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LEIJianfeng1,XUXinxia2,LIYue1,DAIPeihong1,LIUChao1,LIUXiaodong1
(1ColegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,LaboratoryofAgriculturalBiotechnologyofXinjiangAgriculturalU
niversity,Urumqi830052,China;2CenterofBazhouAgriculturalTechnologyPromotion,Korla,Xinjiang841000,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:犌犌犅isanegativeregulatorofdroughtresistance.Inordertoobtainthe犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊犵犵犫mu
tant,weusedAtU6promotertodrivetheexpressionof犃狋犌犌犅sgRNAandcorespondingCRISPR/Cas9
genomeedtingvectorwasconstructedandwastransferredinto犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊by犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿mediated
floraldip.Aftersequencingof犌犌犅inT2generation,twokindsofmutantswithadeletionof4basesand
anadditionof1base(T)werefoundatthetargetsite,respectively.SemiquantitativeRTPCRanalysis
resultsshowedthattheexpressionof犌犌犅genewasalmostnotdetectedinthe犵犵犫mutant,whichindica
tedthatthemutantswere犌犌犅knockoutlines.Throughmeasuringthewaterlossrate,droughtresistant
andseedyieldperplant,犵犵犫mutantexhibiteddecreasedwaterlossrate,improveddroughtresistance,but
unchangedseedyieldperplantcomparedtowildtype.Takentogether,theaboveresultsindicatedthat
犌犌犅isanidealcandidatetargetgeneforcropmolecularbreedingand犵犵犫mutantisusefulforfunctional
complementionof犌犌犅homologousgenesclonedfromcrops.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊;CRISPR/Cas9;犌犌犅;geneknockout;waterlossrate
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scaffoldfor犌犌犅;犌犌犅targetsequenceisunderlined
Fig.2 The犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊U6promoterand犌犌犅sgDNAscaffoldsequence
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mutations(Lanes1and2representundigestedanddigestedPCR
productofwildtype犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊respectively;Lanes3represent
PCRamplificationproductofthe犵犵犫mutant;Lanes4-10represent
digestedPCRproductsofthe犵犵犫mutations);B.Thewildtype犌犌犅
sequenceisgivenattheabove,thetargetsequenceswith犈犮狅RⅠ
restrictionsitehighlightedinblueandthePAM(NGG)highlighted
inred.Mrepresentsmutation,‘+’representsinsertionbases,‘’
representsdeletionbases;C.TheSangersequencingresultforwild
type犌犌犅;D.TheSangersequencingresultfor犌犌犅:4;E.The
Sangersequencingresultfor犌犌犅:+T
Fig.4 Detectionof犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊犵犵犫mutants
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