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Degradation dynamics of Cry1Ab insecticidal protein within transgenic Bacillus thuringiensis corn plant debris under different conditions

不同条件下转cry1Ab基因玉米植株残体中杀虫蛋白降解动态



全 文 :植物保护学报 Journal of Plant Protection, 2015, 42(6): 1025 - 1029 DOI: 10􀆰 13802 / j. cnki. zwbhxb. 2015􀆰 06􀆰 025
基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08011⁃003)
∗通讯作者(Author for correspondence), E⁃mail: zywang@ ippcaas. cn
收稿日期: 2015 - 05 - 23
不同条件下转 cry1Ab基因玉米植株残体中
杀虫蛋白降解动态
邢珍娟1,2   白树雄2   何康来2   王振营2∗
(1.吉林省农业科学院, 长春 130124; 2.中国农业科学院植物保护研究所,
植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)
摘要: 为明确转 cry1Ab 基因玉米植株残体中 Cry1Ab 杀虫蛋白在不同条件下的降解动态,选取转
cry1Ab 基因玉米MON810 和 Bt11,采用 ELISA方法测定 4 种条件下秸秆中 Cry1Ab杀虫蛋白的残留
量。 结果表明,在不同条件、不同取样时间,2 种玉米秸秆中 Cry1Ab 杀虫蛋白的残留量差异显著;
整株秸秆中的 Cry1Ab杀虫蛋白降解速度比粉碎后的慢;秸秆粉碎埋入土壤后播种冬小麦,玉米秸
秆中 Cry1Ab杀虫蛋白降解速度最快,且可完全降解;在不同条件下,MON810 玉米秸秆中 Cry1Ab
杀虫蛋白的降解速度比 Bt11 玉米慢,MON810 和 Bt11 玉米秸秆中 Cry1Ab 杀虫蛋白的 DT50分别为
10􀆰 2 ~ 207􀆰 8、13􀆰 6 ~ 124􀆰 0 d,DT90分别为 185􀆰 1 ~ 368􀆰 3、45􀆰 2 ~ 224􀆰 0 d。 研究表明,在不同条件下
MON810 和 Bt11 玉米秸秆中 Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度不同,依次为秸秆粉碎后埋在土壤后种
植冬小麦 >秸秆粉碎埋在玉米田土壤中 >秸秆粉碎后放在地表 >整株秸秆放在地表。
关键词: 转 cry1Ab基因玉米; 植株残体; Cry1Ab杀虫蛋白; 降解
Degradation dynamics of Cry1Ab insecticidal protein within transgenic
Bacillus thuringiensis corn plant debris under different conditions
Xing Zhenjuan1,2   Bai Shuxiong2   He Kanglai2   Wang Zhenying2∗
(1. Jinlin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130124, Jilin Province, China; 2. State Key Laboratory for
Biology of Plant Disease and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)
Abstract: In order to clarify the degradation dynamics of Cry1Ab insecticidal protein in the plant debris
of cry1Ab transgenic corn under different conditions, the contents of Cry1Ab protein in the cry1Ab
transgenic corn MON810 and Bt11 were quantified by using enzyme⁃linked immunosorbent essay
(ELISA) method. The results showed that there were significant differences in the degradation rates of
Cry1Ab insecticidal protein of MON810 and Bt11 under different conditions and sampling times. The
degradation rate of Cry1Ab insecticidal protein in the whole plant was slower than that in the smashed
plant debris. The degradation rate of the Cry1Ab insecticidal protein in the smashed stalks buried in the
winter wheat field was faster than the other treatments. The degradation rate of the Cry1Ab insecticidal
protein in MON810 was slower than that of Bt11. The DT50 of the Cry1Ab insecticidal protein in MON810
and Bt11 were 10􀆰 2 - 207􀆰 8, 13􀆰 6 - 124􀆰 0 d, and the DT90 values were 185􀆰 1 - 368􀆰 3, 45􀆰 2 - 224􀆰 0
d, respectively. The degradation rates of Cry1Ab insecticidal protein were different under different
conditions. In four treatments, the degradation rate of Cry1Ab insecticidal protein in the smashed stalks
buried in winter wheat field was the highest, followed by the smashed stalks buried in after⁃harvest corn
field, in the smashed stalks placed on the surface of the soil, and in whole corn plants on the ground.
