全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""()"!&
"
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#
"!("!!&("$
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$
#"*+$"$
%
,
*-../*#"""()"!&*!"#$*"!*"!!&
收稿日期$
!"#&(#!(!$
&修改稿收到日期$
!"#$("#(!&
基金项目$林业公益性行业科研专项"
!"#%")##+
#&国家青年自然科学基金"
%#%""&0%
!
%#)""&1%
#&浙江省公益技术研究农业项目
"
!"#)2%!#""
#
作者简介$胡月苗"
#11"
#!女!硕士研究生!主要从事园林植物遗传育种方面研究
3(45-6
$
!0##+#"01
!77
*894
"
通信作者$胡凤荣!副教授!主要从事园林植物遗传育种方面研究
3(45-6
$
:;<=/
>
?9/
>
!""%
!
.-/5*894
春兰
!12$%&
基因的克隆及实时定量表达分析
胡月苗#!孙崇波!!向
!
林%!胡凤荣#"
"
#
南京林业大学 风景园林学院!南京
!#""%+
&
!
浙江省农业科学院园艺研究所!杭州
%#""!#
&
%
华中农业大学!武汉
)%""+"
#
摘
!
要$该研究以春兰"
!
"
#$%&%#
(
)*+%,
(
%%
#正常花及其
!
枚侧瓣突变成唇瓣样的花瓣"简称$蝶花#为实验材料!
采用
@A(B2@
结合
@C23
技术从春兰中分离出
-./$(%
基因序列分析表明!
-./$(%
基因在春兰正常花和蝶花
中序列相同!该基因含有
#
个
+!"D
E
长的开放阅读框"
F@G
#!共编码
!%1
个氨基酸系统进化树进行分析表明!该
基因属于
HCIJ(D9K
基因中
CB#
%
CLM1
组的
-./$
同源基因!命名为
!
(
-./$0%
"基因登录号为
NO"&0$+1
#实
时荧光定量表达分析表明!
(
-./$(%
在春兰正常花和蝶花各花器官中表达存在差异在正常春兰中
!
(
-./$(%
基因在唇瓣中强烈表达!在主萼(侧萼及蕊柱中表达量较低!在侧瓣中则微乎其微&而在蝶花中
!
(
-./$(%
基因在
唇瓣中强表达!侧瓣中的表达量次之!在主萼(侧萼和蕊柱中的表达量相近且均较低研究说明!
(
-./$(%
基因可
能在春兰蝶花侧瓣唇瓣化的过程中扮演重要角色
关键词$春兰&
-./$(%
基因&蝶花&实时荧光定量表达
中图分类号$
P+0&
&
P+0$
文献标志码$
C
(")#)
*
+)!,-+(%.#/-01
2
3-44#")"5!12$%&
6-)-53"/3
4
56-.-75
8
&)(-/
8
-
QOR;=4-59
#
!
JOS2:9/
>
D9
!
!
TUCSLM-/
%
!
QOG=/
>
?9/
>
#
"
"
#296=
>
=9E
=C?8:-W=8W;?=
!
S5/
,
-/
>
G9?=.W?
X
O/-Y=?.-W
X
!
S5/
,
-/
>
!#""%+
!
2:-/5
&
!U/.W-W;W=9!
Z:=
,
-5/
>
C85V=4
X
9>
?-8;6W;?56J8-=/8=.
!
Q5/
>
[:9;%#""!#
!
2:-/5
&
%Q;5[:9/
>
C
>
?-8;6W;?56O/-Y=?.-W
X
!
\;:5/)%""+"
!
2:-/5
#
784.3+9.
$
A:=.W;V
X
;.=V!
"
#$%&%#
(
)*+%,
(
%%]-6VW
XE
=5/V
E
=69?-84;W5/W
"
W]965W=?56
E
=W56.4;W5W=V
-/W96-
E
.
#
5.=K
E
=?-4=/W45W=?-56.*U/W:-.?=.=5?8:
!
