全 文 ：书西北植物学报!
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&修改稿收到日期$!"#$+"$+#$
基金项目$国家自然科学基金" %#"*"!%! ! %##*"#(1 # 作者简介$张海磊"
#1&)
#!男!硕士!主要从事植物生理和分子生物学研究
2+34.5
$6740 8 9.:5 !8 34.5,;:3 " 通信作者$葛晓春!博士!教授!博士生导师!主要从事植物生理和分子生物学研究
2+34.5
$<; 8 = ! >?@40,=@?,;0 拟南芥多聚$%&
核糖聚合酶
!
的
原核表达与活性检测
张海磊!吴
!
巧!葛晓春"
"复旦大学 生命科学学院!上海
!""$%% # 摘 ! 要$采用
AB+CDA
技术获得了拟南芥多聚
EFC
核糖聚合酶(
G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#
G
:5
H
3=I4/=
!
CEAC
)
!"#!#
基
因的全长
;FJE
!转入原核表达载体
G
2B%!4
并转化宿主菌
KI.
8
43.
"
F2%
#!加入终浓度为
",%33:5
%
LMCBN
!在
#(O
下诱导可获得较多的可溶重组蛋白纯化
BAP+CEAC#
!在反应液中加入
JEF
Q和断裂
FJE
!通过
RFR+CEN2
凝
胶电泳和
S=/T=I095:TT.0
8
分析!
BAP+CEAC#
分子量可随着时间的延长逐渐增大!产生向上的弥散!表明蛋白质连
上了
EFC
核糖分子&与此对比!作为参照的标签蛋白
BAP
无此现象实验结果显示原核表达拟南芥
CEAC#
能够
催化自身多聚
EFC
核糖化修饰!为深入研究植物多聚
EFC
核糖聚合酶的功能奠定了基础
关键词$拟南芥&翻译后修饰&多聚 EFC 核糖聚合酶&原核表达 中图分类号$
U*(
文献标志码$E &"() * "+#,-. / 011#"2)2!-23 * 4)+#,$11)
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8
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H
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H
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CEAC#
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8
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8
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G
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KI.
8
43.
"
F2%
#
,MCBN[4/4@@=@.0T:T7=;?5T?I=T:4>.045;:0;=0TI4T.:0:>",%33:5
%
LT:.0@?;==<
G
I=/+
/.:04T#(O>:I!"7,B7=I=;:39.040T
G
I:T=.0BAP+CEAC#[4/
G
?I.>.=@40@T7=04//4
H
=@>:I=06
H
34T.;
4;T.Z.T
H
[.T7T7=/?9/TI4T=JEF
Q
40@9I:]=0FJE.0T7=I=4;T.:09?>>=I,BAP+CEAC#
G
I:T=.0940@/7.>+
T=@?
G
[4I@5
H
.04T.3=;:?I/=:0RFR+CEN2
8
=5,S=/T=I095:TT.0
8
?/.0
8
40T.+CEAC#40T.9:@
H
>?IT7=I;:0+
>.I3=@T74TT7=3:5=;?54I34//:>BAP+CEAC#.0;I=4/=@
8
I4@?45
H
!
@?=T:T7=5.0]4
8
=:>EFCI.9:/=3:5=+
;?5=/:0T:T7=
G
I:T=.0,M0;:0TI4/T
!
T7=>?/.:0T4
8G
I:T=.0B7.:I=@:<.0
"
BAP
#
@.@0:T/7:[40
H
;740
8
=.0
3:9.5.T
H
,B7=/=@4T4@=3:0/TI4T=@T74T"$%&() * ++CEAC# G I:@?;=@.0,1-)074/4?T:+3:@.>.;4T.:04;+ T.Z.T H ! [7.;7>4;.5.T4T=/T7=>?0;T.:045/T?@ H :>!"#!#.0"$%&()
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G
:/TTI40/54T.:0453:@.>.;4T.:0
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G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#
G
:5
H
3=I4/=
&
G
I:]4I
H
:T.;=<
G
I=/+
/.:0
!!
多聚
EFC
核糖化(
G
:5
H
"
EFC+I.9./
H
5
#
4T.:0
)修
饰是一种稀有的翻译后修饰方式!该修饰由多聚
EFC
核糖聚合酶(
G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#
G
:5
H
3=I4/=
!
