全 文 ：B E U L L N I TO FB O TA N ICA L RE E SA C RH
第 13 卷
V
o l
.
13
第3 期
No
.
3
23 9 9年 7月
J
t ly
, 2 9 9 3
黑穗醋栗 ( iR be s in g r u m L . ) 未受精胚珠培养
诱导体细胞胚状体和植株再生的研究
李 勇
S T UD IE S O N IN D UC T IO N O F SOMAT!C EM B RY O S
AN D P L AN T L ET R E G E N ER AT旧 N F R OM U N F ER T IL亿 ED
O V U LE S IN V ! T RO C UL T U RE O F B L AC K
C U RRA NT ( R !B E S N! G R UM L
。
)
L 1 Y o n g
〔摘 要〕 本文报告了黑穗醋栗 (R i右es ` nl’ g 1u m L 。 ) 三个栽培品 种 中的
薄皮 .黑豆未受精胚珠 (花粉发育到单核晚期 ) 在 M S 基本培养基附加植粉激素
B A
, 2
.
4 一 D 和 G A : 中形成 了体细胞胚状体 。 长度约为 0 . 5一 l . oc m 大小 的胚
状体在生根培养基 中可以 形成完整的再生植株 。 经过筛选得到了 体细胞胚性愈
伤组 织 无性系 , 继代培养二年 多仍能保持 胚状体形成能力 。 试验结果表明 : 诱
导体细胞胚胎发生受品 种和接种时期的影响 , 适宜的 接种时期为花粉发育到单
核晚期 。 培养基 中的 B A 为诱导胚胎发生 和保持胚性 愈伤组织无 性 系所必需 。
关键词 黑穗醋采 ( iR 乙es in g lu m L . ) : 未受精胚珠 ; 离体培养 ; 体细 胞
胚状体 ; 再生植株
黑穗醋栗别名黑豆 , 为多年生小灌木 , 其果实富含 V c , 是黑龙 江 省重要的经济果
树之 一 。 目前 , 生产中应用的品种混杂 , 老化严重 , 急需进行品种 改 良〔幻 。 利用生物
技术改良黑穗醋栗品种是一条有效的途径 。 建立体细胞愈伤组织与再生体系是进行快速
繁殖 , 体细胞突 变 体筛选 , 原生质体培养及其融合以及进行遗传操作的基础 。 Z at y k o
( 1 9 8 1 ) 〔`” 〕培养黑穗醋栗受精后胚珠得到了胚状体和再生植株 。 迄今尚未见国内外有关
其它外植体材料经 胚胎发生途径再生植株的报道 。 这种来源于受精胚的体细胞胚状体不
能用于生产中苗木快繁以及转基因植株的直接生 产应用 。 因此 , 有必要得到品种体细
胞直接 来源的易再生体系 。 1 9 8 8年以来 , 我们对黑穗醋栗未受精胚珠离体培养进行了研
究 , 连续得到了体细胞胚状体和再生植株 。
本文作者 单位 : 黑龙 江 , 哈尔滨 , 黑龙江大学 ( H e i lo n g ii a n g U n i v e r s i t y , H a r b i n 1 5 0 0 s o 圣! e i lo n g j i a n g ) ,
本试验的试材 由黑龙江省农科院园艺研究所张云庭先生提供 , 在此表 .示感谢 。
l 。。2年一。月收到本文 .
3 期 李勇 :黑穗酷栗未受精胚珠培养诱导体细胞胚状体和植株再生的研究
材 料 与 方 法
试验选用黑穗醋栗栽培品 种 :薄皮黑豆 , 厚皮黑豆和算盘子 。 接 种的外植体是未受
精胚珠 。 取花粉发育时期分别为 : 单核早期 ( P : ) , 单核晚期 ( P Z ) 和开花前一天 ( P 3 )
三种不 同时期的花蕾 , 自来水冲洗千净 , 70 写 酒 精 浸 泡 2 一 3 秒钟 , 用蒸馏水冲洗两
遍 , 然后在无菌条件下 。 . 1% 升汞消毒 10 分钟 , 无菌水冲洗 3 次 , 在实体解剖镜下剥取
胚珠接种在诱导培养基中 。 培养约 30 天后转到胚状体形成培养基中 。 萌发后的 胚 状体
在生根培养基中形成植株 。 培养基均为 M S 基本培养基附加植物 激 素 3 . 0一 5 . 0 m g / L
B A
, z
.
o m g / L G A
3 , 2
.
o m g / L 2
.