5/9Y=6-./$(%
>
=/=]5.-.965W=V(
)*+%,
(
%%D
X
@A(B2@5/V@C23(B2@W=8:/-
7
;=.*J=
7
;=/8=5/56
X
.-..:9]=V-./$(%
>
=/=.=
7
;=/8=.5?=.54=-/W:=
]-6VW
XE
=5/V
E
=69?-84;W5/W9(
)*+%,
(
%%*A:=
>
=/=89/W5-/=V5/9
E
=/?=5V-/
>
E
=/89V-/
>
5
E
;W5W-Y=
E
?9W=-/9X
69
>
=/=W-8W?==5/56
X
.-.-/V-85W=VW:5W!
(
-./$(%D=69/
>
.W9-./$
865V=9%
CLM1.;D<54-6
X
!
/54=V!
(
-./$(%
"
L=/^5/_588=..-9/S9*NO"&0$+1
#
*@=56(W-4=
7
;5/W-W5(
W-Y=B2@V=49/.W?5W=VW:5W
!
-/]-6VW
XE
=!
(
-./$(%]5.:-
>
:6
X
=K
E
?=..=V-/6-
E
.
!
69]=?-/V9?.56.=
E
56
!
65W(
=?56.=
E
56
!
896;4/
!
5/VY=?
X
6-WW6=-/65W=?56
E
=W56*\:=?=5.=K
E
?=..-9/9(
-./$(%-/
E
=69?-84;W5/W]5.
W:=:-
>
:=.W-/6-
E
!
65W=?56
E
=W56894=..=89/V
!
69]=?5/V869.=-/V9?.56.=
E
56
!
65W=?56.=
E
565/V896;4/*
A:=.=?=.;6W.-/V-85W=VW:5W!
(
-./$(%
E
65
X
5-4
E
9?W5/W?96=-/W:=
E
?98=..W:5W65W=?56
E
=W56..
E
=8-56-[=V
-/W96-
E
.*
:-
;
<"3!4
$
!
"
#$%&%#
(
)*+%,
(
%%
&
-./$
>
=/=
&
E
=69?-84;W5/W
&
?=56(W-4=
7
;5/W-W5W-Y=B2@
!!
花是被子植物特有的功能器官!在大多数被子 植物中!花有
)
个典型的组成部分!它们分布在同心
轮上萼片组成了最外面的一轮!向内一轮由花瓣
组成!作为雄性生殖器官的雄蕊位于第三轮!雌性生
殖器官雌蕊位于第四轮并占据花的中心位置)#*在
双子叶植物中!
29=/
等)!*通过对拟南芥"
-+2$%&)
3
0
4%45627%2,2
#和金鱼草"
-,5%++6%,##2
8
4
#的花器
官突变体研究!提出了花器官发育的
C^ 2
基因表达
模型!为花器官发育调控基因的发展奠定基础
#11&
年
29694D9
等)%*通过对矮牵牛的研究提出了
C^ 2I
模型随着研究的不断深入!有人从蛋白聚
合体控制花器官的形成方面提出了四因子模型)*!
该模型基于拟南芥花同源异型蛋白能够形成多聚
体!具体作用如下$
!C`!J3B
决定萼片&
C`!^ `
J3B
决定花瓣&
!^ `2`J3B
决定雄蕊&
!2`!J3B
决定心皮后来在四因子模型和经典
C^ 2
模型的
基础上
A:=-..=/
等提出
C^ 2I3
模型)&*目前所
获得的花器官发育基因中除了
-9:;-/-!
"
-9!
#
外!编码的蛋白质
S
端都包含一个保守区
(HCIJ(
D9K
)
$
*

目前主要针对双子叶模式植物拟南芥和金鱼草
等进行了花器官发育的研究)+*单子叶植物花器官
发育的研究主要集中在禾本科植物!如水稻"
<+
"
=2
425%>2
#
)
0
*和玉米"
?*2#2
"
4
#
)
1
*上兰花作为单子
叶植物中具有奇特花结构的植物!近期吸引了不少
研究人员!并取得了不错的研究成果
-./$
及其同源基因都属于
HCIJ(D9K
家族
中
3
类基因的
CB#
%
CLM1
组目前已从多种植物
中克隆到了
-./$07%@*
基因!如文心兰"
<,A%&%#
6
"
$+%&#
#的
)
#"(##
*
(麻竹"
C*,&+)A272#4
725%
E
7)+4
#的
)
#!
