全 文 ：第 25卷　第 4期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005年　10月
Vo .l 25　No. 4　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTAN ICAL RESEARCH Oc.t , 　2005
第一作者简介:魏兰珍(1973— ),女 ,硕士研究生,主要从事藻类分子生物学研究。
*　通讯作者 Au th or for correspondence　E-m ail:w angqx@ shnu. edu. cn
收稿日期:2004 - 11 - 24
hGM-CSF基因穿梭表达载体的构建及其在鱼腥藻 7120中的克隆
魏兰珍1　金　锐 1　马为民 2　施定基 1, 3*　甘人宝4　王全喜1*
(1.上海师范大学生命与环境科学学院 , 上海　200234)
(2.中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 ,中国科学院研究生院 , 上海　200032)
(3.中国科学院植物研究所 , 北京　100093)
(4.中国科学院上海生命科学院生物化学研究所 ,上海　200031)
摘　要　人粒—巨噬细胞集落刺激因子 (hGM-CSF)作为一种造血生长因子 ,能够刺激 T细胞和
巨噬细胞增殖 、成熟和分化 ,具有极其重要的免疫调解功能。本研究运用 PCR方法 ,从质粒 pAG-
MT-8中克隆该基因 ,并在其 5′端添加有利于在蓝藻细胞中高效表达的 SD序列 ,然后插入到表达
载体(pRL-439)强启动子 PpsbA的下游 ,进一步与穿梭表达载体 pDC-08相连构建成穿梭表达载
体 pDC-GM 。利用三亲接合转移方法将该穿梭表达载体 (pDC-GM)转入丝状鱼腥藻 7120,通过相
应抗生素筛选后得到能稳定遗传的转基因藻。以该转基因藻的基因组 DNA为模板进行 PCR检
测 ,结果表明 hGM-CSF基因已转入鱼腥藻 7120。这是首次尝试把蓝藻作为制备重组 hGM-CSF的
新宿主 ,具有潜在的经济价值和社会效益 。
关键词　hGM-CSF基因;三亲接合转移;转基因蓝藻;鱼腥藻 7120
C lon ing of human granulocyte-macrophage colony stmi ulating
factor (hGM-CSF) gene inAnabaena sp. PCC7120
WEI Lan-Zhen1　Jin Rui1　MAW ei-M in2　SH ID ing-Ji1, 3*　G an Ren-Bao4　WANG Quan-X i1*
(1. Departm ent o f B io logy, Shangha iNo rm al University, Shanghai　200234)
(2. Institu te o f P lant Phy sio logy and E co logy, Shangha i Institu te s fo r Bio log ica l Sc iences, Chinese A cademy of Sciences,
G raduate School o f the Chinese Academy of Sciences, Shangha i　200032)
(3. Institu te o f Bo tany, Ch inese Academy o f Science, Beijing　100093)
(4. Institu te o f B iochem istry, Chine seA cademy of Science, Shangha i　200031)
Abstract　Hum an granu locy te-macrophage colony stimu lating factor (hGM-CSF) is one o f a fam ily g ly-
copro tein cy tok ines that have po tent effects in stimula ting proliferation, maturation and function of hema-
topo ietic cells. The gene encoding hGM-CSF w as PCR amplified from the plasm id pAGMT-8 and modi-
fied by addition SD sequence to promo te prokaryo tic expression. The resu ltant hGM-CSF was inserted in-
to downstream of the strong promo ter, PpsbA o f expression vecto r pRL-439, then ligated w ith pDC-08 to
produce the shu ttle exp ression vector, pDC-GM. The resulting pDC-GM was transferred into the fila-
mentous, heterocystour cyanobacterium , Anabaena PCC7120 , by the tri-paren tal conjugation transfer
me thod. W hen cells we re cultiva ted w ithout antibiotics form any gene ra tions, the transgenic cyanobacte-
ria remained resistan t to neomycin. PCR amp lification o f w ild type and transgen ic Anabaena cells w ith
primers P1 and P2 revea led no band in w ild type and plasm id free ce lls, whe reas transgen ic ce lls y ielded
a abou t 390 bp band. This is the first report o f expression hGM-CSF in cyanobacteria ce lls.