CEAC
)催化(#)
CEAC
与断裂
FJE
结合后被激
活!将细胞内
JEF
Q裂解为
EFC
核糖和尼克酰胺
两部分!然后将
EFC
核糖基团转移至受体蛋白上
CEAC
反复催化将导致在靶蛋白质上形成线性或带
分支的多聚
EFC
核糖链(#+!)多聚
EFC
核糖(
G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#!
CEA
)带负电!使得被修饰靶蛋白的
电化学性质发生改变&除了改变靶蛋白的特性外!
CEA
还与宏域"
2%-$)()2%3 #家族蛋白质具有亲 和结合力(%)!因此!在 FJE 修复过程中!发生多聚 EFC 核糖化修饰的蛋白质通过 CEA 募集宏域蛋白 质!如 PADD# 和 FJE 连接酶等 FJE 修复相关因 子($)!从而参与
FJE
修复反应多聚
EFC
核糖化
修饰是可逆的!靶蛋白上的
CEA
能被多聚
EFC
核
糖糖苷水解酶(
G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#
8
5
H
;:7
H
@I:54/=
!
CEAN
)水解(&+()
除酵母外!真核生物都有多个
!"#!
基因拟
南 芥 中 有
%
个
!"#!
$!"#!# * !"#!! 和 !"#!% ( * ) 拟南芥 CEAC# 与动物中的 CEAC# 在 一级结构上高度相似!它有 % 个独立的结构域$
#
个
FJE
结合区域*
#
个自我修饰区域和
#
个催化区
域
FJE
结合域由
%
个锌指"
6.0;>.0
8
=I
#基序组
成!作用是与
FJE
结合并且参与
CEAC#
同源二聚
体的形成(+1)自我修饰结构域上的某些谷氨酸残
基可作为
EFC
核糖的受体!被催化结构域修饰
值得注意的是!除了谷氨酸残基以外!自我修饰结构
域外的某些赖氨酸残基也能被修饰(#")由于蛋白
质上连上了多个
EFC
核糖!使得靶蛋白质的分子
量增加!电泳时泳动率发生改变
动物中
CEAC
的靶蛋白有
%"
个以上!但是已
发现的植物中
CECA
靶蛋白却很少动物中蛋白
质过度多聚
EFC
核糖修饰是有害的!一方面靶蛋
白被修饰失去原有的功能&另一方面
CEA
本身是
一种死亡信号(##)在拟南芥中通过基因沉默降低
!"#!
的表达!可使植株对氧化*高光照等非生物
胁迫的耐受性增强(#!)
CEAC
化学抑制剂处理拟
南芥后!能够提高它们在胁迫条件下的生物量和增
强抗性(#%)
目前对植物中
!"#!
基因功能了解非常少!其
体内功能和分子机制的深入研究需要从检测酶活性
入手因此!寻找一种易于操作的系统得到
CEAC
蛋白并进行活性测定就显得十分必要本研究采用
经典的原核表达手段!在大肠杆菌中表达并纯化得
到了具有催化多聚
EFC
核糖化反应活性的拟南芥
CEAC#
重组蛋白!从而为深入了解
CEAC
的功能
和作用机制提供条件
#
!
材料和方法
;,;
!
材
!
料
拟南芥"
"$%&() * ++4.%0%3%L, #为 D:5?39.4 生态型" D:5+" #将种子用 *"^ 乙醇消毒后!播种在 # % !_R 培养基上光照培养箱培养! 周后取幼苗 用博来霉素" M0Z.TI: 8 =0 公司#处理!然后液氮速冻 待用 ;,< ! 方 ! 法 ;=<=; ! 4!54; 基因 &>? 检测与 >%@ 序列的扩增 ! 拟南芥幼苗用博莱霉素处理后在液氮中研磨!用 BI.6:5C5?/ " B4]4I4 公司#提取总 AJE 提取的 AJE 经 FJ4/=M " B4]4I4 公司#处理后!用反转录酶 " B4]4I4 公司#反转录根据 !"#!# 的 ;FJE 序 列信息!设计定量 CDA 引物 CEAC# + Y " &`+END+ DBNEENNDDDNNNBEEDE+%` #和 CEAC# + A " &`+NDBNBDBDENBBBBNNDBNDDN+%` #内参 基因 "-43! 的引物为 EDB! + Y " &`+EBDNNBN+ NBBDDEBBDBBNDBBD+%` #和 EDB! + A " &`+BN+ NEDDBNDDBDEBDEBEDBDN+%` #使用 B4]4I4 公司 RabA " CI=3.<2<5% 6 B_ " B5.AJ4/=WC5?/ # 试剂盒进行 CDA 扩增!反应在 EbM*&"" 荧光定量 CDA 仪上进行 CDA 扩增程序为$
1&O
预变性!