*
(风信子"
F
"
2A%,564
)+%*,527%4
#的
F)-./$
)
#%
*
(水稻的
<4B-CD$
和
<4B-CD#+
)
#)
*
(玉米的
?-.%
和
?-.&
)
#&(#$
*和中国
水仙的
G5B-CD%
)
#+
*等研究表明!在植物文心兰
中
-./$
类基因
在花分生组织(唇瓣和
心皮中表达!但在营养叶(雄蕊(萼片和花瓣中并未
检测到其表达)#"*!矮牵牛"
9*5,%26
"
$+%&2
#中
-./$
亚家族基因
9B-CD)
在萼片(花瓣(心皮中
表达量高!在雄蕊中无表达总体来说!由于缺少相
关基因功能缺失突变体!因此对确定这类基因具体
功能还有待研究兰科植物是现今植物界中包含植
物种类最多的科之一!含有超过
!""""
种兰花!兰
花具有复杂的花型结构春兰"
!
"
#$%&%#
(
)*+%,0
(
%%
#是兰科兰属植物!正常的春兰花由
%
枚萼片(
!
枚侧瓣和
#
枚唇瓣!以及处于中心部位的蕊柱组成
"图
#
!
C
#蝶花一般指
!
枚侧瓣或者
!
枚侧萼发生
变异!质变成唇瓣样的花瓣!属于兰花花瓣的一种
+唇瓣化,现象"图
#
!
^
#本研究采用
@A(B2@
及
@C23
技术获得了
#
个与花发育相关的
!
(
-./$(%
基因!并对其进行了表达分析通过本研究!为揭示
-./$
类基因在兰花花器官发育过程中对侧瓣特化
的机理奠定理论基础
#
!
材料和方法
=*=
!
材
!
料
取种植于浙江省农业科学院园艺所花卉中心温
室内的春兰正常花和蝶花为实验材料!分别采集
!
84
#
花芽
#
%84
时期的花瓣(萼片(唇瓣(蕊柱立即
用液氮冻存!并放入
+"a
的冰箱中备用
=>?
!
总
,@7
的提取和
!12$%&
基因的克隆
用试剂盒"本实验室使用的是北京天恩泽基因
公司
@SC9;W!*"
试剂盒#分别提取春兰正常花和
蝶花花芽的
@SC
!再用
JHC@A=?
AH
@C238ISC
C4
E
6-<-85W-9/N-W
"美国
269/W=8:
公司所生产#进行
反转录合成
8ISC
第
#
链!以合成的第
#
链作为模
板进行
B2@
扩增根据
-./$
类基因保守区域来
设计引物!设计的引物为上游引物
CLM$(%C
"
&b(
C2LCA2C2LCCC222ALCC2(%b
#和 下游引物
CLM$(%^
"
&b(L2ALLAC22A222CCAAALC(%b
#
根据设计的引物进行
B2@
扩增!
B2@
扩增条件为$
1)a
变性
%4-/
!
1)a
变性
%".
!
$"
"
&"a
复性
%"
.
"每进行
&
个循环退火温度下降
!a
#!
+!a
延伸
#
4-/
!总共进行
%&
个循环后再
+!a
延伸
&4-/
用
质量分数为
#c
琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收!连
接到
E
3CJR(^6;/WZ=?9269/-/
>
N-W
载体上!
)!a
热激转入大肠杆菌
A?5/.&
#
化学感受态细胞!
C4
E
抗性筛选和
T(
>
56
%
UBAL
蓝白斑筛选选取白色菌
落进行
B2@
检测!阳性克隆并送去测序
图
#
!
正常的春兰"
C
#及蝶花"
^
#
G-
>
*#
!
S9?456!1
(
)*+%,
(
%%
"
C
#
5/VD;WW=?<6
X
"
^
#
$!!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
!!
