全 文 ：植物营养与肥料学报 ２０１６，２２（３）：６８７－６９６ ｄｏｉ牶１０１１６７４／ｚｗｙｆ．１５０１９
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｎｕｔｒｉｆｅｒｔ．ｏｒｇ
收稿日期：２０１５－０１－１４　　　接受日期：２０１５－０３－３１　　　网络出版日期：２０１５－１２－１１
基金项目：国家自然科学基金项目（４１２７１２７４）；浙江省高等学校访问学者教师专业发展项目（ＦＸ２０１３０５７）资助。
作者简介：沈秋兰（１９８９—），女，浙江海宁人，硕士研究生，主要从事土壤生物与生物化学研究。Ｅｍａｉｌ：ｌｙｎｎｓｑｌ＠１６３ｃｏｍ
通信作者 Ｅｍａｉｌ：ｘｕｑｉｕｆａｎｇ＠ｚａｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
阔叶林改种毛竹（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）后
土壤固氮细菌 ｎｉｆＨ基因多样性的变化
沈秋兰，何冬华，徐秋芳，程 敏，毛新伟，李永春，陈俊辉
（浙江农林大学环境与资源学院，浙江省森林生态系统碳循环与固碳减排重点实验室，浙江临安 ３１１３００）
摘要：【目的】毛竹是喜氮植物，土壤氮素水平对毛竹生长至关重要。生物固氮是土壤氮素的重要来源，因此，探索
阔叶林改种毛竹后土壤固氮细菌和土壤氮素的变化具有重要意义。【方法】选择立地条件相近的毛竹林（１００多年
前由阔叶林改种而来）和阔叶林，每种林地在东北坡向位置随机选择４个１０ｍ×１０ｍ标准样地，每个标准样地选
取５个采样点，分层采集０—２０ｃｍ（表层）和２０—４０ｃｍ（次表层）土壤样品，分析了土壤 ｐＨ、有机碳、碱解氮、有效
磷、速效钾和含水量等常规理化性质；采用引物对ＡＱＥＲ和ＰｏｌＦ，以土壤总 ＤＮＡ为模板扩增了固氮细菌功能基因
（ｎｉｆＨ）片段，应用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）和实时荧光定量ＰＣＲ（ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ），分析了固氮细菌群落结构、多
样性以及丰度（ｎｉｆＨ基因拷贝数）变化；通过基因克隆测序对土壤固氮细菌进行初步鉴定。【结果】阔叶林改种毛
竹后土壤ｐＨ显著（Ｐ＜００５）提高；毛竹林土壤的含水量、碱解氮以及表层土壤的速效钾显著高于（Ｐ＜００５）同层
的阔叶林土壤，而有效磷则显著（Ｐ＜００５）低于同层的阔叶林土壤。总体来说，阔叶林改种毛竹后土壤养分含量明
显提高；阔叶林土壤固氮细菌ＤＧＧＥ条带数以及多样性指数（ＳｈａｎｎｏｎＷｉｅｎｅｒｉｎｄｅｘ）都高于毛竹林；基于ＤＧＧＥ条
带信息的聚类分析和主成分分析（ＰＣＡ）结果表明，阔叶林和毛竹林区分为２个类群，而同一林分的不同土层之间
差异较小；实时荧光定量ＰＣＲ结果显示，毛竹林土壤的固氮细菌 ｎｉｆＨ基因丰度显著（Ｐ＜００５）高于阔叶林土壤；
通过克隆测序，１４个阳性克隆分别属于２个不同的菌属，其中１３个均为Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，１个为Ａｚｏｈｙｄｒｏｍｏｎａｓｌａｔａ，
条带序列与已知序列的相似度为９３％ ９８％。【结论】阔叶林改种毛竹后土壤固氮细菌的种类减少，而功能基因
丰度却明显增加；土壤氮素水平明显提高，这可能是土壤固氮能力增强的结果。
关键词：毛竹；土壤固氮细菌；氮素
中图分类号：Ｓ１５４３８＋１；Ｓ７９５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００８－５０５Ｘ（２０１６）０３－０６８７－１０
ＶａｒｉａｔｉｏｎｏｆｎｉｆＨｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｓｏｉｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｉｎＭｏｓｏ
ｂａｍｂｏｏ（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）ｐｌａｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｖｅｒｔｅｄｆｒｏｍｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔ
ＳＨＥＮＱｉｕｌａｎ，ＨＥＤｏｎｇｈｕａ，ＸＵＱｉｕｆａｎｇ，ＣＨＥＮＧＭｉｎ，ＭＡＯＸｉｎｗｅｉ，ＬＩＹｏｎｇｃｈｕｎ，ＣＨＥＮＪｕｎｈｕｉ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄＲｅｓｏｕｒｃｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣａｒｂｏｎＣｙｃｌｉｎｇ
ｉｎＦｏｒｅｓｔＥｃｏｓｙｓｔｅｍｓａｎｄＣａｒｂｏｎＳｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｌｉｎａｎ３１１３００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ】ＮｉｔｒｏｇｅｎｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｒｏｍｏｔｉｎｇｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＭｏｓｏｂａｍｂｏｏ，ｔｈｅｍａｊｏｒ
ｓｏｕｒｃｅｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｉｎｆｏｒｅｓｔｓｏｉｌｉｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｌｉｔｌｅｉｓｋｎｏｗｎａｂｏｕｔｔｈｅ
ｉｍｐａｃｔｏｆｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔｔｏｂａｍｂｏｏ（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）ｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｎｃｈａｎｇｅｓｉｎｓｏｉｌｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｓｏｉｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】ＴｗｏｐｌｏｔｓｏｆｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔａｎｄＭｏｓｏ
ｂａｍｂｏｏｓｔａｎｄｓｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｓｉｔｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ａｎｄ４ｓｔａｎｄａｒｄａｒｅａｓ（１０ｍ×１０ｍ）ｗｅｒｅｃｈｏｓｅｎ
ｒａｎｄｏｍｌｙｏｎｔｈｅｎｏｒｔｈｅａｓｔｓｌｏｐｅｉｎｅａｃｈｐｌｏｔ．Ｓｏｉｌｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｏｐｓｏｉｌ（０－２０ｃｍ）ａｎｄｓｕｂｓｏｉｌ
（２０－４０ｃｍ）ｌａｙｅｒｓｓｅｐａｒａｔｅｌｙ．ＳｏｉｌｐＨ，ｏｒｇａｎｉｃｍａｔｅｒ，ａｖａｉｌａｂｌｅＮ，ａｖａｉｌａｂｌｅＰａｎｄｒｅａｄｉｌｙａｖａｉｌａｂｌｅＫｗｅｒｅ
ａｎａｌｙｚｅｄ．ＴｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｗｉｔｈｐｒｉｍｅｒｓＡＱＥＲ
ａｎｄＰｏｌＦｖｉａｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）ａｎｄｑＰＣＲｂａｓｅｄｏｎｎｉｆＨｇｅｎｅ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ
ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｏｆｓｏｉｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｗａｓｓｅｑｕｅｎｃｅｄｂｙｃｌｏｎｉｎｇ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｔｏ
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２２卷
ｔｈｅｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔ，ＭｏｓｏｂａｍｂｏｏｓｔａｎｄｓｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｈｉｇｈｅｒｐＨ，ｍｏｉｓｔｕｒｅ，ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆａｖａｉｌａｂｌｅＮｉｎｂｏｔｈ
ｔｏｐｓｏｉｌａｎｄｓｕｂｓｏｉｌａｎｄｒｅａｄｉｌｙａｖａｉｌａｂｌｅＫｉｎｔｏｐｓｏｉｌ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｓｏｉｌａｖａｉｌａｂｌｅＰｗａｓｍｕｃｈｌｏｗｅｒ．ＴｈｅＤＧＧＥ
ｐｒｏｆｉｌｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＭｏｓｏｂａｍｂｏｏｓｔａｎｄｓｈａｄｌｏｗｅｒｎｕｍｂｅｒｓｏｆｂａｎｄａｎｄＳｈａｎｎｏｎＷｉｅｎｅｒｉｎｄｅｘ（Ｈ）．Ｂｏｔｈ
ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣＡ）ｏｆｔｈｅＤＧＧＥｐｒｏｆｉｌｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｗｏ
ｓｏｉｌｓｃｌｅａｒｌｙ，ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｌｉｔｌｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｏｐｓｏｉｌａｎｄｓｕｂｓｏｉｌｆｏｒｔｈｅｓａｍｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＴｈｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ
ａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｏｆｎｉｆＨｇｅｎｅｉｎＭｏｓｏｂａｍｂｏｏｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔ．
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆ１４ＤＧＧＥｂａｎｄｓｉｓｏｌａｔｅｄｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔ１３ｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅａｆｉｌｉａｔｅｄｗｉｔｈＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍａｎｄ１ｗｉｔｈ
Ａｚｏｈｙｄｒｏｍｏｎａｓ，ｗｉｔｈｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍ９３％ ｔｏ９８％ ｉｎｋｎｏｗｎｓｐｅｃｉｅｓｏｆＧｅｎｅＢａｎｋ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】
Ｔｈｉｓｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔｔｏｂａｍｂｏｏｐｌａｎｔａｔｉｏｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙ，ｂｕｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｔｓａｂｕｎｄａｎｃｅａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｃｏｎｔｅｎｔｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇａｎｅｎｈａｎｃｅｄｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｆｉｘｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｏｉｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ；ｓｏｉｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ；ｎｉｔｒｏｇｅｎ
毛竹（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）是禾本科刚竹属
（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓ），主要分布于热带和亚热带地区，是
我国一种重要的森林资源［１］。２０世纪 ７０年代以
来，许多研究者通过毛竹开展了氮磷钾三要素最佳
配比的肥料试验。黄当亮［２］认为２∶１∶１的比例对
毛竹出笋效果最好；郭晓敏等［３］报道 Ｎ∶Ｐ∶Ｋ为
１∶０６８∶０４９时，出笋率和成竹率为最佳；郑蓉
等［４］指出氮的比例相对较高，说明氮素对毛竹生长
具有十分重要的作用。然而，毛竹在立地条件较好
（如由花岗岩发育而来的土壤）的粗放经营（不施
肥）环境中也能良好生长，说明毛竹林生态系统自
身有能力保证氮素的供应。对于不施肥的粗放经营
森林生态系统，生物固氮是土壤氮素的主要来源，生
物固氮量为非生物固氮量的两倍多［５］，是地球上最
大规模的天然氮肥工厂。由此，本研究提出科学假
设：阔叶林改种毛竹后可能影响生态系统氮素循环
和固氮微生物的活动。
土壤中许多固氮微生物是非培养的，因此通过
分子生物技术能更全面地了解土壤固氮微生物的特
性。编码固氮酶铁蛋白组分的结构基因 ｎｉｆＨ基因
是固氮细菌最为保守的功能基因，常用来证明固氮
菌的存在［６－９］，同时，也用以揭示固氮菌群落结构与
环境的关系［１０］。目前对于竹林生态系统固氮微生
物的研究甚少，侯伟等［１１－１２］对广东刺竹植株体内的
固氮菌多样性进行了研究，并通过接种实验证明固
氮菌株对植物生长有一定的促进作用；而且，对毛
竹林土壤固氮菌的研究只有早期顾小平和吴晓丽两
位学者的３篇报道［１３－１５］。他们应用传统的平板培
养法，从毛竹根际分离得到３６个固氮菌，发现其固
氮活性随温度和 ｐＨ变化而变化，不同碳源也会对
固氮活性产生一定的影响。本研究以纯自然未被改
种的阔叶林为毛竹林的对照，结合土壤常规理化分
析，应用 ｎｉｆＨ基因的特异引物对，利用 ＤＧＧＥ和荧
光定量ＰＣＲ等方法，着重研究２种土壤的固氮细菌
和氮素特征，旨在揭示阔叶林改为毛竹林后不同土
层固氮微生物 ｎｉｆＨ基因多样性与土壤氮素的变化。
该研究结果对指导毛竹林经营和持续发展具有重要
的指导意义。
１　材料与方法
１１　土壤样品采集与处理
研究区位于浙江省西北部的临安市青山镇
（３０°１４′Ｎ，１１９°４２′Ｅ），属中亚热带季风气候区，平
均降水量为１６２８６ｍｍ，年平均气温 １６４℃，日照
时数１８４７３ｈ，无霜期２３７０ｄ。土壤为砂页岩发育
的红壤，两种林地分布在相邻的两个山体，每个山体
的面积为 ０３５公顷左右，海拔 ６０ １４０ｍ，坡度
为２５°。
纯自然的 阔 叶 林 主 要 优 势 树 种 有 苦 槠
（Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓｓｃｌｅｒｏｐｈｙｌａ）、木荷（Ｓｃｈｉｍａｓｕｐｅｒｂａ）、青
冈（Ｃｙｃｌｏｂａｌａｎｏｐｓｉｓｇｌａｕｃａ）等，林下灌木种类有山胡
椒（Ｌｉｎｄｅｒａｇｌａｕｃａ）、山苍子（Ｌｉｔｓｅａｃｕｂｅｂａ）等，覆盖
度为７０％。毛竹林则为１００多年前由阔叶林改种
而来，竹林立竹密度为２８００ ３２００株／ｈｍ２，平均胸
径为３０ｃｍ左右。毛竹林主要采用冬季劈除林下杂
灌、不翻耕施肥的粗放经营措施，林下仅少量杂草；
毛竹每隔一年出笋长新竹（称大年），大年时挖去部
分春笋，保留一定数量的新竹，小年（不长新竹）时
砍伐６年生的成熟毛竹。
于２０１３年５月，每种林地在东北坡向的不同位
置，随机选取４个１０ｍ×１０ｍ标准样地，每个标准
样地选取５个采样点，分层采集０—２０ｃｍ（表层）和
８８６
３期　　　 沈秋兰，等：阔叶林改种毛竹（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）后土壤固氮细菌 ｎｉｆＨ基因多样性的变化
２０—４０ｃｍ（次表层）土壤，将每个标准样地同一土
层的土壤充分混匀形成一个混合样品，每种林地得
８个混合样品（２个土层，４个重复），２种林地共计
１６个样品（２种林地，２个土层，４个重复）。样品过
２ｍｍ钢筛、充分混匀，从中取出部分样品装入小塑
料瓶后放入备好的冰盒，带回实验室后置于 －７０℃
保存，土样经冷冻干燥后提取 ＤＮＡ，其余部分带回
实验室风干后用于土壤理化性质的测定。
１２　分析方法
１２１土壤理化性质　参照鲁如坤等［１６］方法对土
壤理化性质进行分析。其中，土壤ｐＨ值采用１∶２５
土水质量比，用复合电极测定；有机碳含量采用重
铬酸钾－油浴外加热法测定；碱解氮采用碱解扩散
法；有效磷采用 Ｂｒａｙ法，盐酸 －氟化铵溶液浸提，
钼锑抗比色法测定；速效钾采用醋酸铵提取，火焰
分光光度计测定。
１２２土壤总ＤＮＡ的提取　采用 ＰｏｗｅｒＳｏｉｌＴＭ Ｔｏｔａｌ
ＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ试剂盒（美国ＭｏＢｉｏ公司）提取土
壤总ＤＮＡ，称取０５ｇ于－７０℃保存的土壤样品，按
试剂盒说明书进行土壤 ＤＮＡ提取，通过１．２％琼脂
糖凝胶电泳对 ＤＮＡ提取效果进行鉴定，提取后的
ＤＮＡ样品保存于－４０℃。
１２３土壤固氮细菌的ＰＣＲ扩增　使用ＢＩＯ－ＲＡＤ
公司的ＰＣＲ仪对固氮细菌特异性 ｎｉｆＨ基因进行扩
增，表１为反应步骤和对应的引物［１７］序列（上海生
物工程有限公司）。２０μＬ反应体系如下：Ｐｒｅｍｉｘ
１０μＬ，引物各 ０２μＬ，ＢＳＡ０２μＬ，模板０２μＬ，
Ｈ２Ｏ９２μＬ。第一轮反应，９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃
变性１ｍｉｎ，５５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，３０个
循环，最后７２℃延伸５ｍｉｎ；第二轮反应，以第一轮
产物为模板，９４℃预变性 ３ｍｉｎ，９４℃变性 １ｍｉｎ，