Key words　Human granu locy te-macrophage co lony stimulating facto r;triparen tal conjugative transfer;
transgenic cyanobac terium;Anabaena sp. PCC7120
人粒—巨噬细胞集落刺激因子 (hGM-CSF)是
从人白血病细胞系 Mo或人 T淋巴细胞系 T7中克
隆得到的 ,是第一个被克隆和利用重组 DNA技术
生产的造血刺激因子 [ 1] 。在正常人体中 hGM-CSF
含量较低 ,采用基因工程方法可以获得大量的重组
人粒—巨噬细胞集落刺激因子[ 2] 。并且外源性
hGM-CSF可以刺激骨髓内皮细胞的增殖 ,对造血
调控具有重要作用[ 3] 。目前 ,利用基因工程方法
制备 hGM-CSF已经做了大量卓有成效的工作 ,该
基因已在大肠杆菌 、酵母和哺乳动物等宿主中得到
成功表达[ 4 ～ 6] 。现在市场上销售的 hGM-CSF大多
以大肠杆菌作为宿主 ,然而利用其制备重组药物可
能存在一些缺陷 ,如易形成包涵体 、后期加工成本
较高 ,选择一种新的宿主来改进 hGM-CSF的制备
将是一个值得探索的研究课题 。
鱼腥藻 7120细胞结构简单 ,生长速度快 ,适应
性强 ,其基因组序列已于 2001年完成测定 [ 7] ,是理
想的研究基因工程的模式藻。一大批可用于蓝藻
的基因工程载体的构建也为蓝藻分子遗传学奠定
了基础 [ 8, 9] 。另外 ,用鱼腥藻 7120表达外源基因
的产物具有独特优点 ,如:不形成包涵体 、不含内毒
素 ,使通过转基因蓝藻制备基因工程药物的下游加
工过程大大简化 ,具有潜在的经济价值和社会效
益 [ 10] 。因此 ,本研究将 hGM-CSF基因转入鱼腥藻
7120,为寻求`可用于表达 hGM-CSF的新宿主 ,也为
利用蓝藻基因工程制备该药物作了一些前期准备。
1　材料和方法
1. 1　质粒 、菌株和蓝藻藻种
质粒 pRL-439和 pDC-08由中国科学院植物研
究所施定基研究员提供 ,携带有 hGM-CSF基因的
质粒 pAGMT-8[ 2]由中科院上海生物化学研究所甘
人宝研究员提供 。大肠杆菌 DH5α和鱼腥藻 7120
来自本实验室。
1. 2　主要试剂
Taq酶 、BamH I, EcoRI, Sa lI等限制性内切酶
和 T4DNA连接酶等均购自 TaK aRa公司。抗生素
购自华美生物工程公司 。其他化学试剂均为国产
分析纯 。
1. 3　蓝藻藻种培养
鱼腥藻 7120生长于 BG-11培养液中 。藻种的
纯化采用平板划线分离。扩大培养时按 1:50的比
例 接 藻 种 于 250mL 三 角 瓶 中 , 26℃ 和
100μmo l m - 1 s-1的光照条件下振荡培养 [ 11] 。
1. 4　hGM-CSF基因的克隆
根据 Wong[ 12]等人报道的 hGM-CSF基因 cD-
NA序列 ,设计合成上下游引物 (P1和 P2),并分别
在编码成熟蛋白的基因序列 5′端添加 BamHI位点
和有利于在蓝藻中高效表达的 SD序列以及启始
密码子 ATG ,在 3′端添加 EcoRI位点。
P1:5′CGGGATCCTGGAGAGATTAATGGCAC-
CCGCCC3′;P2:5′CCGGAATTCTCACTCCTGGACT-
GGCT3′。
采用分子克隆技术[ 13] , 按常规 PCR反应条
件 , 94℃先变性5 m in;然后 94℃变性 1 m in, 62℃退
火30 s, 72℃延伸 2 m in ,共 25个循环;最后 72℃反
应10 m in。 PCR产物经回收 、纯化和 BamH I与