根据扩增产物的测序结果设计
%b(@C23
引物
CLM$(%2
"
&b(LL2CCCCLCLLC2L2CL2ACC(
AL(%b
#和
&b(@C23
引物
CLM$(%I
"
&b(L2A2A2CA(
ALCA22C22CA2AL2(%b
#
采用
269/W=8:
公司的
JHC@A=?
AH
@C238I(
SCC4
E
6-<-85W-9/N-W
试剂盒进行
%b
端和
&b
端的
@C23
反应将
%b
端和
&b
端的
@C23
反应产物分
别回收!连接
E
3CJR(^6;/WZ=?9269/-/
>
N-W
载体!
转化测序拼接后获得基因全长
=>&
!
!12$%&
基因序列分析
将获得的基因全长
8ISC
序列!首先进行开放
阅读框的分析"在
:WW
E
$%%
5;*=K
E
5.
X
*9?
>
%
W996.
%
V/5*:W4M
进行分析#&之后用
B?9WB5?54
软件来分
析相关蛋白的基本性质!再用
26;.W56T#*0%
软件进
行氨基酸水平的序列比对接下来构建系统进化
树!首先在
S2^U
网页上用
6^5.W
搜索
!
(
-./$(%
基因的同源基因!使用
26;.W56T#*0%
软件对搜索得
到的基因进行多重序列比对!最后使用
H3LC$
软
件中的
Sd
法构建系统发育树!并进行
9^9W(.W?5
E
检测)#0*
=>A
!
3
8
!12$%&
基因的实时荧光定量表达分析
根据 试 剂 盒 "采 用 北 京 天 恩 泽 基 因 公 司
@SC9;W!*"
试剂盒#说明书分别提取春兰正常花
和蝶花的侧瓣(主萼(侧萼(唇瓣和蕊柱的
@SC
!用
NCBCJR^ @GCJA
7
B2@N-W
"天根生化科技"北
京#有限公司#反转录成单链
8ISC
!之后用荧光染
料法进行实时荧光定量表达分析根据已克隆出的
!
(
-./$(%
基因序列设计
#
对特异性引物!用
#0J
+HG-
基因作为内标
#0J+HG-
基因上游引物为
&b(LLA22ACAA(
LALAALL2A(%b
!下游引物为
&b(A2L2CLAL(
LAA2LA2AAA(%b

-./$(%
基因引物序列上游引
物
CLM$(%3
"
&b(ACC2AACLC2L2CLCL222C(
%b
#和 下 游 引 物
CLM$(%G
"
&b(L222CA22A(
LCACALCCC22L(%b
#
7
B2@(B2@
反应在罗氏
M-
>
:W2
X
86=?!*"
荧光定量
B2@
仪上进行反应条
件为$
1&a%4-/
!
1&a%.
!
$"a%".
!循环
)"
次!
每个处理重复
%
次数据输出的结果用
H-8?9.93K8=6
软件进行分析
!
!
结果与分析
?>=
!
3
8
!12$
基因全长
9B@7
的克隆
用
@A(B2@
技术从春兰花芽中获得部分基因
片断!测序并在
S2^U
上分析表明!该片段为目的片
段!即为
!
(
-./$(%
基因的部分片段根据所得序
列设 计
%b(@C23
和
&b(@C23
特 异 引 物!按 照
JHC@A=?
AH
@C238ISCC4
E
6-<-85W-9/N-W
的说
明书进行
8ISC
末端扩增!获得了
%b
和
&b
的扩增片
段!测序后将两端拼接得到基因全长
8ISC
序列
"图
!
#
6^5.WK
的结果显示!全长
8ISC
与其他植
物
-./$
类基因有较高的同源性!该基因含有
#
个
+!"D
E
长的开放阅读框!共编码
!%1
个氨基酸!将
基 因 命 名 为
!
(
-./$(%
!
L=/(^5/_
登 录 号 为
NO"&0$+1

!
(
-./$(%
分子量为
!+*&_I
!预测等
电点为
1*&$

?>?
!