４８℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸 ２ｍｉｎ，３５个循环，最后
７２℃延伸 ５ｍｉｎ［１７］。取 ４ｍＬＰＣＲ反应产物用
１２％的琼脂糖凝胶进行电泳，确认其片段大小，并
用于ＤＧＧＥ分析。
表１　ＰＣＲ扩增所用引物
Ｔａｂｌｅ１　ＰｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
巢式ＰＣＲ
ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ
功能基因
Ｆｕｎｃｔｉｏｎｇｅｎｅ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列５′－３′
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ５′－３′
产物大小
Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ（ｂｐ）
第一轮
Ｓｔｅｐ１
第二轮
Ｓｔｅｐ２
ｎｉｆＨ
ＦＧＰＨ１９
ＰｏｌＲ
ＰｏｌＦ－ＧＣ
ＡＱＥＲ
ＴＡＣＧＧＣＡＡＲＧＧＴＧＧＮＡＴＨＧ
ＡＴＳＧＣＣＡＴＣＡＴＹＴＣＲＣＣＧＧＡ
ＴＧＣＧＡＹＣＣＳＡＡＲＧＣＢＧＡＣＴＣ
ＧＡＣＧＡＴＧＴＡＧＡＴＹＴＣＣＴＧ
４２９
３２０
注（Ｎｏｔｅ）：Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ；Ｈ＝Ｔ／Ｃ／Ａ；Ｙ＝Ｃ／Ｔ；Ｓ＝Ｇ／Ｃ．
１２４变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）　参照 Ｍａｒｃｉａ
等［１７］和Ｗａｒｔｉａｉｎｅｎ等［１８］的方法，改良后使用 ＢＩＯ－
ＲＡＤ基因突变仪进行变性梯度凝胶电泳，丙烯酰胺
凝胶浓度为８％，电泳缓冲液为１×ＴＡＥ，变性梯度
为４０％ ６５％（１００％变性剂为７ｍｏｌ／Ｌ尿素，４０％
去离子甲酰胺）。在６０℃、８０Ｖ条件下，电泳１４ｈ
后，用Ｇｅｌｒｅｄ（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）（１∶１００００稀释）
染色３０ｍｉｎ，染色结果用ＧｅｌＤｏｃＴＭＥＱ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）
凝胶成像系统成像，使用 ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ４４软件
（ＢＩＯ－ＲＡＤ）进行图像分析，确定电泳条带数、亮度
和光密度。
１２５固氮细菌 ｎｉｆＨ基因序列分析　根据２种林地
土壤样品固氮细菌 ｎｉｆＨ基因ＤＧＧＥ图谱结果，选取
主要条带进行割胶回收，回收条带使用 ｐＥＡＳＹ－Ｔ３
试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）进行克隆，
菌液送生工测序，测序结果在 ＮＣＢＩ上进行 Ｂｌａｓｔ
比对。
１２６固氮细菌 ｎｉｆＨ基因定量 ＰＣＲ　以土壤总
ＤＮＡ为模板，ＡＱＥＲ和 ＰｏｌＦ为引物（引物见表１），
采用实时荧光定量 ＰＣＲ（ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）法测定固
氮细菌 ｎｉｆＨ基因拷贝数。２０μＬ反应体系组成如
下：２×ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ１０μＬ，５０μｍｏｌ／Ｌ上游
和下游引物各０２μＬ，模板ＤＮＡ１μＬ，无菌双蒸水
８６μＬ。荧光定量 ＰＣＲ扩增在 ＣＦＸ９６ＴＭＲｅａｌＴｉｍｅ
Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ，ＵＳＡ）仪器上进行，每个样品３
个重复。荧光定量ＰＣＲ程序参考文献［１７］。标准曲
线制作：从测序结果中选取合适的阳性克隆子，扩
增培养后提取质粒 ＤＮＡ，紫外吸收定量法（ＯＤ２６０／
ＯＤ２８０）检测浓度，重组质粒梯度稀释（１０
－１ １０－８）
后作为 ｎｉｆＨ基因的荧光定量的标准样品，样品的反
９８６
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２２卷
应程序和反应体系同标准样品测定。
１３　数据处理
采用ＳＰＳＳ１８０统计软件进行数据处理，采用ｔ
检验方法，检验相同土层不同林地之间、同一林地不
同土层之间的差异。利用 ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ４４软件进
行图谱分析时，主要采用未加权算术平均对群法
（Ｔｈｅｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ
ａｖｅｒａｇｅｓ，ＵＰＧＭＡ）对ＤＧＧＥ图谱进行聚类分析。使
用 ＣＡＮＯＣＯ ４５１软 件 （ＭｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒＰｏｗｅｒ，
Ｉｔｈａｃａ，ＵＳＡ）对 ＤＧＧＥ揭示的细菌群落结构进行主
成分分析（ＰＣＡ）。使用多样性指数Ｈ和均匀度指数
（Ｅ）来评价微生物群落的多样性［１９］，其计算公式为：
Ｈ＝－∑
Ｓ
ｉ＝１
ＰｉｌｎＰｉ
Ｅ＝ ＨｌｎＳ
式中，Ｐｉ为某一条带的强度与同泳道中所有条带总
强度的比值，即Ｐｉ＝ｉ／Ｎ；ｉ是物种的个体数，在这里
指条带的强度；Ｎ是所有物种的个体总数，在这里
指同泳道中所有条带总强度；Ｓ为每一泳道总的条
带数。
２　结果与分析
２１　土壤理化性质
阔叶林改种毛竹后，土壤ｐＨ显著（Ｐ＜００５）提
高（表２）；毛竹林土壤的含水量、碱解氮以及表层
土壤的速效钾，都显著高于（Ｐ＜００５）同层的阔叶
林土壤，而有效磷则显著（Ｐ＜００５）低于同层的阔
叶林土壤；除阔叶林土壤有机碳含量外，同一林地
的其他指标均为表层土壤大于次表层土壤，其中毛
竹林表层土壤的 ｐＨ、碱解氮、有效磷和速效钾含量
显著（Ｐ＜００５）高于次表层。显然，阔叶林地改种
毛竹后，土壤酸性减弱，有效养分含量明显提高。
表２　阔叶林和毛竹林地土壤基本理化性质
Ｔａｂｌｅ２　Ｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｗｏｄｉｆｅｒｅｎｔｆｏｒｅｓｔｓ
土层
Ｓｏｉｌｌａｙｅｒ
（ｃｍ）
林地类型
Ｆｏｒｅｓｔｔｙｐｅ
ｐＨ
有机碳
ＯｒｇａｎｉｃＣ
（ｇ／ｋｇ）
碱解氮
Ａｌｋａｌ．Ｎ
（ｍｇ／ｋｇ）
有效磷
Ａｖａｉｌ．Ｐ
（ｍｇ／ｋｇ）
速效钾
Ａｖａｉｌ．Ｋ
（ｍｇ／ｋｇ）
含水量
Ｍｏｉｓｔｕｒｅ
（％）
０—２０ 毛竹林 Ｂａｍｂｏｏｆｏｒｅｓｔ ５１１ａＡ ２３５１ａＡ ３２２４ａＡ ５６８ｂＡ ５９４５ａＡ ４３０ａＡ
阔叶林 Ｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔ４６２ｂＡ ２０２２ａＡ ２２１４ｂＡ ９３８ａＡ ４５４０ｂＡ ２３１ｂＢ
２０—４０ 毛竹林 Ｂａｍｂｏｏｆｏｒｅｓｔ ４８８ａＢ ２０６５ａＡ １６７４ａＢ ２９４ｂＢ ４５５３ａＢ ３９９ａＡ
阔叶林 Ｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔ４５１ｂＡ ２１９１ａＡ ９２５ｂＢ ４０６ａＢ ３８７４ａＡ ２０１ｂＢ
注（Ｎｏｔｅ）：同列数值后不同小写字母代表同一土层不同林地的显著性差异（Ｐ＜００５），大写字母代表同一林地不同土层的显著性差异（Ｐ
＜００５）Ｖａｌｕｅｓｆｏｌｏｗｅｄｂｙｄｉｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｅｒｓａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｅｒｅｎｔａｔｔｈｅ００５ｌｅｖｅｌｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｅｒｅｎｔｆｏｒｅｓｔｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｓｏｉｌｌａｙｅｒ，ａｎｄｆｏｌｏｗｅｄ
ｂｙｄｉｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｅｒｓａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｔｔｈｅ００５ｌｅｖｅｌｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｅｒｅｎｔｌａｙｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｆｏｒｅｓｔ．
２２　土壤微生物ＤＮＡ
１２％琼脂糖凝胶电泳图显示，ＤＮＡ提取效果
良好（图１）。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值大部分在１８ ２０
之间，表明只是有轻度的 ＲＮＡ污染（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝
１８为最佳，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＞１９为 ＲＮＡ污染，ＯＤ２６０／
ＯＤ２８０＜１６为蛋白质污染）；ＯＤ值的大小即 ＤＮＡ
的浓度，能大致反映土壤微生物数量［２０］，无论是表
层还是次表层，毛竹林土壤ＤＮＡ浓度均明显高于对
应土层的阔叶林，说明毛竹林土壤的微生物生物量