EcoR I双酶切后插入到质粒 pUC-19相应位点 ,经
测序鉴定为正确的 hGM-CSF基因序列 。
1. 5　穿梭表达载体的构建
穿梭表达载体的构建过程如图 1所示 ,具体操
作详见分子克隆技术 [ 13] 。
1. 6　蓝藻的转化
采用三亲接合转移法 [ 14] 。 (1)E. coli的准备:
在含有相应抗生素的 LB培养液中 ,分别接种含穿
梭表达载体 pDC-GM和 Helpe r质粒的 HB101菌 ,
37℃下培养过夜 ,离心收集沉淀 ,等体积混合后重
悬于 BG-11培养液中 。 (2)蓝藻的准备:在三亲接
合转移前更换培养液 ,离心收集藻细胞 ,洗涤后重
悬于 BG-11培养液中 ,并作梯度稀释 。 (3)接合转
移:将菌液和藻液混合后涂于混合纤维酯微孔滤膜
(0. 45 μm)上 ,在含新霉素的 BG-11的固体平板上
培养 ,直至转化子出现。
1. 7　转基因蓝藻的分子检测
提取转基因藻的基因组 DNA为模板 ,用引物
P1、P2进行 PCR扩增 ,检测转基因鱼腥藻 7120中
hGM-CSF基因的存在 。
2　结果
2. 1　穿梭表达载体 pDC-GM的构建
2. 1. 1　hGM-CSF基因的克隆
以质粒 pAGMT-8[ 2]为模板 ,进行 PCR扩增 ,得
4374期 魏兰珍等:hGM-CSF基因穿梭表达载体的构建及其在鱼腥藻 7120中的克隆
图 1　穿梭表达载体 pDC-GM的构建
F ig. 1　Schem e for construc tion o f the shuttle expression vec tor pDC-GM
图 2　hGM-CSF基因的 PCR扩增
1. DL2000分子标准;2. 阴性对照;3. 扩增 PCR产物
F ig. 2　 Iden tification of PCR product hGM-CSF
1. DL2000 m olecu lar m ark er;2. Negative con trol;3. Am p lified
PCR p roduct
到约390 bp的扩增产物 (图 2)。测序结果表明该
片段长度为 378 bp,与 W ong[ 12] 等人报道的 hGM-
CSF基因的 cDNA序列完全吻合。
2. 1. 2　中间表达载体的构建
将 PCR产物回收纯化后 ,经 BamHI与 EcoRI
双酶切 ,然后插入到 pRL-439强启动子 PpsbA的下
游 ,得到中间表达载体 pRL-GM。以该载体转化大
图 3　中间表达载体 pRL-GM的酶切鉴定
1. λDNA H ind III 分子标准; 2. pRL-439 双酶切 (B amH I /
EcoRI);3. PCR产物双酶切 (BamH I /E coRI);4. pRL-GM双酶
切(B amH I /E coRI);5. pRL-GM 单酶切 (B amH I);6. pRL-GM
单酶切(E coRI);7. DL2000分子标准
F ig. 3　 Iden tification of interm ed ia ry vec to r pRL-GM
1. λDNA H ind IIIm olecu lar m ark er;2. pRL-439 d igested by
B amH I andE coR I;3. hGM-CSF gene from PCR produ ct d iges ted by
B amH I and EcoRI;4. pRL-GM d igested by BamH I andE coRI;5.
pRL-GM d igested by B amH I;6. pRL-GM d igested by E coR I;7.