%"
/
&
1&O
!
&/
!
&O
!
%$/ !$"
个循环用
!
)
##
DT方法
计算基因相对表达值为了扩增
!"#!#
基因全长
;FJE
!根据
!"#!#
基因全长
;FJE
序列信息!在
起始密码子上游与终止子下游附近序列设计正向引
物"
&`+BEEEEDDENEEEDEBDBEDEEDNDD+%`
#
和反向引物"
&`+NBBDNBBBEDBDBBBBNBNBD+
NDEB+%`
#用保真度较高的
CI.3=RBEAFJE
聚合酶"
B4]4I4
公司#进行扩增
;,<,<
!
原核表达克隆的构建
!
将目的条带割胶回
收后!用
&`
端分别带有
7%-
#
和
8)4
#
限制性酶切
位点的引物
CEAC#+R4;
#
"
&`+NNENDBDEBN+
NDEENDDDEDEBE+%`
#和
CEAC#+J:T
#
"
&`+
NNDNNDDNDBDEBDBDBBNBNDBBE+%`
#再 次
扩增!回收大小正确的条带!用
B
$FJE 连接酶 " B4]4I4 公司#连接到 G DA+b5?0T$
"
M0Z.TI:
8
=0
公
司#载体!转化大肠杆菌
FW&
%
!挑选单菌落!摇菌并
抽提质粒!测序得到序列正确的克隆后!抽提
*(
&
期
!!!!!!!!!!
张海磊!等$拟南芥多聚 EFC 核糖聚合酶 # 的原核表达与活性检测 FJE 进行双酶切!与带有 7%- # 和 8)4 # 粘性末端 的 G 2B%!4 载体连接!转化 FW&4 感受态细胞!挑单 菌落摇菌并抽提质粒!酶切鉴定确认克隆 G 2B%!4+ CEAC# 构建完成 ;,<,A ! 重组蛋白的预表达 ! 得到的 G 2B%!4+ CEAC# 质粒用于转化表达宿主菌 KI. 8 43. " F2% #感 受态细胞!挑单菌落!摇菌至 KF ("" 为 ", 时加入 MCBN 至终浓度为 ",%33:5 % L 然后在 #(O 继续 培养 !"7 离心收集菌体!重悬后超声仪破碎最 后利用 RFR+CEN2 电泳检测目的蛋白的表达 ;,<,B ! 重组蛋白的纯化 ! 在上述表达条件下扩大 菌体培养量!收集菌体并超声破碎!离心收集上清! 利用 W./C?IJ.+JBE 亲和介质进行纯化上样缓 冲液" #"33:5 % LBI./ G W*, ! #^ BI.T:0P+#"" ! & 33:5 % L 咪唑! &""33:5 % L 氯化钠! ",#^ C_RY #! 洗涤缓冲液" #"33:5 % LBI./ G W*, ! #^ BI.T:0 P+#"" ! *"33:5 % L 氯化钾! %&33:5 % L 咪唑! ",#^ C_RY #!洗脱缓冲液" #"33:5 % LBI./ G W*, ! #^ BI.T:0P+#"" ! *"33:5 % L 氯化钾! %""33:5 % L 咪 唑! ",#^ C_RY #纯化的 BI<+CEAC# 在缓冲液 " !"33:5 % LBI./ G W*,& ! &"33:5 % L 氯化钠! *,& 33:5 % L 氯化镁! ",!33:5 % L 二硫苏糖醇#和 #" & 3:5 % L 超声断裂的 FJE 中透析 ;=<=C ! &$?&;
的活性分析
!
将反应缓冲液分成若
干等分!每
#""
&
L
反应液加入约
#&
&
8
BAP+
CEAC#
或
%
&
8
BAP
!并加入终浓度为
",!33:5
%
L
的
JEF
Q起始反应在不同时间点加入预冷的丙
酮终止反应!然后用
RFR+CEN2
分析样品!考马斯
亮蓝染胶
;=<=D
!
E01+0286"++#2
F
分析
!
于反应后的融合蛋
白
BAP+CEAC#
样品中加入
%
倍体积的预冷丙酮!