高于阔叶林。
２３　固氮细菌群落结构及多样性
采用嵌套式 ＰＣＲ扩增技术对固氮细菌 ｎｉｆＨ基
因进行扩增，经１２％琼脂糖凝胶电泳后，获得条带
清晰的４００ｂｐ左右 ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物经 ＤＧＧＥ
分离出数目、强度和迁移位置不同的条带（图 ２）。
ＤＧＧＥ图中不同位置的条带代表不同的细菌种
群［２１］；电泳条带越多，说明细菌种群越多［２２］；条带
信号越强，表示该条带代表的相应细菌数量越多。
本研究的目标条带是固氮细菌，比较毛竹林和阔叶
林这两种林地之间的条带发现，两种土壤的 ＤＧＧＥ
带谱差异明显，阔叶林土壤条带数和优势条带（亮
度大）明显多于毛竹林。１６个样品共出现２１条位
置不同的条带，其中阔叶林、毛竹林地分别有２０条、
１７条条带。同一林地不同土层土壤固氮菌差异不
明显。
分析比较条带特征发现，条带１１为两种林地的
共性条带，不仅亮度最大而且在不同土壤间差异最
小，表明该种固氮细菌在两种林地中均有生长，并且
０９６
３期　　　 沈秋兰，等：阔叶林改种毛竹（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）后土壤固氮细菌 ｎｉｆＨ基因多样性的变化
图１　ＤＮＡ１２％琼脂糖凝胶电泳图、浓度
以及ＯＤ２６０ｎｍ与ＯＤ２８０ｎｍ比值
Ｆｉｇ．１　１２％ＡＧＥｏｆＤＮＡ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄ
ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ
［注（Ｎｏｔｅ）：Ｍ—Ｍａｒｋｅｒ；１ ４—毛竹林０—２０ｃｍ土层样品Ｓｏｉｌｏｆ
Ｍｏｓｏｂａｍｂｏｏｆｏｒｅｓｔａｔ０－２０ｃｍｌａｙｅｒ；５ ８—毛竹林２０—４０ｃｍ土
层样品Ｍｏｓｏｂａｍｂｏｏｆｏｒｅｓｔａｔ２０－４０ｃｍｌａｙｅｒ；９ １２—阔叶林０—
２０ｃｍ土层样品Ｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔａｔ０－２０ｃｍｌａｙｅｒ；１３ １６—阔叶林
２０—４０ｃｍ土层样品Ｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔａｔ２０－４０ｃｍｌａｙｅｒ．
为土壤固氮细菌群落中的优势种群；共性条带１２
亮度较低，不同土壤样品间有明显差异；条带２０、２１
分别为阔叶林和毛竹林的特征条带，对应土壤表层
亮度高于次表层，说明这两个条带对应的固氮细菌
主要活跃于土壤表层；毛竹林土壤中非共性条带
１８、１９的亮度大于阔叶，而条带１５、１６、１７则呈现出
相反的趋势。
根据固氮细菌 ＤＧＧＥ图谱中条带位置和亮度
计算多样性指数Ｈ和均匀度指数Ｅ（表３）。多样性
指数Ｈ越大，说明微生物群落多样性越高；均匀度
指数Ｅ表示微生物在环境中的分布状况，各微生物
数目越接近，数值越大［２３］。结果表明，阔叶林多样
性指数Ｈ大于对应土层的毛竹林，而土壤的均匀度
指数Ｅ则正好相反，但均没有达到显著性差异。
２４　土壤固氮细菌 ｎｉｆＨ基因测序
根据 ２种林地土壤样品固氮细菌 ｎｉｆＨ基因
ＤＧＧＥ图谱结果，选取主要的１４个条带（编号分别
为１、３、７、８、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１）进
图２　 ｎｉｆＨ基因ＤＧＧＥ电泳图谱
Ｆｉｇ．２　ＤＧＧＥｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ
ｂａｓｅｄｏｎｎｉｆＨｇｅｎｅ
［注（Ｎｏｔｅ）：Ｍ—Ｍａｒｋｅｒ；１ ４—毛竹林０—２０ｃｍ土层样品 ０—２０
ｃｍｓｏｉｌｌａｙｅｒｉｎＭｏｓｏｂａｍｂｏｏｆｏｒｅｓｔ；５ ８—毛竹林２０—４０ｃｍ土层样
品２０—４０ｃｍｓｏｉｌｌａｙｅｒｉｎＭｏｓｏｂａｍｂｏｏｆｏｒｅｓｔ；９ １２—阔叶林０—２０
ｃｍ土层样品０—２０ｃｍｓｏｉｌｌａｙｅｒｉｎｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔ；１３ １６—阔叶林
２０—４０ｃｍ土层样品２０—４０ｃｍｓｏｉｌｌａｙｅｒｉｎｂｒｏａｄｌｅａｆｆｏｒｅｓｔ．］
表３　土壤固氮细菌群落多样性指数
Ｔａｂｌｅ３　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｄｉｃｅｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎｓｏｉｌｓ
土层（ｃｍ）
Ｓｏｉｌｌａｙｅｒ
林地
Ｆｏｒｅｓｔ
Ｈ Ｅ
０—２０ 毛竹林Ｂａｍｂｏｏ ２３７９ａＡ ２２３８ａＡ
阔叶林Ｂｒｏａｄｌｅａｆ ２４９６ａＡ ２１８２ａＡ
２０—４０ 毛竹林Ｂａｍｂｏｏ ２１３１ａＡ ２２５１ａＡ
阔叶林Ｂｒｏａｄｌｅａｆ ２３８２ａＡ ２２４２ａＡ
注（Ｎｏｔｅ）：Ｈ—多样性指数Ｓｈａｎｎｏｎｗｉｅｎｅｒｉｎｄｅｘ；Ｅ—均匀度指
数Ｐｉｅｌｏｕｉｎｄｅｘ；小写字母代表同一土层不同林地的显著性差异（Ｐ
＜００５），大写字母代表同一林地不同土层的显著性差异（Ｐ＜００５）
Ｔｈｅｓｍａｌｌｅｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｔｔｈｅ００５ｌｅｖｅｌｂｅｔｗｅｅｎ
ｄｉｆｅｒｅｎｔｆｏｒｅｓｔｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｓｏｉｌｌａｙｅｒ，ａｎｄｃａｐｉｔａｌｌｅｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｔｔｈｅ００５ｌｅｖｅｌｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｅｒｅｎｔｌａｙｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｆｏｒｅｓｔ．
行割胶回收测序。结果表明，１４个阳性克隆分别属
于 ２个不同的菌属 （表 ４），其中 １３个均为
Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，１个为 Ａｚｏｈｙｄｒｏｍｏｎａｓｌａｔａ［２４］，但 １４
个条带的序列与已知序列的相似度为９３％ ９８％，
相似度低于９８％说明与已知的物种存在一定差异，
相似度低于９６％的可能是新种。阔叶林土壤的特
１９６
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２２卷
表４　ＤＧＧＥ条带测序比对结果
Ｔａｂｌｅ４　ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅＢＬＡＳＴａｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＧＧＥｓｅｑｕｅｎｃｅｄｂａｎｄｓ
条带编号
ＢａｎｄＮｏ．
比对菌
Ｒｅｌａｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ＧｅｎＢａｎｋ登录号
ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒ
相似度
Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（％）
１ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．ＩＲＢＧ２２８ ＡＢ０７９６１６ ９６
３ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．ＩＲＢＧ２２８ ＡＢ０７９６１６ ９７
７ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＧＵ４３３５４７ ９８
８ Ａｚｏｈｙｄｒｏｍｏｎａｓｌａｔａ ＡＢ１８８１２２ ９３
１１ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．ＩＳＡ０９０１ ＫＦ８５９８９６ ９７
１２ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．Ｓ２３３２１ ＡＰ０１２２７９ ９６
１３ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．ＯＲＳ３９１ ＦＪ３４７４４９ ９８
１５ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．Ｓ２３３２１ ＡＰ０１２２７９ ９６
１６ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．ＩＲＢＧ２２８ ＡＢ０７９６１６ ９５
１７ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．ＩＲＢＧ２２８ ＡＢ０７９６１６ ９６
１８ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．ＩＳＡ０９０１ ＫＦ８５９８９６ ９８
１９ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．ＡＧ４８ ＫＦ１１３０７２ ９６
２０ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．ＯＲＳ３９１ ＦＪ３４７４４９ ９８