4 一 D
, p H S
.
g , i k g /
e m “ 大气压下灭菌 2 5分钟 。
培养条件 : 各处理均在光下培养 , 每天光照 12 小时 , 光 强 15 0 L u x 左 右 , 温 度
2 5 士 2℃ 。
用于解剖学观察的材料 , 经卡诺固定液固定 , 常规石蜡切片法制片 , 铁矾苏木精一
固绿染色 。 茎尖分生组织压片观察体细胞染色体 。
结 果
一 、 诱导未受精胚珠产生胚状体
黑穗醋栗未受精胚珠接种在诱导培养基中逐渐膨大 , 变绿 , 约 30 多天 左 右 , 把其
转移到胚状体形成培养基中约 20 多天可以形成各种各样的愈伤组织 。 从愈伤 组 织外部
形态 , 颜色和质地来看主要有二种类型 : 一种是透明 , 松散状愈伤组织 , 另一种为淡黄
色 , 光亮 , 质地紧实状愈伤组织 〔图版一 l 〕 , 进一步培养可形成肉眼可见的胚状体 〔图
.版一 2 〕 。 另外 , 个别胚珠也可直接形成绿苗 。
解剖学观察表明 , 黑穗醋栗未受精胚珠形成的胚性愈伤组织可经球形胚〔图版一 4〕 ,
各种时期的胚状体 〔图版一 5 , 6 〕 形成肉眼可见的 , 易分离的各种时期的大量胚状体
.〔图版一 3 〕。 这 与典型的植物离体培养的体细胞胚胎发生过程类似 。
二 、 影响胚胎发生的因素
1
. 品 种 试验选用三个黑穗醋栗品种对其胚胎发生能力进行 了比较 , 结果如表 1 。
从表中可以看 出三个品 种中只有薄皮黑豆能够形成胚性愈伤组织 , 其他品种不能形成胚
状体 。 这说明在体细胞胚胎发生能力上品种间存在着差异 。
2
. 接种时期 由表 1 可知 , 三种接种时期仅花粉发育到单核晚期的胚珠 可 诱导体
细胞胚胎发生 , 诱导率为 3 . 3%一 5 . 0 % 。 而单核早期 , 开花前一天都无胚 胎 发 生 。 因
此 , 诱导黑穗醋栗未受精胚珠体细胞发生的适宜时期是单核晚期 。
3
. 植物激素 我们连续二年在表 2 所示的诱导培养基中得到了胚状体 。 在 培 养基
巾植物激素 B A 分别与 2 . 4 一 D , G A 3 配合使用时都能诱导胚胎发生 , 但在仅有 的 培 养
基中无胚状体形成 。 这说明培养基中的 B A 是诱导胚胎发生所必须的 。
三 、 胚性愈伤组织无性系的建立
1
. 胚性愈伤组织的筛选 · 黑穗醋栗未受精坯珠在胚状体形成培养基中产生 的 淡黄
色 , 坚实 , 光亮的胚性愈伤组织在诱导培养基 M S 十 B A S . 。 干 2 . 4一 D Z . o 十 3写 蔗 糖中能
诱导出一种质地均匀 , 松散带光亮颗粒 , 易分离的胚性愈伤组织 〔图 8 〕 , 这种愈伤组织
6 2 4植 物 研 究 13卷
表 1
T a b le l
黑穗醋栗品种和接种时期对未受精胚珠培养诱导胚胎发生的影响
Ef f e e ts of va r ie t yand in e ou !a ted s ta g en o
e mb r y og en s e is ofu n f e r t il ie zd u v oles of b la ek u e r ran t
年 份
Yea r
品 种
Va r ie t y
接种时期
In oeu la ted
5 ta g e
接种花蕾数 (个 )
N o
.
of in u e ol
-
a ted bud s
.
胚性愈伤组织数 (块 )
N o
.
of
E
一 ea l lu s
胚性愈伤组织诱导率 (%)
E
一 ea l lu s
(%)
19 8 8
薄皮黑豆
Ba oP玄 he id ou P 2 2 05 . 0
薄皮黑豆
Ba oP ih` fd ou
1 0 0
9 0
1 0 0
3
.
