种于田间 ,
镜检选取正处于减数分裂中期 I的花药用酒精:醋
酸(3:1)固定液固定 10 分钟。45%醋酸压片镜检
后液氮中揭片 , 气干;0.02%亚甲基蓝染色 10 分
钟 ,气干后保存备用 。以 Leitz 拉针仪辅助将玻璃
针针尖直径拉成染色体直径的 1 ～ 2 倍左右 , 254
nm 紫外线处理 30 分钟。用安装在倒置显微镜上
的 Lei tz显微操作器在低倍镜(10×)下将玻璃针移
至视野中央 ,升起玻璃针;移动玻片寻找适于分离
的中期分裂相 ,换上高倍镜(25×);降下玻璃针 ,对
准 1B染色体 ,加一滴无菌水;以玻璃针轻轻触动
染色体 ,待染色体整体即将脱落于载玻片上 ,吸去
无菌水 ,以针尖挑取;缓慢升起玻璃针 ,移出水面 ,
将针尖折断于盛有 20 μL 蛋白酶 K(5 ng/μL , T4
连接酶缓冲液配制)的 Eppendorf 管中;12 , 000 r/
min离心 15 秒 , -20℃保存备用 。利用缺体四体
系统获得减数分裂中的单价体为本实验所独创 。
染色体分离过程见图 1
图 1　分离染色体全过程
F ig.1　Microdissect chromosome 1B
1-1为减数分裂中期分裂相 ,箭头所示游离的 1B染色体;1-2箭
头所示玻璃针挑取游离的 1B染色体;3-3箭头所示分裂相中单
染色体被玻璃针分离
1-1:Meiot ic metaphase , under the arrow is ch romosome 1B;1-2:
Isolating chromosom e 1B by glass needles;1-3:Chromosome 1B had
been isolated
1.4　染色体 DNA的体外扩增
(1)Sau3A接头(Linker-adapter)的制备
Sau3A接头是由 23 个碱基和 19 个碱基的两
个寡核苷酸片段构成 ,其序列为:
23-mer:5 GATCCTGAGCTCGAATTCCACCC 3
19-mer:5 GGGTCGAATTCGAGCTCAG3
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(2)染色体脱蛋白
将储存在蛋白酶 K 溶液中的单染色体 37℃消
化 3小时 ,70℃、20分钟灭活蛋白酶 K 。
(3)酶切:加入 2μL Sau3A(0.01 U/μL , T 4连
接酶缓冲液配制)37℃保温 4 小时形成 DNA 片
段 ,70℃、20分钟灭活 Sau3A 。
(4)连接反应:加入 2 μL Sau 3A 接头(5ng/
μL),0.5μL 的 T 4DNA连接酶(3U/μL),16℃连接
16小时 ,70℃、20分钟灭活连接酶 。
(5)PCR扩增:
反应体系:加接头后的 DNA 片段溶液
24.5 μL , 10 ×Taq 酶缓冲液 10.0 μL , 25 m M
M gCl2 6.0 μL ,10 m M dN TP 2.0 μL , 19mer 引物
0.8μL , Taq酶(2U/μL)0.5 μL ,无菌水 56.2 μL ,
总体积 100.0 μL。以 40 μL 石蜡油覆盖 ,离心后
进行 PCR反应 。
反应条件:预变性 95℃5 min ,变性 95℃15 s ,
退火 64.5℃45 s ,延伸 72℃90 s , 35 个循环 ,保温
72℃5 min。
(6)琼脂糖凝胶电泳检测 ,对单染色体 DNA
扩增产物再进行一次 LA -PCR。反应体系同第
一轮 , 反应条件除退火温度提高1℃外与第一轮相
同。1%琼脂糖凝胶(内加 EB)电泳检测 。电泳结
果见图 2。
图 2　为电泳检测结果
Fig.2　Results of Electrophoresis
