全 文 ：BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 16 卷　第 1 期 1996 年　1 月
Vol.16　No.　1 Jan., 　1996
对 TMV 不同抗性番茄品种叶绿体 DNA 的 RAPD分析①
汪清胤　傅桂荣　刘艳霞
黄永芬　郑洪刚　谢纬武　王　斌
THE ANALYSIS OF ct-DNA RESISTANT AND SENSITIVE
TO TMV WITH RAPD IN TOMATO VARIETIES
Wang Qing-yin　Fu Gui-rong　Liu Yan-xia
Huang Yong-fen　Zhang Hong -gang　Xie Wei-wu　Wang Bin
　　〔摘　要〕　本实验对 TMV抗性和敏感的两个番茄品种 ct-DNA进行 RAPD
分析 ,结果发现在 20个引物中有 4个引物的扩增产物存在明显差异 ,共显示出 14
条差异带。这可能是由于 ct-DNA 碱基顺序变异或小片段 DNA插入或缺失造成
的 ,深入研究将对探讨番茄抗 TMV的分子机理 ,进而用遗传工程方法培育抗病品
种具有重要意义 。
关键词　番茄;叶绿体 DNA;TMV;RAPD
烟草花叶病毒(TMV)对番茄生产影响很大 。在我们以前的研究中 ,曾发现:(1)一些抗
TMV 的品种叶片呈淡黄绿色;(2)苹果酸脱氢酶同工酶分析显示其与 TMV有一定相关性 ,
而叶绿体中普遍存在有苹果酸脱氢酶〔1〕;(3)感染 TMV后 ,抗性品种较敏感品种的叶绿体
类囊体膜蛋白多一条 26kd的多肽带〔3〕 。另外 ,也有人指出病毒感染植物体后 ,叶绿体超微
结构也发生变化 。由此我们推测番茄感染 TMV 与否可能和叶绿体基因组有一定的相关
性。本实验用对 TMV抗性不同的番茄品种叶绿体 DNA(ct-DNA)为材料进行了 RAPD
分析 ,探讨番茄抗 TMV 的分子机理。
RAPD 是 Randomly Amplified Polymo rphic DNA 的缩写 ,这是近几年才出现的新技
术〔4〕 。由于它具有许多优点 ,现已广泛地应用于植物分子生物学研究 。我们在对 TMV 不
同的抗性番茄品种 ct-DNA进行限制性内切酶分析的基础上 ,又对其进行了 RAPD分析 ,
从而进一步验证限制性内切酶分析结果 ,为番茄抗病毒研究开辟新的领域 。
① 汪清胤 ,傅桂荣 ,刘艳霞 ,黄永芬:黑龙江 ,哈尔滨 ,哈尔滨师范大学生物系(Biology Department of Harbin Normal
University Harbin , 150080 , Heilongjiang)。郑洪刚 ,谢纬武 ,王斌:北京 ,中科院遗传研究所(Institute of Genetics , Academia Sinica , Beijing , 100101)。＊国家自然科学基金资助项目。
1995年 5月收到本文。
材料和方法
一 、材　　料
1 、用番茄属(Lycoperisicon)普通番茄种(L.esculentummiu)的两个栽培品种:(1)抗
TMV 品种为“中蔬四号”;(2)对 TMV 敏感品种为“粉红甜肉” ,上述二品种经田间栽培表现
明显 。取种子经 10%Na3PO4 消毒 ,自来水冲洗后 26℃温箱中催芽 ,播于温室培养箱中 ,经
移植待长出 5—6片真叶时 ,采取叶片 ,用自来水和蒸馏水洗净 ,滤纸吸干 ,于 4℃冰箱中饥
饿 24小时后称重 ,置-20℃冰箱中保存备用 。
2 、PCR扩增用 Perkin-Elmer Cetus公司 480型扩增仪 。
3 、RAPD扩增引物采用 Operon公司 ki t AB的 20个引物:OPAB01—OPAB20。
二 、方　　法
1 、ct-DNA提取 ,纯化按改进的 G.Bookjans高盐法进行〔2〕 。
2 、RAPD扩增　将“中蔬四号”和“粉红甜肉”ct-DNA纯化后 ,在 0.8%琼脂糖凝胶中