3
,孟32P
窗人
32P
1 9 8 9
算 盘 子
S
材 o n P a n 之i
1 0 0
1 0 0
1 0 0
10 0
10 0
10 0
IJ82P厚皮黑豆
H
o u P i入e 玄d o u
注 : E一 c al l u s 表示胚 数愈伤组织。
N o t e
:
E m b
r y o g e n i e c a ll
u s
( E
一 e a l l u s )
,
E
a r
l y
u n i n u e l
e a t e s t a g e o f p
o
l l
e n d e v e l o p m e n t ( F 一)
,
L a t e
u n i n u e l e a t e s t a g e o f p o l l
e n
d
e v e
l
o p m e n t ( P
:
)
,
T h
e
d
a y b o f o r e b e g i n n i n g b lo s s o m ( P
:
)
.
表 2
T a b! e Z
植物激素对胚胎发生的影响
E f f e e t o f p l a n t h o r m o n e o n e m b r y o g e n e s i s o f
u n f e r t i! i z e d o v u ! e s o f b l a e k e u r r a n
品 种
V a r i e t y
年 份
Y e a r
基本培养基
B a s a l
m e d i u m
附加的植物激素
P l a n t h o r m o n e
胚性愈伤组织诱 导 率
E
一 e a l l u s
( % )
1 9 8 8 M S 5
.
0
簿皮黑豆
B a o P坛h己玄d o u M S 3
。
3
1 9 8 9
M S
5
.
0扭 9 1 一 ’ B A +
2
.
o m g l
一 ’ 2
.
4
一
D
3
.
om g l
一 ’ B A +
1
.
o m g l
一 ` G A s
3
.
0口 9 1 ` ’ 2 . 4 一D
注 : E一 c al l哪 表示胚性愈伤组织 .
N o t e
:
Em b r了o g e n i e e a l lu s ( E 一 e a l lu s ) .
每 25 天左右继代一次可稳定地继代培养保持其分化能力 。 但这种愈伤组织不能 在 无激
素的基本培养基中保持 。
2
. 植株再生 把分离得到的胚性愈伤组织转到胚状体形成 培 养 基 M S + B A 3 . 0 +
l
.
Om g / L G A
。 十 3肠 蔗糖的培养基中培养约 1 个月左右 , 分离单个胚状体在生根 培 养
3期 李勇 :黑穗醋栗未受精胚珠培养诱导体细胞胚状体和植株再生的研究
基 Ms + B IA 2.。 + 2.o mg /L G A。 十 2%蔗搪中形成小植株 〔图版一 1。〕。 一部分小植株
根部表现明显 的玻璃化现象 , 同时还有多子叶 , 喇叭状子叶 , 单子叶〔图版一 9 〕 , 根茎
完整子叶不发达等畸形胚状体 。 根部玻璃化的小苗不能直接成株 , 可切下茎芽继续在生
根培养基中壮苗 , 生根 , ’也能形成完整植株 。 另外 , 胚性愈伤组织在胚状体形成培养基
中培养也可一边形成小植株 , 一边形成胚状体〔图版一 7 〕。 对再生植株茎尖分生组织细
胞染色体镜检结果表明 , 所有再生植株都是二倍体 ( 2n = 1 6) 。
讨 论
1
. 黑穗醋栗未受精胚珠诱导产生沐细胞胚状体和胚性愈伤组织无性系为 黑 穗醋栗
快速繁殖 , 为制备人工种子 , 单细胞悬浮培养 , 原生质体培养奠定了一个良好的基础 。
胚 性愈伤组织诱导率 3 . 3一 5 . 。% 对实际应用还不能达到要求 , 因此 , 对如何 提 高诱导
频率尚需深人研究 。
2
.
B u t t o n 等 ( 1 9 7 1 ) 〔6〕在橙 , M u l l i n S 等 ( 1 9 7 6 ) 〔8 〕和 S r i n i v a s a n 等 ( 1 9 8 0 ) 〔` 0 〕
在葡萄的未受精胚珠培养中都得到了来源于珠心细胞的体细胞胚状体 。 阎华等 ( 1 9 8 5 ) 〔” 〕
在向 日葵未受精胚珠培养中还得到来源于向 日葵特定结构一珠被绒毡层的体 细 胞 胚 状
体 。 高峰等 ( 19 9 0 ) 〔 4 〕) , N a v a r r o 等 ( 1 9 8 1 ) 〔 9 〕得到了柑桔未受精胚珠来源的体细
胞胚状体 , 这种胚状体可用于脱毒苗的快速繁殖 。 黑穗醋栗未受精胚珠培养 产生体细胞
胚状体进一步说明未受精胚珠是获得体细胞胚状体的好材料 。
4
.