２１ Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．ＩＲＢＧ２２８ ＡＢ０７９６１６ ９６
征性条带２０和毛竹林土壤特征性条带２１所对应的
固氮 细 菌，虽 然 也 都 属 于 慢 生 根 瘤 菌 属
（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ），但存在一定差异，而且毛竹林土
壤的２１号可能是新种。
２５　聚类分析
从聚类分析图上看（图３），所有样品大致可以
被归为两组（相似度低于０４），１ ９号为一组，１０
１６号为另一组，除９号阔叶林土壤出现异常外，
同一林地的表层和次表层样品均归为一类，说明两
种林地土壤的固氮细菌群落结构存在明显差异。阔
叶林土壤的表层样品（＃１０、１１、１２）和次表层样品（＃
１３、１４、１６）的固氮细菌结构也存在明显差异（相似
度低于０６）。然而，毛竹林土壤则没有明显的层次
差异规律。
２６　主成分分析（ＰＣＡ）
为更进一步揭示土壤样品间固氮细菌群落结构
的相互关系，对不同样品 ＤＧＧＥ图谱上条带位置和
亮度进行数字化处理后的主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ
ＣｏｍｐｏｎｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）结果显示，主成分１解释
了样品中 ３２０％的变异，主成分 ２解释了样本中
１７１％的变异，共解释了样本中４９１％的样本总变
异（图４）。在ＰＣ１上，两种林地得到了较好的区分，
毛竹林土壤样品除了３号外主要分布在坐标轴左
侧，阔叶林土壤样品除了９号外主要分布在坐标轴
图３　土壤固氮细菌条带图谱的聚类分析
Ｆｉｇ．３　Ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ（ＵＰＧＭＡ）ｏｆｓｏｉｌ
ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ
［注（Ｎｏｔｅ）：ＢＢ—毛竹林Ｂａｍｂｏｏ；ＢＬ—阔叶林Ｂｒｏａｄｌｅａｆ．］
右侧，表明不同林地间固氮细菌群落有明显差异；
毛竹林不同土层固氮细菌在 ＰＣ１上存在差异，而阔
叶林土壤固氮细菌土层间的差异主要落在 ＰＣ２上；
该结果表明，不同林地的固氮细菌群落结构存在一
定的差异。
２７　丰度分析
实验测得所提 ｎｉｆＨ基因质粒浓度为 ３０１
ｎｇ／μＬ，将其转换成拷贝数为８１８×１０１０，１０倍稀释
２９６
３期　　　 沈秋兰，等：阔叶林改种毛竹（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）后土壤固氮细菌 ｎｉｆＨ基因多样性的变化
图４　固氮细菌群落的主成分分析（ＰＣＡ）
Ｆｉｇ．４　ＰＣＡｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ
［注（Ｎｏｔｅ）：ＢＢ—毛竹林Ｂａｍｂｏｏ；ＢＬ—阔叶林Ｂｒｏａｄｌｅａｆ．］
质粒，共稀释得８个梯度作为标准品进行荧光定量
ＰＣＲ，不同梯度生物重组质粒为模板进行实时荧光
定量ＰＣＲ标准曲线的制作。得到的标准曲线每个
梯度均有呈明显“Ｓ”型的特征性扩增曲线，通过定
量 ＰＣＲ，利用稀释的质粒作出 Ｃｔ值与起始拷贝数
对数线性关系的标准曲线 （Ｒ２ ＝０９９７，Ｅ＝
９１８％）。利用ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ技术获得各土壤样品
ｎｉｆＨ功能基因拷贝数，换算出每克干土 ｎｉｆＨ基因的
拷贝数（图 ５）。结果表明，同一土层毛竹林土壤
ｎｉｆＨ功能基因拷贝数显著大于阔叶林，而同一林地
表层和次表层 ｎｉｆＨ基因拷贝数则没有明显差异。
说明毛竹林土壤中的固氮细菌数量明显高于阔叶林
土壤。
３　讨论与结论
本研究中，两种土壤固氮细菌功能基因的
ＤＧＧＥ图谱分析结果中阔叶林土壤固氮细菌物种数
量（条带数）和种群数量（亮度）以及以此为基础计
算得出的多样性指数Ｈ高于毛竹林，可以推测阔叶
林土壤的固氮细菌物种多样性较毛竹林丰富。影响
土壤固氮微生物群落结构以及多样性的因素包括植
被［２５］、土地利用［９］、养分［２６］、温度和 ｐＨ［２７－２８］等，其
中植被是土壤微生物赖以生存的有机营养物和能量
的重要来源，影响着土壤微生物的定居环境。土壤
中自生固氮菌大部分为异养，需要碳源来满足繁殖
和代谢活动。因此，阔叶林植被种类丰富，改种毛竹
后，群落结构变得单一，植物多样性低，植被和土壤
的碳储量都减少了［２９－３０］，这可能是导致以上差异的
图５　 ｎｉｆＨ基因拷贝数
Ｆｉｇ．５　ＡｂｕｎｄａｎｃｅｏｆｎｉｆＨｇｅｎｅ
［注（Ｎｏｔｅ）：ＢＢ—毛竹林 Ｂａｍｂｏｏ；ＢＬ—阔叶林 Ｂｒｏａｄｌｅａｆ．柱上不同
小写字母表示同一土层不同林地 ｎｉｆＨ基因拷贝数差异达显著水平
（Ｐ＜００５），不同大写字母表示同一林地不同土层 ｎｉｆＨ基因拷贝数
差异达显著水平（Ｐ＜００５）　Ｄｉｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｅｒｓａｂｏｖｅｔｈｅｂａｒｓ
ｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｔｔｈｅ００５ｌｅｖｅｌｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｅｒｅｎｔｆｏｒｅｓｔｓｉｎ
ｔｈｅｓａｍｅｓｏｉｌｌａｙｅｒ，ａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅ
ａｔｔｈｅ００５ｌｅｖｅｌｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｅｒｅｎｔｌａｙｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｆｏｒｅｓｔ．］
重要原因。
一般认为微生物种类越多，各物种的数量
（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）越多，则功能基因的拷贝数越
多。由以上一般规律推测，ＤＧＧＥ方法检测到条带
数多———即固氮细菌种类多的阔叶土壤应该比毛竹
土壤具有较高的 ｎｉｆＨ基因拷贝数。然而，定量ＰＣＲ
分析结果没有支持以上规律，毛竹林土壤固氮细菌
的 ｎｉｆＨ基因丰度反而高于阔叶林（图５）。本研究
支持毛竹林土壤固氮细菌的 ｎｉｆＨ基因丰度高的理
由有两方面：一是毛竹林土壤较高的 ｐＨ更有利于
固氮细菌的活动，因为大部分土壤固氮细菌数量受
ｐＨ的影响较大，有其最适 ｐＨ范围［３１－３２］；二是毛竹
林土壤除有效磷外的其它所测养分指标均优于阔叶
林（表２），也有利于土壤固氮细菌活动。刘骏等［３３］
通过对竹林－阔叶林界面两侧土壤养分差异的研究
发现，由于毛竹细根的作用，毛竹林土壤有机碳和总
氮的含量分别高出阔叶林３４５３％和６０３５％，而毛
竹林土壤全磷含量低于阔叶林２５５４％，这与本文
研究结果一致。Ｒｅａｒｄｏｎ等［３４］研究发现，土壤微生
物总生物量高的土壤 ｎｉｆＨ基因丰度高，毛竹林土壤
微生物量高于阔叶林（图１）。毛竹林土壤 ｐＨ和土
壤养分改善的综合结果有利于土壤固氮细菌活动。
导致ＰＣＲ－ＤＧＧＥ和定量 ＰＣＲ分析两种方法
结果不一致有以下两种可能：１）如果两个土壤固氮
微生物群落的物种组成有差别，由于不同ＤＮＡ片段
３９６
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２２卷
扩增效率不同，出现的结果也会有差异［３５］，如有的
物种的扩增效率特别高，会出现条带少而基因拷贝
数总数高的结果；虽然条带数量较少但某些条带亮
度特别大，也可能出现条带少而基因拷贝数总数高
的结果，但这都不符合本研究的情况。两种林地土
壤的固氮细菌物种（ＤＧＧＥ中条带位置）基本相同
（图３），且阔叶林土壤大部分条带亮度比毛竹林土
壤强。２）与两种分析方法的灵敏度不同有关。
ＤＧＧＥ技术虽然克服了微生物培养过程中的一些困
难，但是土壤中的微生物种群和数量的变化本身就
是一个非常复杂的过程。并且，ＤＧＧＥ方法通常只
能反映总ＤＮＡ中占１％以上的菌群，数量太少的目
标片段无法显示出来［３６］，而定量分析则能扩增微量
的目标片段；前者好比放大镜，难以清楚地观察到
微小的生物，而后者好比显微镜，能检测到毛竹林土
壤中存在着的低含量的目标 ＤＮＡ。因此，ＤＧＧＥ方
法可能低估了土壤固氮细菌的多样性。当然这一推
测需要进一步应用其它方法来证实。类似的现象也
发生在雷竹（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｖｉｏｌａｓｃｅｎｓ）林不同施肥处
理对土壤氨氧化细菌的影响试验中，不同处理土壤
功能基因（ａｍｏＡ）的 ＤＧＧＥ多样性差异与定量 ＰＣＲ
正好相反［３７］。
毛竹林土壤固氮细菌 ｎｉｆＨ基因丰度高意味着
比阔叶林土壤固定更多的氮，虽然毛竹林通过挖笋
和砍伐竹材带走了不少养分，但毛竹林土壤有效养
分水平总体改善明显，而毛竹林土壤氮素水平的增
加也可能是土壤固氮能力增强的结果。长此以往，
土壤养分与土壤微生物相互促进，形成良性循环。
综合以上结果，阔叶林改种毛竹１００多年后，土
壤ｐＨ和氮、钾的有效养分有所提高；ＤＧＧＥ检测到
的毛竹土壤固氮细菌多样性明显下降，但定量 ＰＣＲ
检测的土壤固氮基因（ｎｉｆＨ）丰度显著提高，定量结
果与毛竹林土壤氮素水平提高结果吻合，因此，阔叶
林改种毛竹后有利于土壤固氮细菌活动，从而改善
土壤氮素供应。
参 考 文 献：