电脉 ,检查其纯度和浓度后 ,用水稀释 5—10倍 ,以其为模板 ,按下述方法进行扩增:
(1)反应混合物:模板 DNA 1μl(20ng),引物 1μl(25ng), Taq DNA聚合酶 0.3μl(1.5μ),
dNTP 2μl(反应浓度 0.2mM), 10×Buf fer 2.5μl , 加水至总体积 25μl , 同时设不加模板
DNA的对照反应 。离心混合各成分 ,每管加盖 40μl石蜡油 ,放入 Cetus公司 480型 PCR仪
中 ,按下述要求设定程序 ,循环开始 。
(2)反应温度及循环次数:94℃1分 ,37℃1分 , 72℃2分 ,40个循环后 ,于 72℃下保温 5
分钟 。
3 、电泳　在上述各管中分别加入 8μl Ⅱ型加样缓冲液 ,混匀 ,点样量10μl ,在1.4%的水
平琼脂糖凝胶中电泳 5—6 小时 , 电压 5v/cm , 同时加 Sigma 公司 Marker Ⅵ (＊
pBR328DNA.Bg1I+pBR328 DNA Hinf I)作为分子量标记。
4 、PAPD扩增片段分子量计算　用 Marker Ⅵ 各片段迁移距离对分子量(kb)进行半对
数作图 ,并绘标准曲线 ,根据 RAPD各扩增片段迁移距离求出对应的分子量。
结果与讨论
一 、对 TMV不同抗性番茄品种 ct-DNA 进行了 RAPD扩增 ,其产物经 1.4%琼脂糖凝
胶电泳 ,结果在 Operon公司 kit AB的 20个引物中 ,发现其中 4个引物 OPAB03 ,OPAB04 ,
OPAB06 ,OPAB11的扩增产物存在明显差异(该结果经过 4次重复),见图 。用 Sigma 公司
的分子量标记Ⅵ 作为分子量标准 ,计算各扩增片段的分子量 ,结果见下表。
从图 ,表可见(1)在引物OPAB03(5 TGGCGCACAC3 )中 ,抗性品种比敏感品种多出一
条强带和两条弱带 , 分子量分别为 1180bp 和 1766bp , 1520bp;(2)在引物 OPAB04(5
GGCACGCG TT3 )中 ,抗性品种比敏感品种多两条弱带 ,分子量为 1100bp和 1230bp;(3)在
引物 OPAB06(5 GTGGCTTGGA3 )中 ,抗性品种比敏感品种多两条强带和一条弱带 ,分子
量分别为 1650bp ,3100bp和 1766bp;(4)在引物 OPAB11(5 G TGCGCAATG3 )中 ,抗性品
种比敏感品种多三条强带和两条弱带 ,分子量分别为 1044bp 、1140bp 、1520bp 和 1300bp 、
1950bp 、敏感品种比抗性品种多一条 1180bp强带 。
1151 期　　　　　　汪清胤等:对 TMV 不同抗性番茄品种叶绿体 DNA的 RAPD分析
番茄 ct-DNA RAPD扩增片段电泳图谱
1 , 10为分子量标记;2 , 4 , 6 , 8的粉红甜肉 , 3 , 5 , 7, 9为中蔬四号。
2 , 3为引物 OPAB03;4 , 5为引物OPAB04;6 , 7为引物OPAB06;8 , 9为引物OPAB11。
表 番茄 ct-DNA RATD 扩增片段分子量(bp)
引物 中蔬四号 粉红甜肉 引物 中蔬四号 粉红甜肉
1766＊ 3100＊＊
1520＊ 1766＊
OPAB02 1180＊＊ 1650＊
1100 1100 OPAB06 1180 1180
980 980 860 860
1950＊
1520＊＊
1230
＊
1300
＊
OPAB04 1100＊ OPAB11 1180＊
1140
＊＊
1033 1033 1044＊＊
986 986
　　注:“中蔬四号”“粉红甜肉” ct-DNA 4种引物 RAPD扩增片段的分子量(bp)
二 、本实验选用的对 TMV 抗性和敏感品种均属番茄属普通番茄种 ,它们的 ct-DNA
限制性内切酶谱也有明显差异 ,在本次 RAPD分析中 ,二者也有明显差异 ,我们推测这可能