Z a t y k o 等 ( 1 9 7 5 , 1 9 7 9 , 1 9 8 1 ) 〔` , , ` 2 , , 3〕培养红穗醋 栗 R . : u b : : ` m 和黑穗醋
栗受精后胚珠得到的萌发胚状体成株率低 。 在本项研究中胚状体萌发形成玻璃化根是影
响成株的主要障碍 。 卜学贤等 ( 1 98 9) 〔 l 〕认为试管苗玻璃化现象在组织培养中是普遍现
象 , 就其成因尚不明确 , 目前还没有一个有效的方法来解决这一问题 。 因此 , 利用胚状
体苗直接快速繁殖应用于生产还必须解决胚苗根部玻璃化的问题 。
5
. 植物细胞分裂素在诱导体细胞胚胎发生中有独特的作用 , E v a n 一 s 等 ( 1 9 81 ) 〔7〕 ,
周俊彦 ( 1 9 82 ) 〔 3 〕都论述了这一点 。 黑穗醋栗未受精胚珠来源的体细胞胚状体的结果进
一步说明细胞分裂素对诱导胚胎发生是必须的 。 关于胚状体的进一步 发 育 , Z a yt ko 等
( 1 9 75 ) lt 〕 在红穗醋栗受精后胚珠培养中得到的胚性愈伤组织可在无激素培养基 M S 中
保持 , 而我们得到的胚性愈伤组织不能在无激素的 M S 培养基中保持 , 必须有细胞分裂
素参加 。 也许这种差异是品种不 同造成的 。
A B ST R A C T
T h 15 p a p e r f i r s t r e P o r t e d t h a t B a o P i h e i d o u
, o n e o f t h r e e e u l t i v a r s
i n t h i s e x p e r i m e n t w a s a b l e t o p r o d u e e a d v e n t i v e e rn b r y o s w h e n t h e
u n f e r t i l i z e d o v u l e s o f b l a e k e u r r a n t ( R i b
e s n矛g 犷u m L . ) w e r e i n o e u l a t e d o n
M S m e d i u m s u p P l e m e n t e d w i t h P l a n t h o r m o n e s B A
, 2
.
4 一 D
,
.
G A s
.
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s o m a t i e e m b y o g万 n i e e a l l i w e r e i n d u e t e 『 i n b a s a l m e d i u m M S s u P p l e 亩 e n t e d
w i t h 5
.
0一 3 . 0 m g l 一 1 B A 一 2 . o m g l 一 1 2 . 4一 D o r l . o m g l 一 1 G A 3 . A f t e r e u l t u -
r i n g t h e u n f e r t i l i z e d o v u l e s a b o u t 2 5 d a y s o n t h e i n d u e t i o n m e d i u m
,
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2 6 6植 物 研 究 。 1 3卷
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r e etr as fr e ed to t h e em b
ry o fo rm a ti on m edi u m fo r t h e en i bry o
,
d e v e l o p n l e n t
。
T h e a d v e n t i v e e m b r y o : w e r e o b s e r v e d a f t e r e u l t u r i n g a b o u t
2 0 d a y s o n t h e e m b r y o f o r m a t i o n m e d i u m ( B
a s a l m e d i u m M S + 3
.
o m g l
一 ’
B A + 1
.
o m g i
一 ’ 七A名 + 3% s u e r o s e . ) . S o m a t i e e m b r y o w i t h 0 . 5一 1 . 0 c m
l e n g t h w a s a b l e t o f o r m w h o l e P l a n t l e t i n m : d i u rn
一
M S + 2
.
0 m g l
一 1 I B A +
2
.
o m g l
一 ’ G A 3 + l % s u c r o s e
.