终止反应
#!"""
8
离心
#&3.0
!取沉淀加入
!"
&
L
的
#cRFR+CEN2
上样缓冲液混匀!沸水浴

3.0
!离心取上清再将样品稀释
#""
倍!取
#&
&
L
进行
RFR+CEN2
分析!然后转至硝酸纤维素膜上
转膜完成后!用少量去离子水清洗
!
次!放入封闭液
中封闭
#7
!之后用
#"3LBbRB
缓冲液"
!"33:5
%
LBI./+WD5
G
W*,&
!
#&" 33:5
%
L J4D5
!
","&^
B[==0!"
#洗涤
#"3.0
!重复
%
次!在膜上加入
BbRBQ
兔抗
CEAC#
抗体"
#d#""
稀释#!室温孵
育
#7
之后用
BbRB
缓冲液洗涤
%
次!每次
#"
3.0
沥干
BbRB
缓冲液后!加入羊抗兔
M
8
N
二抗
"
#d$""" 稀释#浸没膜!室温再次孵育 #7 然后 BbRB 缓冲液清洗 #"3.0 !重复 % 次!最后曝光 ! ! 结果与分析 <=; ! 4!54; 基因原核表达载体的构建 拟南芥 !"#!# 基因在正常情况下表达水平较 低!但受 FJE 损伤诱导博莱霉素能够引起 FJE 断裂!提高 !"#!# 基因转录水平"图 # #为了便 于扩增 !"#!# 基因的 ;FJE !用浓度为 #" & 8 % 3L 博莱霉素处理 ! 周大小的拟南芥幼苗 !7 后提取 总 AJE !进行反转录后扩增 !"#!# 编码序列琼 脂糖电泳检测到目标条带"图 ! #!回收目标片段 设计带有 7%- # 和 8)4 # 酶切位点的引物!扩增 CEAC# 蛋白的编码序列!克隆到中间载体!得到测序 正确的克隆后!酶切后与带有同样粘性末端的 G 2B%!4 相连!得到 G 2B%!4+CEAC# 表达载体"图 ! # <=< ! G.7&$?&;
重组蛋白的表达
将
G
2B%!4+CEAC#
转入
KI.
8
43.
"
F2%
#表达宿
图
#
!
拟南芥
!"#!#
基因受博莱霉素诱导后的相对表达
Y.
8
,#
!
B7=I=54T.Z==<
G
I=//.:05=Z=5:>!"#!#
.0"$%&() * ++4>T=I95=:3 H ;.0.0@?;T.:0 图 ! ! !"#!# 基因 ;FJE "左#的扩增结果和 G 2B%!4+CEAC# 质粒双酶切产物"右# _,FJE 分子量标准& #, 目的基因 !"#!# 的 ;FJE 片段& !, G 2B%!4+CEAC# 重组质粒经过 7%- # 和 8)4 # 酶切的产物 Y. 8 ,! ! D5:0=@;FJE:>!"#!# 8 =0= " 5=>T G 40=5 # 40@ I=/TI.;T.:0@. 8 =/T.:0:> G 2B%!4+CEAC# G 54/3.@ " I. 8 7T G 40=5 # _ ! FJE3:5=;?54I[=. 8 7T/T40@4I@ & #,;FJE:>!"#!# 8 =0= & !,F. 8 =/T=@ G 2B%!4+CEAC# G 54/3.@ ( 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$
卷
主菌中!当培养物
KF
(""
达
",
时!加入
MCBN
至终
浓度为
",%33:5
%
L
!在不同的诱导温度表达目标
蛋白!通过
RFR+CEN2
电泳比较细菌裂解液中上清
与沉淀中的
BAP+CEAC#
蛋白含量结果表明!当
诱导温度为
#(O
!诱导时间为
!"7
时!上清中有较
多的分子量大小为
#%"]F
左右的
BAP+CEAC#
目
的蛋白虽然大部分融合蛋白以不可溶的包涵体形
式存在!但是仍然有足够量的
BAP+CEAC#
融合蛋
白留在上清中"图
%
#!可以用于目的蛋白质纯化并
进行活性分析
<=A
!