泳道A 为 Marker;泳道 B为第一次扩增空白对照;泳道 C为第
一次扩增产物;泳道 E 为第二次扩增空白对照;泳道 F 为第二
次扩增产物。
A:Marker;B:Cont rol for f irst amplify;C:Product of f irst am plify;
E:Cont rol for second amplify;F:Product of second amplify
1.5　斑点杂交检测
(1)常规提取斯卑尔脱小麦总体 DNA
(2)杂交:长臂光敏生物素标记两种探针 ,即斯
卑尔脱小麦总体 DNA 探针和小麦 rDNA探针。
泡膜后用二次 PCR扩增产物 1 μL 进行点样 ,
42℃水浴预杂交 4 ～ 6 小时后倾去预杂交液 ,加入
杂交液(0.2 mL/cm2 膜),内有长臂光敏生物素标
记好的探针 , 42℃杂交 20 ～ 24小时。
(3)检测:
洗膜三次封闭 3 小时加入亲和素 -辣根酶
(AV-HRP)溶液 ,37℃酶连30 min ,加入新配制的
显色液 4 mL ,显色完全而本底未出现前终止反应 ,
去离子水洗净 ,封存于聚乙烯袋中 ,湿时摄影。以
基因组DNA和 rDNA为探针进行斑点杂交的结果
见图 3和图 4。
图 3　为使用基因组 DNA探针进行斑点杂交检测结果
Fig.3　Results of do t hybridization by gDNA probe
A为总基因组　B为单染色二次扩增产物　C为空白对照。
A:Gence DNA;B:Product of amplify;C:Control
图 4　为使用 rDNA探针进行斑点杂交检测结果
Fig.4　Dot hybridization by probe of rDNA
A为总基因组　B为单染色体二次扩增产物　C为空白对照
A:Gene DNA B:Product of am plify C:Control
2　结果
在镜下选取处于中期 I的减数分裂分裂相 ,以
玻璃针分离其游离于配对染色体之外的单价体 ,可
以成功地从减数分裂中期 I 材料中获取所需的目
的染色体 ,本实验中得到若干条 1B 染色体 ,以单
染色体形式保存于 Eppendo rf管中。
单染色体 DNA 经第一轮 LA-PCR后 ,电泳
检测 1B染色体 DNA 扩增产物显示出明显的连续
扩增带型 ,长度为 300 ～ 1000 bp ,而与其相对应的
阴性对照无扩增带型 ,说明扩增产物确实来源于
1B染色体 DNA 。本实验中对于常规提取的斯卑
尔脱小麦总体 DNA 也进行了不同梯度 LA-PCR ,
4894 期　　　　　　　　　郭东林等:斯卑尔脱小麦 1B 染色体的显微分离及其 DNA的 PC R扩增
也得到弥散型的扩增带型 。二者在电泳检测中差
别不大。
如图 2所示 1B单染色体 DNA 二次增产物电
泳结果 ,各条 1B染色体二次扩增结果均为连续扩
增带型。扩增结果分子量仍旧相对集中于 300 ～
1000 bp处 ,但不完全一致 ,并且各扩增产物在同
一分子量处出现明显的特异性扩增产物 。分析产
生这种情况的可能性原因是小麦基因组中含有大
量的重复序列 ,因而在二次扩增中被优先扩增出
来 ,在马有志等人利用有丝分裂材料分离小麦 1B
染色体进行扩增时得到类似的结果。二次扩增中
的阴性对照无扩增带型。
以斑点杂交的方法对扩增结果进一步验证 ,如
图 3所示以斯卑尔脱小麦总体 DNA为探针 ,在 1B
染色体二次扩增产物及总体 DNA 点样处都显示
了杂交信号 ,信号在强度上比较接近。说明二次扩
增产物及总体 DNA与探针都具有同源性 ,可以证
明扩增产物来源于斯卑尔脱小麦的近等基因系图
4为以小麦 rDNA 为探针与 1B 单染色体二次扩增
产物杂交 ,显示了较强的杂交信号 ,而小麦 rDNA