3
8
!12$%&
基因序列分析
氨基酸序列比对结果"图
%
#显示!
2
>
CLM$(%
蛋白与从春石斛"
C*,&+)$%#6
"
$+%&
#中克隆的
ICLM$
基因蛋白有较高的同源性!其中氨基酸序
列具有
1!c
的一致性与
CB#
%
CLM1
组扇叶文心
兰"
:+
"
A%,2
3
4%772
#的
3BHCIJ&
以及文心兰
"
<,A%&%#6
"
$+%&
#
FHCIJ#
的蛋白也具有较高的
同源性!且与两者的氨基酸序列都为
1"c
的一致
性与粉花六出花 "
-745%)*#*+%27%
(
5
#的
C6(
HCIJ
和石刁柏"
-4
3
2+2
(
4)
EE
%A%,27%4
#的
C9(
HCIJ
分别有
+#c
和
+!c
的一致性!春兰的
2
>
CLM$(#
与
2
>
CLM$(%
氨基酸序列的相似性为
$)*1c
"图
%
#此为在该氨基酸的
2
端发现了典型
的
J3B
%
CLM$
保守结构域"图
%
#
系统进化树分析"图
&
#表明
CB#
%
CLM1
亚族分
为
CLM$
(
J3B
和
CB#
三个分支!
!
(
-./$(%
基因属
于
CLM$
分支!与春石斛的
C-./$
和文心兰的
关系最近!与其它植物
CLM$
类基因的相
似性也较高!表明
!
(
-./$0%
为
-./$
的同源基因
?>&
!
3
8
!12$%&
基因在不同器官的表达分析
为了解
!
(
-./$(%
基因的功能及确定
!
(
-./$
#*IM!"""
&
!*-./$(%
图
!
!
春兰
-./$(%
基因全长扩增
G-
>
*!
!
C4
E
6-<-85W-9/
E
?9<-6=9E
;W5W-Y=<;6(6=/
>
W:
>
4=/W9<-./$(%
>
=/=(
)*+%,
(
%%
+!!
!
期
!!!!!!!!!!!!
胡月苗!等$春兰
-./$(%
基因的克隆及实时定量表达分析
扇叶文心兰
*:
3
B-CD&
"
CQH1!"0#
#&文心兰
*"
CId$+!%+
#&春石斛
*C-./$
"
CQC)!!$+
#&
春兰
*!
(
-./$(#
"
CIU&0)$)
#&粉花六出花
*-7B-CD
"
C^H%))0!
#&石刁柏
*-)B-CD
"
CCP0%0%&
#&黑框表示保守的
J3B
%
CLM$49W-<
图
%
!
2
>
CLM$(%
基因编码氨基酸与
CB#
%
CLM1
组蛋白之间的比较
2
>
CLM$(%.=
7
;=/8=]5.56-
>
/=V]-W:CB#
%
CLM1
>
?9;
EE
?9W=-/."
A%,2
3
4%772
"
CQH1!"0#
#!
<,A%&%#6
"
$+%&#
"
CId$+!%+
#!
C*,&+)$%#6
"
$+%&
"
CQC)!!$+
#!
-745+)*#*+%27%
(
5
"
C^H%))0!
#!
-4
3
2+2
(
4)
EE
%A%,27%4
"
CCP0%0%&
#&
A:=89/.=?Y=VJ3B
%
CLM$49W-<9>
.-.-/V-85W=V-/D658_896;4/
G-
>
*%
!
294
E
5?-.9/.9>
CLM$(%54-/958-V5/VCB#
%
CLM1
>
?9;
EE
?9W=-/.
(%
基因在春兰正常花和蝶花不同花器官的表达差
异!提取了春兰正常花和蝶花的主萼(侧萼(侧瓣(唇
瓣和蕊柱的
@SC
!并进行实时荧光定量表达分析
将基因在正常花蕊柱的表达量设定为
#
!结果表明
"图
)
#!在正常花中
!
(
-./$(%
基因表达主要集中
在唇瓣中!在主萼(侧萼及蕊柱中表达较少!在侧瓣
中几乎不表达而在蝶花中
!