G?H7&$?&; 重组蛋白及标签蛋白 G?H 的纯化 在上述条件下扩大培养菌体!同时为了排除标 签蛋白 BAP 对重组蛋白活性的贡献!用 G 2B%!4 空 载体转化表达宿主菌!利用与 BAP+CEAC# 表达条 件一致的条件表达标签蛋白质 BAP !最后用 W./+ C?IJ.+JBE 亲和介质分别纯化这 ! 个蛋白质为 了去除洗脱缓冲液中的咪唑等杂质!将从亲和介质 上洗脱下来的 BAP+CEAC# 重组蛋白与标签蛋白 BAP 在反应缓冲液中透析 CEAC# 理论等电点为 , !为了避免透析过程中出现沉淀失活!把透析缓 冲液 G W 调到 *,& !以远离等电点!同时选择在$O
条件下透析最后经过
RFR+CEN2
胶检测!确认得
到了符合活性测定要求的标签蛋白
BAP
和
BAP+
CEAC#
重组蛋白"图
$# <=B ! G?H7&$?&;
重组蛋白的活性测定
拟南芥
CEAC#
具有
%
个结构域!催化结构域
图
%
!
BAP+CEAC#
重组蛋白表达产物的
RFR+CEN2
电泳分析
#,MCBN
诱导前总蛋白&
!
*
%,
分别为
#(O
时!
MCBN
诱导后的可溶蛋白
与不溶蛋白&黑色和白色箭头分别指示可溶与不可溶目标蛋白
Y.
8
,%
!
RFR+CEN2=5=;TI:
G
7:I=/./4045
H
/./:>
T7==<
G
I=//.:0
G
I:@?;T:>BAP+CEAC#
#,S7:5=;=55
H
/4T=[.T7:?TMCBN.0@?;T.:0
&
!
!
%,R:5?95=40@
.0/:5?95==<
G
I=//.:0
G
I:@?;T/
!
I=/
G
=;T.Z=5
H
!
4>T=IMCBN
.0@?;T.:04T#(O
&
B7=954;]40@[7.T=4II:[/.0@.;4T=
/:5?95=40@.0/:5?95=T4I
8
=T
G
I:T=.0
!
I=/
G
=;T.Z=5
H
能够将
EFC
核糖转移到自我修饰结构域上!对自
身进行多聚
EFC
核糖化修饰多聚
EFC
核糖的
修饰会导致自身分子量的增加在
BAP+CEAC#
活性检测液中加入
JEF
Q底物!反应不同时间后加
入丙酮终止反应!然后经过
RFR+CEN2
分析
BAP+
CEAC#
泳动情况结果"图
&
#表明!
BAP+CEAC#
蛋白质在加入
JEF
Q 后!在
#%"]F
左右的
BAP+
CEAC#
主带逐渐变得模糊!呈现出向上的弥散!时
图
$! BAP+CEAC# 融合蛋白与其标签蛋白 BAP 纯化后的 RFR+CEN2 电泳分析 _, 蛋白质分子量标准& #, 未经 MCBN 诱导的含 G 2B%!4 质粒宿主菌 KI. 8 43. " F2% #的总蛋白& !, 含 G 2B%!4 质粒表达菌体经 MCBN 诱导 后的可溶蛋白& %, 纯化的 BAP 蛋白&$,
含
G
2B%!4+CEAC#
质粒
表达菌体经
MCBN
诱导后的可溶蛋白&
,
纯化的
BAP+CEAC#
蛋白
Y.
8
,$
!
RFR+CEN2=5=;TI:
G
7:I=/./4045
H
/./:>
G
?I.>.=@
BAP+CEAC#>?/.:0
G
I:T=.040@BAPT4
8G
I:T=.0
_,CI:T=.03:5=;?54I[=.
8
7T/T40@4I@
&
#
!
,B:T45/:5?95=
=8
43.
"
F2%
#
;:0T4.0.0
8G
2B%!4
G
54/3.@9=>:I=
40@4>T=IMCBN.0@?;T.:0
!
I=/
G
=;T.Z=5
H
&
%,C?I.>.=@BAP
G
I:T=.0
&
$,B:T45/:5?95==8
43.
"
F2%
#
;:0T4.0.0
8
BAP+CEAC#
G
54/3.@4>T=IMCBN.0@?;T.:0
&
,C?I.>.=@BAP+CEAC#
G
I:T=.0
图
&
!
CEAC#
活性的
RFR+CEN2
电泳分析
BAP+CEAC#
"上#和
BAP
"下#分别与
JEF
Q孵育不同时间后!