［１］　ＨａｎＪＧ，ＸｉａＤＬ，ＬｉＬＢ，ｅｔａｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｃｕｌｔｕｒａｂｌｅｂａｃｔｅｒｉａ
ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｒｏｏｔｄｏｍａｉｎｓｏｆｍｏｓｏｂａｍｂｏｏ（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｅｄｕｌｉｓ）
［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ，２００９，５８（２）：３６３－３７３
［２］　黄当亮．毛竹施肥试验研究［Ｊ］．福建林业科技，１９９８，２５
（４）：５２－５５
ＨｕａｎｇＤＬ．ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆＰｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓ
ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ［Ｊ］． ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｕＪｉａｎ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，２５（４）：５２－５５
［３］　郭晓敏，李滋仁，周桂香，等．毛竹平衡施肥钾肥效应研究
［Ａ］．中国土壤学会．面向未来的土壤科学（中册）—中国土
壤学会第十二次全国会员代表大会暨第九届海峡两岸土壤肥
料学术交流研讨会论文集［Ｃ］．成都，２０１２
ＧｕｏＸＭ，ＬｉＺＲ，ＺｈｏｕＧＸ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｙｏｎｅｆｅｃｔｏｆｂａｌａｎｃｅｄ
ｐｏｔａｓｓｉｕｍｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｎｂａｍｂｏｏｉｎＹｏｎｇｆｅｎｇ［Ａ］．ＳｏｉｌＳｃｉｅｎｃｅ
ＳｏｃｉｅｔｙｏｆＣｈｉｎａ ． Ｅｓｓａｙｓｏｆｔｈｅ１２ｔｈ ｎａｔｉｏｎａｌｍｅｍｂｅｒ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｔｈｅｎｉｎｔｈｓｅｍｉｎａｒｏｆｓｏｉｌｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ
ａｃａｄｅｍｉｃｅｘｃｈａｎｇｅｓａｃｒｏｓｓｔｈｅＴａｉｗａｎＳｔｒａｉｔｓｏｆＳｏｉｌＳｃｉｅｎｃｅ
ＳｏｃｉｅｔｙｏｆＣｈｉｎａ［Ｃ］．Ｃｈｅｎｇｄｕ，２０１２
［４］　郑蓉，郑维鹏，连华萍，等．施肥对毛竹笋材两用林土壤养分
分布与肥力状况的影响［Ｊ］．世界竹藤通讯，２０１４，１２（１）：１
－６
ＺｈｅｎｇＲ，ＺｈｅｎｇＷＰ，ＬｉａｎＨＰ，ｅｔａｌ．Ｅｆｅｃｔｓｏｆｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｎ
ｓｏｉｌｎｕｔｒｉｅｎｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｔｉｌｉｔｙｓｔａｔｕｓｏｆｓｈｏｏｔａｎｄｔｉｍｂｅｒ
ｓｔａｎｄｏｆＰｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｅｄｕｌｉｓ［Ｊ］．ＷｏｒｌｄＢａｍｂｏｏａｎｄＲａｔａｎ，
２０１４，１２（１）：１－６
［５］　覃丽萍，黄思良，李杨瑞．植物内生固氮菌的研究进展［Ｊ］．
中国农学通报，２００５，２１（２）：１５０－１５９
ＱｉｎＬＰ，ＨｕａｎｇＳＬ，ＬｉＹＲ．ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎＥｎｄｏｐｈｙｔｉｃ
ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｅｔｉｎ，２００５，２
（２）：１５０－１５９
［６］　ＴｅｒａｋａｄｏＴｏｎｏｏｋａＪ，ＯｈｗａｋｉＹ，ＹａｍａｋａｗａＨ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｎｉｆＨｇｅｎｅｓｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｆｉｅｌｄｇｒｏｗｎｓｗｅｅｔ
ｐｏｔａｔｏｅｓ（ＩｐｏｍｏｅａｂａｔａｔａｓＬ．）［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，
２００８，２３：８９－９３
［７］　谭志远，彭桂香，徐培智，等．普通野生稻 （Ｏｒｙｚａｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）
内生固氮菌多样性及高固氮酶活性［Ｊ］．科学通报，２００９，
１３：１８８５－１８９３
ＴａｎＺＹ，ＰｅｎｇＧ Ｘ，ＸｕＰＺ，ｅｔａｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｈｉｇｈ
ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓｆｒｏｍＯｒｙｚａｒｕｆｉｐｏｇｏｎ
［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｅｔｉｎ，２００９，１３：１８８５－１８９３
［８］　文都日乐，李刚，杨殿林，等．呼伦贝尔草原土壤固氮微生物
ｎｉｆＨ基因多样性与群落结构［Ｊ］．生态学杂志，２０１１，３０（４）：
７９０－７９７
ＷｅｎｄｕＲＬ，ＬｉＧ，ＹａｎｇＤＬ，ｅｔａｌ．ｎｉｆＨｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｓｏｉｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｉｎＨｕｌｕｎｂｅｉｅｒ
ｇｒａｓｓｌａｎｄ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｌｏｇｙ，２０１１，
３０（４）：７９０－７９７
［９］　ＭｉｒｚａＢＳ，ＰｏｔｉｓａｐＣ，ＮüｓｓｌｅｉｎＫ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｆｒｅｅｌｉｖｉｎｇ
ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｔｏｌａｎｄｕｓｅｃｈａｎｇｅｉｎｔｈｅＡｍａｚｏｎ
ｒａｉｎｆｏｒｅｓｔ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，８０
（１）：２８１－２８８
［１０］　康文龙，台喜生，李师翁，等．祁连山高寒草原碱性土壤固
氮微生物数量及固氮基因 （ｎｉｆＨ）群落结构研究［Ｊ］．冰川
冻土，２０１３，３５（１）：２０８－２１６
ＫａｎｇＷＬ，ＴａｉＸＳ，ＬｉＳＷ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍａｎｄｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｎｉｆＨ
ｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅａｌｋａｌｉｓｏｉｌｓｏｆａｌｐｉｎｅｓｔｅｐｐｅｉｎｔｈｅＱｉｌｉａｎＭｏｕｎｔａｉｎｓ
［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｌａｃｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｏｃｒｙｏｌｏｇｙ，２０１３，３５（１）：２０８
－２１６
［１１］　侯伟，彭桂香，许志钧，等．广东省刺竹内生固氮菌多样性
４９６
３期　　　 沈秋兰，等：阔叶林改种毛竹（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）后土壤固氮细菌 ｎｉｆＨ基因多样性的变化
［Ｊ］．农业生物技术学报，２００７，１５（２）：２９０－２９４
ＨｏｕＷ，ＰｅｎｇＧＸ，ＸｕＺＪ，ｅｔａｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ
ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ ＢａｍｂｕｓａｂｌｕｍｅａｎａｉｎＧｕａｎｇｄｏｎｇ
Ｐｒｏｖｉｎｃｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１５
（２）：２９０－２９４
［１２］　侯伟，彭桂香，许志钧，等．广东
"
竹内生固氮菌生理特性
及促生效果研究［Ｊ］．林业科学研究，２００８，２１（１）：１０１
－１０５
ＨｏｕＷ，ＰｅｎｇＧＸ，ＸｕＺＪ，ｅｔａｌ．Ｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｆｅｃｔｓａｎｄ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｙｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ
Ｇｕａｎｇｄｏｎｇｂａｍｂｏｏ（ＢａｍｂｕｓａＢｌｕｍｅａｎａ）［Ｊ］．ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ，
２００８，２１（１）：１０１－１０５