T h e e x p e r i m e n t s s h o w e d
:
T h e v a r i e t y a n 生
i n d u e t i o n s t a g e o f i 几 o e u l a t e d o v u l e s a f f e e t e d t h e s o m a t i e e m b r y o g e n e s i s 。
T h e s o m a t i e e m b r jr o g e n e s i s w a s i n d u e t e d w h e n o v u l e s a t t h e u n i n u l e a t e
s t a g e w e r e i n o e u l a t e d
。
I t s i n d u c t i o o f r e q u e n e y w a s 3
。
3写一 5 . 0 % . B A i t i t h e
m e d i u m w a s n e e e s s a r y f o r t h e i n d u e t i o n o f s o m a t i e e m b r y o g e n e s i s a n 比
吧 m b r y o d e v e l o p m e n t 。 W e a l s o h a d e s t a b l i s h e d 5 0 皿a t i e e m b r y o 孟e n i e e a l l u s
e l o n e d i r e e t l y f r o m
.
s o m a t i e e e l l o f b l a e k e u r r a n t e u l t i v a r a n d m a i n t a i n n e d
m o r e t h a n t w o y e a r s w i t h t h e a v a i b i l i t y o f e m b r y o g e n e s i多. I t e a n b e u s e d
a 5 a f a v o 往 r a b l e m a t e r i a l f o r t h e m i e r 卯 r o P a g a t i o n , m u t a t i o n s e l e e t i o n o f
e e l l s u s P e n s i o n e u l t u r e
, P r o t o P I公 s t i s o l a t i o n a n d
一
e u l t让 r e a n d g e n e t i e m a n -
i P u l a t i o n i n b l a e k e u r r a n t
。
K e y w o r d: B l a e k e u r r a n t ( R ib己s , 21了 r u ` ,: L . ) ;
1 2: 刀 i t下 0 e u l t u r e ; 5 0 , n a t i e e m b r y o ;
U n f o r t i l i z e d o 丫 u l e s ;
P l a n t l e t r e g e n e r a t i o n
。
参 考 文 献
〔 l 〕
〔 2 〕
〔 3 〕
〔 4 〕
〔 5 〕
〔 6 〕
〔 7 〕
〔 8 〕
〔 9 〕
〔 2 0〕
乏1 1〕
〔 1 2〕
〔 1 3〕
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s ( l )
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32 ( 7 )
:
5 0 5一 5 0 。
阎华 , 笑燕 . 1 9 8 5 : 向 日葵未受精胚珠培养时胚状体发生的显微观察 , 植物学报 . 27 : 口一 18
B u t t o n
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u n f e r t i l i z e d o v u l e s o f g
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c i e n e e H e r t i
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Z a t y k
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o f r e d e u r r a n t
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P la n t S
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4 : 2 5一 2 5 3 .
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C u r r e n t S e i e n e e
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4 8 : 4 5 6一` 5 了.
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2
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a e会 e u r r a n t ( R i b e s 皿 i g r u m I J . ) 、 H o r t i e . R e s . Z r : 9 。一 1 0 1 .
3期 李勇 :黑穗醋栗未受精胚珠培养诱导体细胞胚状体和植株再生的研究
图 版 说 明
1
.未受 精胚珠产生的愈伤组织 。 箭头所示为胚性愈伤组织。 2.胚状体。 E一表示胚状 体 .
时 期的 胚状 体 . 4
7
.胚状体和试管苗 。
.球形胚 . 9一球 形胚。 5.胚状体纵切。 6.萌发胚拼体 . r一根 部横切 。 s一芽部 .
8
.胚性愈伤组织无性系 。 9 .单个子叶胚状体 。 c一子 叶。 1 0.小植株 .
Ex Pla a nt io o n fl Pat e
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1
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r y o s ( E )
.
F 19
.
3
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N
u皿 e r o u s , d i f f e o n t s t a g尺 。 f o m b r y o s二 F i g . 连. G l o b u la r o rn b r y o s ( g ) . F ig . 5 .E二 b r y o s ( v e r t i e a l s e e t i o n ) . F ig . 6 . G e r扭 i n a t e e m b r y o . R o o t ( r . e r o s s s e e t io n ) , S h o o t ( s ) `F 19 . 7 . Em b r y o s a n d s h o o t s i n v , t r o . F i g . s . E皿 b r v o g e 几 ie e a l l u , e l o o e . F i g 、 。 `
E二 b r y o w i t h s i n g l e e o t了 le d o往 ( e ) . F i g . 1 0 . R e g e n e r a t e d p l a n t le t .