取反应产物经
RFR+CEN2
电泳分析分子量的变化红框中显示
由于蛋白质发生了自修饰而导致
BAP+CEAC#
条带逐渐向上模糊
Y.
8
,&
!
RFR+CEN2=5=;TI:
G
7:I=/./4045
H
/./
:>T7==06
H
34T.;4;T.Z.T
H
:>BAP+CEAC#
E>T=I.0;?94T.:0[.T7JEF
Q
>:I@.>>=I=0TT.3=
G
=I.:@/
!
T7=I=4;T.:0
G
I:@?;T/:>BAP+CEAC#
"
?
GG
=I
G
40=5
#
40@BAP
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重组蛋白
的活性
为了进一步证实
CEAC#
催化自身的多聚
EFC
核糖化反应!用
CEAC#
抗体检验反应前后
CEAC#
分子量变化
S=/T=I095:TT.0
8
结果表明!随着多聚
EFC
核糖化反应的进行!共价结合在
CEAC#
上的
多聚
EFC
核糖基团逐渐增大!导致
CEAC#
的分子
量逐渐增大!出现凝胶阻滞现象"图
(
#随着
CEAC#
上结合的多聚
EFC
核糖基团增大!
CEAC#
与它的抗体的亲和力减弱!表现为越向上弥散的
CEAC#
呈现越弱的免疫信号推测
CEAC#
与它
的抗体的结合位点被多聚
EFC
核糖屏蔽!阻碍了
二者的结合!多聚
EFC
核糖基团越大!屏蔽越严
重&另外也可能由于多聚
EFC
核糖基团带负电!随
着负电荷的增加!抗原
+
抗体亲和力受到干扰而逐渐
减弱以上结果表明!
CEAC#
确实能够催化自身的
多聚
EFC
核糖化反应
图
(
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S=/T=I095:TT.0
8
分析
BAP+CEAC#
的活性
BAP+CEAC#
与
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Q孵育不同时间后!
取反应产物用
CEAC#
抗体进行检测
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为了深入研究植物
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基因功能!尝试通
过原核表达来获得具有多聚
EFC
核糖聚合酶活性
的拟南芥
CEAC#
在催化多聚
EFC
核糖化反应过
程中!
CEAC
先将底物
JEF
Q 裂解为尼克酰胺和
EFC
核糖两部分!因此!在测定酶活时!有的方法通
过测定反应时释放的尼克酰胺的量来检测植物
CEAC
的活性(#$)!但这种方法比较间接通过观察 CEAC# 自身多聚 EFC 核糖化反应前后分子量和 凝胶迁移率的变化!可以直观地了解其酶活性!而且 实验系统比较简单!几乎所有分子生物学实验室都 能进行!实验重复性也较强除了本实验中用到的 KI. 8 43. " F2% #宿主菌!还尝试了利用 bL!# " F2% # 作为宿主菌来表达 !"#!# 基因!但没能表达出的 目标蛋白 KI. 8 43. " F2% #是 J:Z4 8 =0 公司改造过 的利于外源蛋白正确折叠的宿主菌! !"#!# 基因 能在 KI. 8 43. " F2% #中表达!说明正确的折叠对 !"#!# 基因的表达很重要拟南芥 !"#!# 基因 作为最重要的 !"#! 成员!它的体外表达与对其酶 活性的研究将为深入研究 !"#! 的功能奠定基础 参与 FJE 损伤修复是动物 !"#!# 基因的一 个重要功能研究发现!拟南芥 !"#!# 转录受基 因毒剂诱导(#&)!它在正常情况下表达水平较低!而 在基因毒剂诱导下表达出现显著的上升!提示植物 !"#!# 基 因 可 能 参 与 FJE 损 伤 修 复除 了 CEAC# 蛋白自身! CEAC# 还能多聚 EFC 核糖化修 饰组蛋白 W# * W! 等(#(+#) CEA 带负电荷!能够中 和组蛋白上的正电荷!从而使组蛋白与 FJE 解合 变得松弛!有利于 FJE 修复蛋白接近 FJE 损伤的 位点从而行使修复功能 CEAC 活性的激活需要维持在适当水平 JEF Q在细胞内起到维持氧化还原状态的作用!同 时它也是一个能量代谢的中间物当细胞出现严重 的 FJE 损伤时! CEAC# 会被过度激活!消耗大量 的 JEF Q ! JEF Q的合成需要 EBC 为前体!所以最 终导致 EBC 的大量消耗在能量衰竭的情况下! 细胞就会发生死亡本研究表明!拟南芥 CEAC# 消耗 JEF Q速率较快!在 #"/ 就有明显的泳动速率 变化!据此推测体内 CEAC# 的过度激活会消耗大 量的 JEF Q CEAC# 合成的 CEA 是一种死亡信 号(##)!能够激发细胞编程性死亡!所以需要及时被 多聚 EFC 核糖水解酶解现有研究发现!