Key words: cry1Ab transgenic corn; plant debris; Cry1Ab insecticidal protein; degradation
    转 Bt基因玉米是全球商品化最快的抗虫转基
因作物之一,截止 2013 年全球种植面积已达 1􀆰 752
亿 hm2(James,2014)。 目前,国外商业化的转 Bt 基
因玉米主要是以表达 Cry1Ab 杀虫蛋白的 MON810
和 Bt11 为主,Cry杀虫蛋白对鳞翅目、鞘翅目等害虫
具有杀虫活性。 Bt作物中表达的 Bt 杀虫蛋白可通
过根系分泌物 ( Saxena et al. , 2002a;王建武等,
2005)、花粉飘落 ( Losey et al. , 1999;邢珍娟等,
2008)、残茬分解或秸秆还田(邢珍娟等,2008;Palm
et al. ,2011)等方式进入土壤生态系统,由于 Bt 杀
虫蛋白能被黏土矿物(蒙脱石和高岭石)、腐殖酸和
有机矿物聚合体等土壤表面活性颗粒快速吸附,导
致其在土壤中难以降解,长期累积有可能对土壤生
态环境造成不利影响(Stotzky,2004;刘洁等,2010)。
目前,Bt杀虫蛋白在土壤中的降解规律及残留已经
成为 Bt作物土壤生态风险评价的核心问题,转 Bt
基因玉米秸秆还田后对土壤生态系统的影响已受到
广泛关注 (Hopkins & Gregorich,2005;李云河等,
2005),而了解土壤中 Bt 杀虫蛋白的降解动态是解
决此问题的关键(Morra,1994)。
玉米秸秆还田是目前各国普遍采用的可持续农
业技术,它可以通过地表覆盖和埋入土壤 2 种方式
进行。 对转 Bt基因玉米秸秆还田后 Bt杀虫蛋白的
降解动态研究主要是在室内恒温模拟条件下进行的
(王建武和冯远娇,2005),但由于各研究中所选取
的土壤类型及采用的材料、方法等不同,导致所得到
的 Bt杀虫蛋白降解时间差异很大。 Sims & Ream
(1997)报道 Bt棉残体中 Bt杀虫蛋白在实验室和田
间不同条件下消散半衰期(50% disappearance time,
DT50)分别为 15􀆰 5 d和 31􀆰 7 d;Saxena et al. (2002a,
b)研究结果显示,Bt玉米根系分泌物和残体降解释
放的 Bt 杀虫蛋白在土壤中残留期可达 350 d;纯化
Bt 杀虫蛋白在土壤中降解的 DT50、90% 消散期
(90% disappearance time,DT90)分别为 0􀆰 6 d 和 6􀆰 9
d(Herman et al. ,2002);Zwahlen et al. (2003)把传
粉期的 Bt 玉米组织埋入土壤,200 ~ 240 d仍可检测
到 Bt杀虫蛋白。 可见,大田条件下玉米秸秆中 Bt
杀虫蛋白的含量及降解与残留动态是研究 Bt 作物
对土壤生态系统风险影响的关键。
因此,本试验以 2 种转 cry1Ab 基因抗虫玉米
MON810 和 Bt11 为对象,研究了转 Bt基因玉米植株
残体中杀虫蛋白在不同条件下的降解动态,以期为
转 Bt抗虫作物生态风险性评价和为转基因生物安
全管理提供科学依据。
1 材料与方法
1􀆰 1 材料
供试植物:转 Cry1Ab基因玉米 MON810 和 Bt11
对应品种为 DK647BTY 和 NX4777,其亲本对照非
转基因玉米品种为 DK647 和 NX4906,分别来自美
国孟山都公司和瑞士先正达公司。 小麦品种为苏
1661 红麦,由中国农业科学院植物保护研究所麦类
病害组提供。
试剂及仪器:Bt⁃Cry1Ab 酶联免疫试剂盒,美国
Agdia公司;Multiskan Ascent型酶标仪,芬兰 Thermo
公司;750 W型超声波粉碎仪,美国科尔帕默公司。
1􀆰 2 方法
1􀆰 2􀆰 1 玉米秸秆的不同处理
2005 年 6 月 21 日将 4 种供试玉米分别种植于
中国农业科学院植物保护研究所试验田,每小区种