DL2000m olecu lar m ark er
肠杆菌 DH5α,经酶切鉴定 ,筛选出阳性克隆 (图
3)。
438 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
图 4　穿梭表达载体 pDC-GM的电泳鉴定
1. λDNA H ind III分子标准;2. pRL-GM 双酶切(Sa l I /E coRI);
3. pDC-08双酶切 (Sa l I /E coRI); 4. pDC-GM 双酶切 (Sa l I /
E coRI);5. pDC-GM 单酶切 (Sa l I); 6. pDC-GM 单酶切
(E coRI);7. DL2000分子标准
F ig. 4　 Iden tification of shuttle expression vec to r pDC-GM
1. λDNA H ind III m olecu lar m arker;2. pRL-GM d igested by Sa l I
andE coRI;3. pDC-08 d igested bySa lI andE coRI;4. pDC-GM di-
gested by Sa lI and E coRI;5. pDC-GM d igested by Sa lI;6. pDC-
GM d igested by E coR I;7. DL2000m olecu lar m ark er
2. 1. 3　穿梭表达载体的构建
中间载体 pRL-GM经 Sa lI和 EcoRI双酶切后 ,
用柱式 DNA胶回收试剂盒回收小片段 DNA ,然后
插入到穿梭载体 pDC-08的相应位点 。用得到的
穿梭表达载体 pDC-GM转化大肠杆菌 DH5α,经酶
切鉴定 ,筛选出阳性克隆(图 4)。
2. 2　转基因蓝藻的获得
用三亲接合转移的方法 ,在含新霉素的 BG-11
固体平板上进行筛选 。两周后 ,含 pDC-GM质粒和
空载体的鱼腥藻 7120在膜上长出藻落 ,而野生藻
则在新霉素压力下逐渐死亡(图 5)。
将含重组子的藻落转移至含新霉素的 BG-11
培养液中进行筛选和扩大培养。转基因藻经多次
不加抗生素的继代后 ,再用新霉素进行筛选 ,转基
因藻仍然生长良好 ,表明 pDC-GM质粒已稳定地存
在于鱼腥藻 7120中。
2. 3　转基因藻的分子检测
抽提转基因鱼腥藻 7120的基因组 DNA为模
板 ,用引物 P1和 P2进行 PCR扩增(图 6)。扩增结
果显示 ,在转 pDC-GM基因的鱼腥藻 7120中含有
hGM-CSF基因 ,而野生藻和转 pDC-08基因的鱼腥
藻中没有得到有效扩增。这表明 , hGM-CSF基因
图 5　鱼腥藻 7120的转化
A. 含 pDC-GM的转基因鱼腥藻 7120;B. 含 pDC-08的转基因鱼
腥藻 7120;C. 野生鱼腥藻 7120
F ig. 5　T ransfo rm ation ofAnabaena sp. PCC7120
A. Tran sgen ic Anabaena sp. PCC 7120 harboring pDC-GM;B.
T ransgenicAnabaena sp. PCC 7120 harb oring pDC-08;C. Anabaena
sp. PCC7120
图 6　转基因藻的 PCR检测
1. DL2000分子标准;2. 含 pDC-GM的转基因鱼腥藻 7120;
3. 含 pDC-08的转基因鱼腥藻 7120;4. 野生鱼腥藻 7120;
5. 阴性对照
F ig. 6　 Iden tification of PCR produc t in transgen ic
Anabaena sp. PCC7120
1. DL2000m olecu larm arker;2. T ransgen ic Anaba ena sp. PCC 7120
h arboring pDC-GM;3. Transgen icAnabaena sp. PCC7120
harboring pDC-08;4. Anabaena sp. PCC7120;5. Negative con trol
已转入鱼腥藻 7120。
3　讨论
本实验通过 PCR手段在 hGM-CSF基因前端
插入有利于在蓝藻细胞中高效表达的 SD序列和
4394期 魏兰珍等:hGM-CSF基因穿梭表达载体的构建及其在鱼腥藻 7120中的克隆
启始密码子 ATG , 并将该基因插入到强启动子
PpsbA的下游 ,构建成能在蓝藻中高效表达的穿梭
表达载体 pDC-GM。通过三亲接合转移将该穿梭
表达载体 pDC-GM转入淡水丝状鱼腥藻 7120中 ,
通过抗生素多次筛选 、继代培养和 PCR检测 ,证明
hGM-CSF基因已经转入并稳定地存在于鱼腥藻
7120中 。实验结果表明外源的 hGM-CSF基因可
以通过三亲接合的方法转入模式蓝藻 (鱼腥藻
7120)中 ,为利用基因工程的手段表达外源 hGM-
CSF提供了一种新的宿主 。同时 ,这也为将来利用
蓝藻基因工程手段制备 hGM-CSF作了一些有效的
探索。
参　考　文　献
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