通过 AJE 干扰技术沉默植物 !"#!# 基因或是使用 CEAC 抑制剂能够降低 JEF Q的消耗从而维持细 胞的能量平衡!增强植物对干旱和氧化等胁迫的耐 受性*减少胁迫造成的细胞死亡(#!)另外! !"#! 基因可能调节细胞内的氧化还原状态!其表达与活 性与 NRW 在细胞内的积累和定位有关(#1) 虽然本研究报道了 CEAC# 自身进行多聚 EFC 核糖化修饰!但是能被 CEAC# 多聚 EFC 核糖化修 饰的靶蛋白不仅局限在它自身!动物中就已经发现 %" 个以上的靶蛋白!包括转录因子* FJE 修复蛋 "* 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$
卷
白*细胞核结构蛋白等多聚
EFC
核糖化的修饰
导致靶蛋白结构的改变!最终导致蛋白与蛋白相互
作用*蛋白与
FJE
相互作用*酶活性或者亚细胞定
位的变化(!"+!#)例如!组蛋白
W#
*
W!E
和
W!b
的
多聚
EFC
核糖化修饰影响它们与
FJE
的结合!
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的多聚
EFC
核糖化修饰阻碍它与核输出蛋白
的相互作用(!!+!%)另外!
CEAC#
还能够多聚
EFC
核糖化修饰细胞核因子以及核酶(!!!$)最近有文 献报道拟南芥 CEAC 的活性与生长发育有关!抑制 CEAC 的活性能够影响细胞周期相关基因的表达* 影响初级和次级代谢途径*细胞内氧化还原状态以 及能量平衡(#%!&) 与动物 CEAC 相比!目前人们对植物 CEAC 蛋 白的认识还十分有限!尤其是植物中 CEAC 的靶蛋 白所知甚少!目前已知的只有组蛋白 W# * W!E 和 W!b 以及在病原菌浸染时一个被多聚 EFC 核糖修 饰的未知蛋白(!()!更多的靶蛋白还有待于发现为 了识别更多的 CEAC 靶蛋白! S=/T=I095:TT.0 8 及 免疫共沉淀" D:+MC #是常用的实验手段这时就需 要多聚 EFC 核糖抗体!目前多聚 EFC 核糖的商业 化抗体所使用的抗原多为哺乳动物 CEAC 合成的 多聚 EFC 核糖原核表达拟南芥 CEAC# 合成的 CEA 可以用来来制备特异性更强的植物 CEA 抗 体另外!一旦发现新的 CEAC 靶蛋白!可以利用 本实验方法来体外验证该靶蛋白能否被 CEAC# 修饰 参考文献! ( # ) ! E_efD ! RC2JL2WEX2AD ! F2_XADMEN,B7=CEAC/? G =I>43.5 H ( f ) ,9)/++% : + ! ""$
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封面植物介绍"""裸茎碎米荠
裸茎碎米荠"
C%$(%23/+-% * )+%YI40;7, #隶属于十字花科" bI4//.;4;=4= #碎米荠属多年生草本!高$

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!花葶状!全株无毛根状茎纤细!匍匐生长茎单一直立!无叶基生叶单一&叶柄长
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&叶
近于圆形或肾状圆形!长
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朵花果期花梗直立或上升!长
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!顶端圆或微凹!基部
渐狭呈短爪中间一对花丝长
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&花药狭长卵形!
长
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#,33
&花柱长
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每室具胚珠


#$个长角果长 !," %,&;3 !宽 #,! #,*33 & 光滑无毛种子淡褐色!长圆形!长 ! %33 !宽 #," #,&33 !无翅花期$

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月!果期
(

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月
裸茎碎米荠是中国特有一种药用植物!生长在海拔
#$"" !1""3 的灌木丛和潮湿地带分布于河 北*内蒙古*陕西*山西和四川 !图文由西北农林科技大学资环学院朱仁斌提供" !* 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$
卷