是由于叶绿体基因组点突变 ,小部分碱基变异或小片段核苷酸序列的插入或缺失造成的 ,而
这些小的碱基变化足以使处于保守状态的叶绿体基因组性质发生改变 ,从而导致抗 TMV
的有关表型出现 。ct-DNA在种内的保守性 、叶绿体细胞器与染病机理的关系 、实验所选
用材料的遗传背景及其限制性内切酶谱差异 、RAPD分析等项结果 ,使我们认识到叶绿体基
116 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
因组是与细胞核中的 TMV 抗性基因共同决定对 TMV 的抗性 ,深入研究番茄不同抗性品
种 ct-DNA 差异 ,对进一步揭示番茄抗 TMV 的分子机理 ,进而用遗传工程技术培育抗
TMV 新品种具有重大意义。
三 、RAPD是通过 PCR反应特异扩增DNA片段的多态性 ,一般 RAPD引物生产厂家都
附有标准扩增条件 ,但对于某个具体问题 ,必须摸索好实验条件 ,才能取得最佳效果 ,本实验
中所采用的主要条件是:
1 、扩增反应时间和温度　变性温度选用 94℃, 1分钟;退火温度 37℃,1分钟产率较高;
延伸温度用 72℃,2分钟 。
2 、模板 DNA　扩增反应中模板分子数越多 ,则错误扩增越少 ,因此模板 DNA需用一定
的量 ,一般每 25μl反应混合物中 ,模板 DNA 加入量应为 25μg 为宜 ,并且要求 DNA纯度较
高。
3 、引物　引物长度一般以 10个核苷酸长度为好 ,G+C 含量变化在 50—70%之间 ,引
物中每一个核苷酸的变动都会导致扩增产物不同 ,因而产生多态性 ,灵敏度高 ,很容易检出
单个核苷酸顺序的变异 ,这一点是 RFLP 无法比拟的。
4 、反应混合物中的离子强度　Mg++的浓度对 RAPD反应的特异性和扩增效率影响较
大 ,当 Mg++浓度为 2mM 时 ,对 Taq酶激活能力最高;一般在 RAPD反应中 ,对 Mg++浓度
为 1.5-2.0mM 。
5 、dN TP 浓度　四种 dN TP 浓度通常为 100μM(0.1mM)为宜。
6 、Taq酶用量　反应混合物中所用酶量范围在 1—4u/1μl ,本实验为 0.5u/25ul效果较
好。
7 、注意污染 。
ABSTRACT
In the present study , we analyse the ct-DNA of tomato w hich is resistant and sensitive to
TMV w ith RAPD.We find difference in four of the twenty primers.14 dif ferent bands are
showed.
We guess this maybe alternation of base sequence or insertion or deletion of short DNA se-
quence.It w ill play an important role in study of machinism of TMV resistance and construc-
tion of virus resistant tomato.
Key words　Tomato;ct_DNA;TMV;RAPD.
参　　考　　文　　献
〔1〕 刘珠耀等 , 1983:植物生理学通讯 ,(2):23—26。
〔2〕 孙德君等 , 1991:哈尔滨师范大学学报 ,自然科学版, 7卷 ,生物专辑:213—219。
〔3〕 黄永芬等 , 1991:哈尔滨师范大学学报 ,自然科学版, 7卷 ,生物专辑:207—212。
〔4〕 Williams , J.G.K.et al , 1990:Nucl Acids Res., 18:6531-6535.
1171 期　　　　　　汪清胤等:对 TMV 不同抗性番茄品种叶绿体 DNA的 RAPD分析