植 1 个品种,每个品种种植 3 个小区,共 12 个小区,
每小区面积为 6 m × 5 m,行距 60 cm,株距 33 cm。
各小区间隔 1 m,小区随机排列,生长期不施用任何
农药,常规管理。
玉米成熟后,将收获后的玉米秸秆分为 2 组,
一组是分别将 4 种玉米的整株秸秆分别放置试验
田地表;另一组分别将 4 种玉米模拟秸秆还田处
理,剁碎后混匀,用孔径 2 mm 网袋分装(10 cm ×
15 cm),每袋 70 g,每种玉米分装 90 袋,其中 30 袋
埋入土壤中(深度 20 cm),每穴(20 cm × 30 cm)
1 袋,穴间距 1 m;30 袋放置在地表,将网袋系在铁
丝上固定,袋间距 1 m;30 袋埋入土壤中(深度 20
cm),每穴(20 cm × 30 cm)1 袋,穴间距 1 m,然后
在其上按照常规方法播种冬小麦。 从 2005 年 10
月 15 日开始,分别在第 15、30、60、90、120、150、
180、210 和 240 天对每种玉米进行取样,每种玉米
每个处理取 3 袋,取回后立即用液氮速冻处理,于
- 20℃冰箱保存备用。
1􀆰 2􀆰 2 Cry1Ab杀虫蛋白含量及降解时间的测定
采用 ELISA法测定玉米植株残体中 Cry1Ab 杀
6201 植  物  保  护  学  报 42 卷
虫蛋白的含量。 将取回的样品灭菌剪碎,充分混匀,
分别放入灭菌研钵中,加入液氮,研磨成粉末状。 各
称取 0􀆰 1 g样品放入 2 mL离心管,加入提取缓冲液
1 × PBST,4℃静止 30 min;2 ~ 3℃下超声波粉碎 1
min,然后12 000 r / min 离心 10 min,取上清液。 参
照 Bt⁃Cry1Ab 酶联免疫试剂盒说明书测定 Cry1Ab
杀虫蛋白的含量。
应用 SigmaPlot 8􀆰 2 软件回归向导中非线性参
数估计求解模型(Marquardt⁃Levenberg 算法),采用
最小二乘法求得 DT50和 DT90。 DT50即降解初始秸
秆中 Bt杀虫蛋白含量 50%所需要的时间;DT90即
降解初始秸秆中 Bt 杀虫蛋白含量 90%所需要的
时间。
1􀆰 3 数据分析
应用 SAS 8􀆰 1 软件进行统计分析,采用 Duncan
氏新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2􀆰 1 Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态
在 4 种条件下,Bt11 和 MON810 玉米整株秸秆
中的 Cry1Ab杀虫蛋白降解速度比粉碎后的慢;秸秆
粉碎埋入土壤后播种冬小麦,玉米秸秆中 Cry1Ab杀
虫蛋白降解速度最快,且显著高于其它 3 个处理。
Cry1Ab杀虫蛋白降解速度依次为秸秆粉碎埋入土
壤后播种冬小麦 >秸秆粉碎埋在玉米田土壤中 >秸
秆粉碎放地表 >整株放地表(表 1)。
表 1 不同取样时间 Bt11 和MON810 秸秆中 Cry1Ab杀虫蛋白的残留量
Table 1 The residues of the Cry1Ab insecticidal protein in Bt11 and MON810 stalks at different sampling days ng / g
取样天数
Sampling
time
(d)
Bt11 MON810
整株秸秆
放地表
Whole stalk
on the
ground
秸秆粉
碎放地表
Smashed
stalk on
the ground
秸秆粉碎埋
在玉米田
土壤中
Smashed
stalk buried
in corn field
秸秆粉碎埋
在土壤后播种
冬小麦
Smashed stalk
buried in winter
wheat field
整株秸秆
放地表
Whole
stalk on the
ground
秸秆粉碎
放地表