(
-./$(%
基因表达
量在唇瓣中最高!侧瓣中的表达量次之!在主萼(侧
萼和蕊柱中的表达量都很低综合来看!蝶花中唇
瓣的表达量最高!正常花中唇瓣的表达量次之!约为
蝶花中唇瓣表达量的
)&c
!蝶花中侧瓣的表达量为
蝶花唇瓣的
#1c
!而正常花侧瓣中
!
(
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基因
表达量仅占蝶花唇瓣表达量的
"*""#c

图
)
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(
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在各花器官中的表达
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讨
!
论
目前!
HCIJ(D9K
基因是研究最多的植物转录
因子之一!这一类基因广泛存在于真核生物中)#0*!
通过对拟南芥和金鱼草突变体的遗传和分子特性研
究揭露
HCIJ(D9K
基因盒对花器官发育起着很重
要的作用)#*之前对单子叶植物花发育研究主要以
经济作物水稻和玉米等为主!但这些植物的花结构
高度特化不适合用来研究花器官发育!因此对于揭
开单子叶植物花发育的各个谜团兰科植物特化的花
结构是非常合适的研究对象)#1*本研究采用同源
序列法和
@C23
技术从春兰正常花以及侧瓣唇瓣
化的蝶花中都克隆出了一个
3
类基因该基因属
于兰科植物
CB#
%
CLM1
组的
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类基因!命
名为
!
(
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研究表明!兰花唇瓣的形成原因并无法单纯的
由
^
类基因来解释!并提出兰花唇瓣的形成受蛋白
复合物的调控!
^
类基因的蛋白必须与一群
CLM$
的蛋白形成蛋白四聚体!在兰花中这种复合物有两
种!一种是+唇瓣复合物,"
M894
E
6=K
#!另一种是+花
萼%花瓣复合物,"
JB894
E
6=K
#在兰花中这两种复
合物相互竞争!当+唇瓣复合物,占优势花器就发育
成唇瓣!当+花萼%花瓣复合物,占优势时花器就往花
萼%花瓣发展!若两者同时等量存在就会产生唇瓣与
花萼%花瓣的中间型产物)!"*
孙崇波等)!#*研究表明!
!
(
-./$(#
基因在春兰
的不同部位表达量不同!在花器官中表达量从高到
低的部位顺序为唇瓣(侧瓣(萼片和蕊柱!这与春兰
蝶花 的
!
(
-./$(%
基 因 表 达 相 似!说 明 春 兰
!
(
-./$0#
和
!
(
-./$(%
基因可能存在部分功能
冗余目前对
!
(
-./$(%
基因在花器官的不同组
织上的表达分析可知!在春兰正常花中
!
(
-./$(%
基因在唇瓣中强烈表达!在主萼(侧萼(及蕊柱中表
达量较低!在侧瓣中则微乎其微而在蝶花中
!
(
-./$(%
基因表达量在唇瓣中最高!侧瓣中的表
达量次之!在主萼(侧萼和蕊柱中的表达量相近且都
较低这些说明
!
(
-./$(%
基因可能在春兰侧瓣
特化成唇瓣过程中起到一定的作用!而这与
Q.;
等)#"*研究发现文心兰
-./$
类基因
有相
似之处!
基因在
!44
和
#"44
的花芽
中均有表达!且在
#"44
的花芽中表达较强!研究
表明在
#"44
的花芽中!
基因在唇瓣和
心皮中表达!且在唇瓣中表达较强!但
基
因与
2:5/
>
等)!!*发现的文心兰
基因在
萼片(侧瓣(唇瓣和心皮中都有表达不同综合来看
春兰
!
(
-./$(%
基因在蝶花唇瓣中如此高的表达
量可推测
!
(
-./$(%
基因对春兰唇瓣的形成起一
定的推动作用至于
!
(
-./$(%
基因在春兰中如
1!!
!
期
!!!!!!!!!!!!
胡月苗!等$春兰
-./$(%
基因的克隆及实时定量表达分析
何行使其功能今后我们将对其做进一步研究
参考文献!
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