探针与斯卑尔脱小麦总体 DNA 则显示的杂交信
号较弱 。由于 rDNA 为随体染色体的特异性探针 ,
在小麦中只有 1B 染色体和 6B 染色体具有随体 ,
所以整体基因组中 rDNA含量远远小于1B染色体
中 rDNA的含量 。因此得到的杂交结果可以证明
扩增产物来源于杂种中减数分裂时游离的单价染
色体 ,即具有随体的 1B染色体 。
3　讨论
3.1　近年来用于研究植物染色体显微分离技术的
材料大多数是选择染色体较大且数目较少的植物 ,
如甜菜 、王百合 、玉米 、黑麦等[ 10 ,12] 。挑取染色体
可以随机挑取 ,亦可以选择具有特殊形态的染色体
如随体染色体进行挑取 。对于小麦这样染色体数
量较多的基因组 ,进行染色体显微分离可利用不同
类型的非整倍体系统 ,如利用缺体四体系统与近等
基因系杂交进而分离单价体这条技术路线是可行
的。本实验利用斯卑尔脱小麦及 R f 3 的近等基因
品系与“中国春”小麦 1B缺体-1A四体(N1BD1A)
杂交后 ,F1 代花粉母细胞减数分裂中期 I ,源于斯
卑尔脱小麦的 1B染色体无同源染色体与之配对 ,
成为单价体 ,游离于其他配对的染色体之外 ,容易
识别 ,可以被分离出来。
3.2　染色体显微操作的决定性前提是要获得良好
的染色体玻片标本 ,制片技术必须熟练 ,在染色体
分离中 ,必须实行无菌操作。实验采用的是国产梧
光 XSB-1A 型倒置显微镜 ,在物镜与玻片之间能
提供足够的操作空间 ,并有载片移动器 。操作者面
部距载片较远 ,有利于减少操作者呼吸造成的污
染 ,适于染色体的显微分离操作。材料固定的时间
一般不能超过 1 小时 ,因为醋酸对 DNA 有一定的
破坏作用(脱嘌呤),时间太长不利于 DNA 的扩增
和克隆[ 9] 。固定 10分钟只能在短期内使材料处于
较好的状态。亚甲基蓝是活体染色剂 ,用 0.02%
亚甲基蓝进行染色 ,既可以提高镜检效果又可以减
少对 DNA 的损伤。操作用的玻璃针尖应拉成急
尖 ,直径为染色体直径的 1 ～ 2倍之间效果较好 ,在
水中以玻璃针触动染色体 ,当染色体整体即将脱落
于载片之际 ,吸去水分 ,再以玻璃针挑取 ,可以减少
染色体的丢失 。本实验方法简便易行 ,而且能避免
其他染色体的污染 ,此法可在两天内完成从染色体
的分离到 DNA的体外扩增的整个程序 ,并且所获
得的产物是由一条染色体扩增出来的 。
3.3　本实验所得到的扩增产物大小为 300 ～ 1000
bp ,有两处明显的高度扩增区域。可能是由于小麦
基因组具有高度重复顺序 ,因其在基因组中拷贝数
较多 ,所以被优先扩增 ,量比较大。一次扩增的结
果同二次扩增的结果相比较 ,带型弥散 ,其原因也
可能是二次扩增时有选择性 ,高拷贝数的顺序被优
先扩增出来 。在以斯卑尔脱小麦总 DNA 作为探
针对分离的 1B染色体 DNA 扩增产物进行斑点杂
交鉴定外 ,还利用了小麦的 rDNA 作为探针进行斑
点杂交验证。因为小麦染色体组中 , 1B 是核仁染
色体 ,具有 rDNA 分布[ 14] 。 rDNA 在各种麦类作
物中具有极高的同源性 ,进一步确认本实验所得的
扩增片段来源于斯卑尔脱小麦的 1B染色体.
来源于 Tri ticum spelta var.duhamelianum
小麦的R f 3 基因是一个恢复力较强的 G型细胞质
不育的育性恢复基因。确定这个基因的分子标记
并克隆这个基因具有重要意义 ,对小麦的杂种优势
利用工作具有推动作用 。1B染色体的显微分离及
其 DNA的扩增也是其亚基因组文库构建的前提 ,
同时也为利用分子手段从细胞遗传学与分子遗传
学相结合的角度分析特定染色体的工作奠定基础 。
参　考　文　献
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