Smashed
stalk on
the ground
秸秆粉碎埋
在玉米田
土壤中
Smashed
stalk buried
in corn field
秸秆粉碎
埋在土壤后
播种冬小麦
Smashed stalk
buried in winter
wheat field
0 16􀆰 76 ±
1􀆰 57 Aa
16􀆰 46 ±
1􀆰 20 Aa
16􀆰 36 ±
0􀆰 43 Aa
16􀆰 39 ±
0􀆰 57 Aa
23􀆰 18 ±
2􀆰 19 Aa
22􀆰 66 ±
0􀆰 89 Aa
22􀆰 31 ±
2􀆰 04 Aa
22􀆰 46 ±
0􀆰 48 Aa
15 15􀆰 78 ±
0􀆰 80 Aa
13􀆰 59 ±
0􀆰 66 Bb
10􀆰 48 ±
0􀆰 14 Cb
6􀆰 94 ±
0􀆰 55 Db
22􀆰 24 ±
0􀆰 59 Aab
21􀆰 35 ±
0􀆰 71 Aa
21􀆰 39 ±
0􀆰 85 Aa
11􀆰 39 ±
1􀆰 54 Bb
30 14􀆰 56 ±
0􀆰 73 Ab
12􀆰 48 ±
1􀆰 68 Bb
8􀆰 45 ±
0􀆰 47 Cc
3􀆰 52 ±
0􀆰 20 Dc
21􀆰 36 ±
0􀆰 53 Abc
21􀆰 12 ±
2􀆰 31 Aa
15􀆰 70 ±
1􀆰 54 Bb
8􀆰 60 ±
0􀆰 22 Cc
60 13􀆰 03 ±
0􀆰 63 Ac
10􀆰 79 ±
0􀆰 24 Bc
6􀆰 07 ±
1􀆰 61 Cd
1􀆰 78 ±
0􀆰 36 Dd
20􀆰 06 ±
1􀆰 22 Acd
17􀆰 53 ±
1􀆰 04 Bb
13􀆰 17 ±
0􀆰 41 Cc
6􀆰 73 ±
1􀆰 30 Dd
90 9􀆰 31 ±
0􀆰 45 Ad
8􀆰 63 ±
0􀆰 80 Ad
4􀆰 09 ±
0􀆰 31 Be
1􀆰 76 ±
0􀆰 20 Cd
18􀆰 83 ±
1􀆰 04 Ade
14􀆰 68 ±
0􀆰 52 Bc
12􀆰 59 ±
1􀆰 23 Cc
5􀆰 46 ±
0􀆰 40 De
120 7􀆰 29 ±
0􀆰 29 Ae
6􀆰 96 ±
0􀆰 11 Ae
2􀆰 62 ±
0􀆰 30 Bf
1􀆰 48 ±
0􀆰 48 Cd
17􀆰 59 ±
0􀆰 52 Ae
12􀆰 88 ±
0􀆰 55 Bd
10􀆰 50 ±
0􀆰 43 Cd
4􀆰 54 ±
0􀆰 36 Def
150 6􀆰 81 ±
0􀆰 32 Ae
4􀆰 17 ±
0􀆰 22 Bf
2􀆰 31 ±
0􀆰 11 Cf
0􀆰 19 ±
0􀆰 04 De
15􀆰 89 ±
0􀆰 57 Af
11􀆰 29 ±
0􀆰 34 Be
7􀆰 96 ±
1􀆰 27 Ce
3􀆰 67 ±
0􀆰 43 Df
180 2􀆰 42 ±
0􀆰 40 Af
2􀆰 91 ±
0􀆰 81 Af
1􀆰 85 ±
0􀆰 54 Af
0􀆰 11 ±
0􀆰 01 Be
13􀆰 82 ±
0􀆰 20 Ag
7􀆰 59 ±
0􀆰 26 Bf
4􀆰 73 ±
0􀆰 20 Cf
2􀆰 15 ±
0􀆰 14 Dg
210 0􀆰 94 ±
0􀆰 12 Ag
0􀆰 46 ±
0􀆰 02 Bg
0􀆰 75 ±
0􀆰 08 Cg
0􀆰 00 ±
0􀆰 00 De
12􀆰 94 ±
0􀆰 44 Ag
3􀆰 91 ±
0􀆰 46 Bg
2􀆰 45 ±
0􀆰 12 Cg
1􀆰 32 ±
0􀆰 31 Dg
240 0􀆰 14 ±
0􀆰 02 Ag
0􀆰 00 ±
0􀆰 00 Bg
0􀆰 57 ±
0􀆰 07 Cg
0􀆰 00 ±
0􀆰 00 De
7􀆰 25 ±
0􀆰 33 Ah
1􀆰 90 ±
0􀆰 28 Bh
0􀆰 00 ±
0􀆰 00 Ch
0􀆰 00 ±
0􀆰 00 Ch
    表中数据为平均数 ±标准误。 不同大、小写字母表示相同时间不同条件下和相同条件不同时间下 Cry1Ab 杀虫蛋白的残