［１３］　顾小平，吴晓丽．毛竹及浙江淡竹根际联合固氮的研究［Ｊ］．
林业科学研究，１９９４，７（６）：６１８－６２３
ＧｕＸＰ，ＷｕＸＬ．Ａｓｔｕｄｙｏｎａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｏｆ
ｂａｍｂｏｏｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ［Ｊ］．ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，７（６）：６１８
－６２３
［１４］　顾小平，吴晓丽．毛竹根际分离的多粘芽孢杆菌固氮特性的
研究［Ｊ］．林业科学研究，１９９８，１１（４）：３７７－３８１
ＧｕＸＰ，ＷｕＸＬ．Ｓｔｕｄｙｏｎｓｅｖｅｒａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍ
Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓｒｏｏｔｓ［Ｊ］．ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，１１
（４）：３７７－３８１
［１５］　顾小平，吴晓丽．毛竹根际分离的地衣芽孢杆菌固氮特性研
究［Ｊ］．竹子研究汇刊，１９９８，１７（４）：５９－６３
ＧｕＸＰ，ＷｕＸＬ．Ｓｔｕｄｙｏｎｓｅｖｅｒａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆ
ｓｅｖｅｒａｌＢａｃｉｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍＰｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ
ｒｏｏｔｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｍｂｏｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，１７（４）：５９－６３
［１６］　鲁如坤．土壤农业化学分析方法［Ｍ］．北京：中国农业科
技出版社，２０００
ＬｕＲ Ｋ．Ｓｏｉｌａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ［Ｍ］．
Ｂｅｉｊｉｎｇ： Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｐｒｅｓｓ，２０００
［１７］　ＣｏｅｌｈｏＭａｒｃｉａＲＲ，ＭａｒｉｅｌＩｖａｎｉｌｄｏＥ，ＪｅｎｋｉｎｓＳａｓｈａＮ．
ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｉｆＨｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎ
ｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆｓｏｒｇｈｕｍ（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）ｓｏｗｎｗｉｔｈｔｗｏ
ｌｅｖｅｌｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＳｏｉｌＥｃｏｌｏｇｙ，２００９，４２：
４８－５３
［１８］　ＷａｒｔｉａｉｎｅｎＩ，ＥｒｉｋｓｓｏｎＴ，ＺｈｅｎｇＷ，ｅｔａｌ．Ｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｈｅ
ａｃｔｉｖｅｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎｒｉｃｅｐａｄｄｙ—ｎｉｆＨＰＣＲ－ＤＧＧＥ
ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅａｎｄｂｕｌｋｓｏｉｌ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＳｏｉｌＥｃｏｌｏｇｙ，
２００８，３９（１）：６５－７５
［１９］　张金屯．数量生态学［Ｍ］．北京：科学出版社，２００４１５３
－２１８
ＺｈａｎｇＪＴ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｅｃｏｌｏｇｙ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ，
２００４，１５３－２１８
［２０］　ＦｒｏｓｔｅｇａｒｄＡ，ＣｏｕｒｔｏｉｓＳ，ＲａｍｉｓｓｅＶ，ｅｔａｌ．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｂｉａｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｄｉｒｅｃｔｌｙｆｒｏｍｓｏｉｌｓ［Ｊ］．
ＡｐｐｌｉｅｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉａｌｏｌｏｇｙ，１９９９，６５：５４０９－５４２０
［２１］　ＫｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖＳＲ，ＺｈｕＷ Ｙ，ＷｉｌｉａｍｓＢＡ，ｅｔａｌ．Ｅｆｅｃｔｏｆ
ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｏｎｐｉｇｌｅｔｆａｃｉａｌｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ
ａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙ１６ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００３，４３：２２５－２３５
［２２］　ＭｕｙｚｅｒＧ，ＳｍａｌａＫ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＤＧＧＥ） ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＴＧＧＥ）ｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ａｎｔｏｎｉｅｖａｎ
Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，１９９８，７３：１２７－１４１
［２３］　谭宏伟，杨尚东，吴俊．红壤区桉树人工林与不同林地土壤
微生物活性及细菌多样性的比较［Ｊ］．土壤学报，２０１４，５１
（３）：１４７－１５６
ＴａｎＨ Ｗ，ＹａｎｇＳＤ，ＷｕＪ．ＣｏｍｐａｒｉｓｉｏｎｏｆＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｐｌａｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｏｔｈｅｒｆｏｒｅｓｔｓｉｎｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｒｅｄｓｏｉｌｒｅｇｉｏｎ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．ＡｃｔａＰｅｄｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，
２０１４，５１（３）：１４７－１５６
［２４］　ＸｉｅＣＨ，ＹｏｋｏｔａＡ．ＲｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓｓｔｒａｉｎｓ
ＩＡＭ１２５９９ＴａｎｄＩＡＭ１２６６４ａｎｄＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａａｓ
Ａｚｏｈｙｄｒｏｍｏｎａｓｌａｔａｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｃｏｍｂ．ｎｏｖ．，Ａｚｏｈｙｄｒｏｍｏｎａｓ
ａｕｓｔｒａｌｉｃａｓｐ．ｎｏｖ．ａｎｄＰｅｌｏｍｏｎａｓｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａｇｅｎ．ｎｏｖ．，
ｃｏｍｂ． Ｎｏｖ．， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ［Ｊ］． ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆ
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，５５（６）：２４１９
－２４２５
［２５］　张于光，王慧敏，李迪强等．三江源地区不同植被土壤固氮
微生物的群落结构研究［Ｊ］．微生物学报，２００５，４５（３）：４２０
－４２５
ＺｈａｎｇＹＧ，ＷａｎｇＨＭ，ＬｉＤＱ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｎｄ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｉｎ Ｓａｎｊｉａｎｇｙｕａｎ
ＮａｔｒｕａｌＲｅｓｅｒｖｅ［Ｊ］．ＡｃｔａＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，２００５，４５（３）：
４２０－４２５