留量经 Duncan氏新复极差法检验在 P < 0􀆰 05 水平差异显著。 Data in the table are mean ± SE. Different uppercase or lowercase
letters indicate significant difference in the residues of the Cry1Ab toxin at same sampling time under different conditions or different
sampling times under the same condition at P < 0􀆰 05 level by Duncan’s new multiple range test, respectively.
72016 期 邢珍娟等: 不同条件下转 cry1Ab基因玉米植株残体中杀虫蛋白降解动态
    在 4 种条件下,Bt11 玉米秸秆中 Cry1Ab 杀虫
蛋白的残留量先呈负指数大量快速降低,然后缓慢
降解。 在相同取样时间不同条件下,Bt11 玉米秸秆
中 Cry1Ab 杀虫蛋白的残留量存在显著差异;在第
240 天,Cry1Ab 杀虫蛋白仅微量残留或完全降解;
秸秆粉碎埋入玉米田或埋入土壤后播种冬小麦,第
15、30、60 天玉米秸秆中 Cry1Ab 杀虫蛋白的残留量
差异显著(表 1)。
在 4 种条件下,MON810 玉米秸秆中 Cry1Ab 杀
虫蛋白残留量降解动态与 Bt11 玉米相似。 除第 15
和 30 天外,在相同取样时间不同条件下,MON810
玉米秸秆中 Cry1Ab杀虫蛋白的残留量均差异显著;
Cry1Ab杀虫蛋白在 240 d 时仅微量残留或完全降
解;整株秸秆放地表和秸秆粉碎埋入土壤播种冬小
麦后,第 15、30、60 天玉米秸秆中 Cry1Ab 杀虫蛋白
的残留量差异显著(表 1)。
2􀆰 2 Cry1Ab杀虫蛋白的降解时间
在 4 种条件下,Bt11 玉米秸秆中 Cry1Ab 杀虫
蛋白的 DT50分别为 124􀆰 0、97􀆰 0、34􀆰 7、13􀆰 6 d,DT90
分别为 224􀆰 0、198􀆰 6、168􀆰 8、45􀆰 2 d;MON810 玉米
秸秆中 Cry1Ab 杀虫蛋白的 DT50 分别为 207􀆰 8、
133􀆰 9、102􀆰 8、 10􀆰 2 d, DT90 分别为 368􀆰 3、 236􀆰 5、
200􀆰 1、185􀆰 1 d。 MON810 玉米秸秆中 Cry1Ab 杀虫
蛋白的降解速度比 Bt11 玉米慢(表 2)。
表 2 MON810 和 Bt11 玉米秸秆中 Cry1Ab杀虫蛋白
在不同条件下降解的 DT50和 DT90
Table 2 DT50 and DT90 of the degradation of Cry1Ab insecticidal
protein in MON810 and Bt11 under different conditions
处理
Treatment
品种
Variety
DT50 DT90
整株秸秆放地表 Mon810 207􀆰 8 368􀆰 3
Whole stalks on the ground Bt11 124􀆰 0 224􀆰 0
秸秆粉碎放地表 Mon810 133􀆰 9 236􀆰 5
Smashed stalks on the ground Bt11 97􀆰 0 198􀆰 6
秸秆粉碎埋在玉米田土壤中 Mon810 102􀆰 8 200􀆰 1
Smashed stalks buried in corn field Bt11 34􀆰 7 168􀆰 8
秸秆粉碎埋土壤后播种冬小麦 Mon810 102􀆰 0 185􀆰 1
Smashed stalks buried in winter
wheat field
Bt11 13􀆰 6 45􀆰 2
    DT50: 消散半衰期; DT90: 90%消散期。 DT50: 50% dis⁃
appearance time; DT90: 90% disappearance time.