［２６］　李刚，王丽娟，李玉洁，等．呼伦贝尔沙地不同植被恢复模
式对土壤固氮微生物多样性的影响［Ｊ］．应用生态学报，
２０１３，２４（６）：１６３９－１６４６
ＬｉＧ，ＷａｎｇＬＪ，ＬｉＹＪ，ｅｔａｌ．Ｅｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｖｅｇｅｔａｔｉｏｎ
ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｐａｔｅｒｎｓｏｎ ｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｓｏｉｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇ
ｍｉｃｒｏｂｅｓｉｎＨｕｌｕｎｂｅｉｅｒｓａｎｄｙｌａｎｄ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａｏｆＮｏｒｔｈ
Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＥｃｏｌｏｇｙ，２０１３，２４（６）：
１６３９－１６４６
［２７］　杨琼博．ｐＨ值和化合态氮对紫花苜蓿结瘤和固氮效果的影
响［Ｄ］．哈尔滨：东北农业大学硕士学位论文，２００７
ＹａｎｇＱＢ．ＥｆｅｃｔｏｆｐＨａｎｄｃｏｍｂｉｎｅｄｎｉｔｒｏｇｅｎｆａｃｔｏｒｓｏｎａｌｆａｌｆａ
ｂｕｎｃｈｉｎｇａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎ［Ｄ］．Ｈａｒｂｉｎ：ＭＳＴｈｅｓｉｓｏｆ
ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００７
［２８］　邢永秀．甘蔗内生物固氮细菌的分离、鉴定和生长特性［Ｄ］．
南宁：广西大学硕士论文，２００６
ＸｉｎｇＹＸ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｆｉｘａｔｉｏｎｉｎｓｕｇａｒｃａｎｅａｎｄｇｒｏｗｔｈｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ［Ｄ］．Ｎａｎｎｉｎｇ：
ＭＳＴｈｅｓｉｓｏｆＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００６
［２９］　杨清培，王兵，郭起荣，等．大岗山毛竹扩张对常绿阔叶林
生态系统碳储特征的影响［Ｊ］．江西农业大学学报，２０１１，
３３（３）：５２９－５３６
ＹａｎｇＱＰ，ＷａｎｇＢ，ＧｕｏＱＲ，ｅｔａｌ．ＥｆｅｃｔｓｏｆＰｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓ
ｅｄｕｌｉｓｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｎｃａｒｂｏｎｓｔｏｒａｇｅｏｆｅｖｅｒｇｒｅｅｎｂｒｏａｄｌｅａｖｅｄ
ｆｏｒｅｓｔｉｎＤａｇａｎｇｓｈａｎＭｏｕｎｔａｉｎ，Ｊｉａｎｇｘｉ［Ｊ］．ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＪｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ，２０１１，３３（３）：５２９－５３６
［３０］　周国模，姜培坤．毛竹林的碳密度和碳贮量及其空间分布
［Ｊ］．林业科学，２００４，４０（６）：２０－２４
５９６
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２２卷
ＺｈｏｕＧＭ，ＪｉａｎｇＰＫ．Ｄｅｎｓｉｔｙ，ｓｔｏｒａｇｅ，ａｎｄｓｐａｔｉａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
ｏｆｃａｒｂｏｎｉｎＰｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｅｄｕｌｉｓｆｏｒｅｓｔ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｔｉａＳｉｌｖａｅ
Ｓｉｎｉｃａｅ，２００４，４０（６）：２０－２４
［３１］　周移国，代青莉，凌敏，等．菌肥微生物在不同ｐＨ茶园土壤
中存活模式的研究［Ｊ］．中国农学通报，２０１３，２９（７）：１２１
－１２６
ＺｈｏｕＹＧ，ＤａｉＱＬ，ＬｉｎｇＭ，ｅｔａｌ．Ａｓｔｕｄｙｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｓｕｒｖｉｖａｌｐａｔｅｒｎｓｉｎｔｅａｐｌａｎｔａｔｉｏｎｓｏｉｌｓｗｉｔｈ
ｄｉｆｅｒｅｎｔｐＨｖａｌｕｅ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｅｔｉｎ，
２０１３，２９（７）：１２１－１２６
［３２］　张萍华．模拟酸雨对土壤的理化性质，微生物和生物活性及
中药的影响［Ｄ］．杭州：浙江大学硕士论文，２００４
ＺｈａｎｇＰＨ．Ｅｆｅｃｔｏｆｓｉｍｕｌａｔｅｄａｃｉｄｒａｉｎｏｎｐｈｙｓｉｃａｌｃｈｅｍｉｃａｌ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｓｏｉｌａｎｄ
Ｃｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｈｅｒｂｓ［Ｄ］．Ｈａｎｇｚｈｏｕ：ＭＳＴｈｅｓｉｓｏｆＺｈｅｊｉａｎｇ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００４
［３３］　刘骏，杨培清，余定坤，等．细根对竹林 －阔叶林界面两侧
土壤养分异质性形成的贡献［Ｊ］．植物生态学报，２０１３，３７
（８）：７３９－７４９
ＬｉｕＪ，ＹａｎｇＰＱ，ＹｕＤＫ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｆｉｎｅｒｏｏｔｔｏｓｏｉｌ
ｎｕｔｒｉｅｎｔｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙａｔｔｗｏｓｉｄｅｓｏｆｔｈｅｂａｍｂｏｏａｎｄｂｒｏａｄｌｅａｖｅｄ
ｆｏｒｅｓｔｉｎｔｅｒｆａｃｅ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＥｃｏｌｏｇｙ，２０１３，３７
（８）：７３９－７４９
［３４］　ＲｅａｒｄｏｎＣＬ，ＧｏｌａｎｙＨＴ，ＷｕｅｓｔＳＢ．Ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｃｏｍｍｕｎｉｔｙ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄａｂｕｎｄａｎｃｅｉｎｗｈｅａｔｆａｌｏｗａｎｄｗｈｅａｔｐｅａｃｒｏｐ
ｒｏｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，６９：４０６
－４１２
［３５］　马俊孝，季明杰，孔健．ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术在微生物物种多
样性研究中的局限性及其解决措施［Ｊ］．食品科学，２００８，
２９（５）：４９３－４９７
ＭａＪＸ，ＪｉＭＪ，ＫｏｎｇＪ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｌｉｍｉｔａｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄｓｏｆＰＣＲ－ＤＧＧＥｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，２９（５）：４９３－４９７
［３６］　刘淮德，王雷，王宝杰，等．应用 ＰＣＲ－ＤＧＧＥ分析南美白
对虾肠道微生物多样性［Ｊ］．饲料工业，２００８，２９（２０）：５５
－５８
ＬｉｕＨＤ，ＷａｎｇＬ，ＷａｎｇＢＪ，ｅｔａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌｗｉｔｈＰＣＲＤＧＧＥｍｅｔｈｏｄｆｒｏｍｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｏｆｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐ
ｉｎＳｏｕｔｈＡｍｅｒｉｃａ［Ｊ］．ＦｅｅｄＩｎｄｕｓｔｒｙ，２００８，２９（２０）：５５－５８
［３７］　郭帅．雷竹林集约经营措施对土壤 ＣＯ２，Ｎ２Ｏ排放及氨氧化
微生物的影响［Ｊ］．浙江临安：浙江农林大学硕士论
文，２０１３
ＧｕｏＳ．ＥｆｅｃｔｓｏｆｉｎｔｅｎｓｉｖｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｎｓｏｉｌＣＯ２，Ｎ２Ｏ
ｅｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉａｏｘｉｄｉｚｉｎｇｉｎ ＰｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓＰｒａｅｃｏｘｆ．
Ｐｒｅｖｅｌｎａｌｉｓｆｏｒｅｓｔ［Ｄ］．Ｌｉｎａｎ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ：ＭＳＴｈｅｓｉｓｏｆＺｈｅｊｉａｎｇ
Ａ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１３
６９６