3 讨论
Bt作物秸秆中的 Bt 蛋白在大田环境中降解的
主要途径包括昆虫消耗、太阳光降解作用、微生物降
解和最终矿化作用等(Koskella & Stotzky,1997;王
建武等,2009)。 本试验研究了玉米秸秆粉碎埋入
土壤和整株放地表 2 种秸秆还田方式对 Cry1Ab 杀
虫蛋白降解速率的影响,结果显示放在地表的整株
秸秆中 Cry1Ab杀虫蛋白比粉碎秸秆后放在地表的
降解慢,这可能与整株秸秆比粉碎的腐烂慢有关。
本研究还表明,转 Bt 基因玉米秸秆粉碎还田
后,留在地表或埋入土壤,在第 2 年春作物种植前或
冬小麦收获时其秸秆中 Cry1Ab 杀虫蛋白仅有少量
残留或完全降解,特别是秸秆还田后种植冬小麦,埋
入土壤的粉碎秸秆中 Cry1Ab杀虫蛋白可完全降解,
且降解速度显著高于其它 3 种处理。 这可能是由于
土壤湿度大、温度高,秸秆腐烂较快,Cry1Ab 杀虫蛋
白在自由态下被土壤微生物分解利用。 而且,小麦
生长活动有利于土壤微生物活动,加快了秸秆的分
解速度,更有利于 Cry1Ab 杀虫蛋白降解,也可能是
麦田土壤中的 pH 更有利于 Cry1Ab 杀虫蛋白降解
(李珍,2009)。 因此,秸秆还田时把秸秆埋入土壤
中,有利于转基因玉米中杀虫蛋白的降解。
本试验的 4 个处理中 Cry1Ab 杀虫蛋白的降解
动态均为前期呈现负指数大量快速降低和中后期缓
慢下降 2 个阶段,这与已报道的转 Bt基因玉米在室
内土壤中的降解动态一致(王建武等,2005;张运红
等,2007)。 本研究发现在 240 d 后 Bt11 和 Mon810
玉米秸秆中仍可检测到 Cry1Ab杀虫蛋白,相关研究
表明,在培养试验中 134、200 或 350 d 后仍可检测
到土壤中 Cry1Ab 杀虫蛋白的存在(Saxena et al. ,
2002b;王建武等,2003;Zwahlen et al. ,2003),而 Bt
棉花叶片中 CrylAc 杀虫蛋白在土壤中至次年 4 月
下旬才完全降解(李云河等,2005),这说明 Bt 蛋白
可能在土壤中长期存在,因此,在秸秆还田后还需长
期追踪,从而进一步评价转 Bt基因作物秸秆还田对
土壤生态系统功能的影响。 但也有报道称在不同条
件下 Bt蛋白埋在土壤中降解较快,范慧芝等(2010)
认为在淹水和非淹水条件下玉米秸秆中 Bt 蛋白降
解的 DT50分别为 0􀆰 31 d和 0􀆰 40 d,DT90分别为 1􀆰 18
d和 1􀆰 55 d,这与本试验结果差别很大,可能是由于
Bt蛋白种类、土壤类型、土壤温湿度、土壤中 Bt杀虫
蛋白浓度以及测定方法等不同所造成的。 因此,制
定统一规范的研究方法对明确 Bt 杀虫蛋白在土壤
中残留和降解规律至关重要。
参 考 文 献 (References)
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(责任编辑:王  璇)
92016 期 邢珍娟等: 不同条件下转 cry1Ab基因玉米植株残体中杀虫蛋白降解动态