全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$+"$+#$
基金项目$国家自然科学基金"
%#"*"!%!
!
%##*"#(1
#
作者简介$张海磊"
#1&)
#!男!硕士!主要从事植物生理和分子生物学研究
2+34.5
$
6740
8
9.:5
!8
34.5,;:3
"
通信作者$葛晓春!博士!教授!博士生导师!主要从事植物生理和分子生物学研究
2+34.5
$
<;
8
=
!
>?@40,=@?,;0
拟南芥多聚
$%&
核糖聚合酶
!
的
原核表达与活性检测
张海磊!吴
!
巧!葛晓春"
"复旦大学 生命科学学院!上海
!""$%%
#
摘
!
要$采用
AB+CDA
技术获得了拟南芥多聚
EFC
核糖聚合酶(
G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#
G
:5
H
3=I4/=
!
CEAC
)
!"#!#
基
因的全长
;FJE
!转入原核表达载体
G
2B%!4
并转化宿主菌
KI.
8
43.
"
F2%
#!加入终浓度为
",%33:5
%
LMCBN
!在
#(O
下诱导可获得较多的可溶重组蛋白纯化
BAP+CEAC#
!在反应液中加入
JEF
Q和断裂
FJE
!通过
RFR+CEN2
凝
胶电泳和
S=/T=I095:TT.0
8
分析!
BAP+CEAC#
分子量可随着时间的延长逐渐增大!产生向上的弥散!表明蛋白质连
上了
EFC
核糖分子&与此对比!作为参照的标签蛋白
BAP
无此现象实验结果显示原核表达拟南芥
CEAC#
能够
催化自身多聚
EFC
核糖化修饰!为深入研究植物多聚
EFC
核糖聚合酶的功能奠定了基础
关键词$拟南芥&翻译后修饰&多聚
EFC
核糖聚合酶&原核表达
中图分类号$
U*(
文献标志码$
E
&"()
*
"+#,-.
/
011#"2)2!-23
*
4)+#,$11)
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2
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H
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D7.04
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H
T7==06
H
34T.;4;T.Z.T
H
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*
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G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#
G
:5
H
3=I4/=#
"
CEAC#
#!
T7=;FJE>I4
8
3=0T:>!"#!#[4/43
G
5.>.=@?/.0
8
A=Z=I/=+BI40/;I.
G
T.:0CDA3=T7:@>I:3
"$%&()
*
++/==@5.0
8
/TI=4T=@9
H
95=:3
H
;.0,B7=;FJE/=
?=0;=[4/;5:0=@.0T:
G
I:]4I
H
:T.;=<
G
I=//.:0
Z=;T:I
G
2B%!40@T7=I=/?5T40T
G
2B%!4+CEAC#
G
54/3.@[4/TI40/>:I3=@.0T:,+-./$-.%-)07:/T/TI4.0
KI.
8
43.
"
F2%
#
,MCBN[4/4@@=@.0T:T7=;?5T?I=T:4>.045;:0;=0TI4T.:0:>",%33:5
%
LT:.0@?;==<
G
I=/+
/.:04T#(O>:I!"7,B7=I=;:39.040T
G
I:T=.0BAP+CEAC#[4/
G
?I.>.=@40@T7=04//4
H
=@>:I=06
H
34T.;
4;T.Z.T
H
[.T7T7=/?9/TI4T=JEF
Q
40@9I:]=0FJE.0T7=I=4;T.:09?>>=I,BAP+CEAC#
G
I:T=.0940@/7.>+
T=@?
G
[4I@5
H
.04T.3=;:?I/=:0RFR+CEN2
8
=5,S=/T=I095:TT.0
8
?/.0
8
40T.+CEAC#40T.9:@
H
>?IT7=I;:0+
>.I3=@T74TT7=3:5=;?54I34//:>BAP+CEAC#.0;I=4/=@
8
I4@?45
H
!
@?=T:T7=5.0]4
8
=:>EFCI.9:/=3:5=+
;?5=/:0T:T7=
G
I:T=.0,M0;:0TI4/T
!
T7=>?/.:0T4
8G
I:T=.0B7.:I=@:<.0
"
BAP
#
@.@0:T/7:[40
H
;740
8
=.0
3:9.5.T
H
,B7=/=@4T4@=3:0/TI4T=@T74T"$%&()
*
++CEAC#
G
I:@?;=@.0,1-)074/4?T:+3:@.>.;4T.:04;+
T.Z.T
H
!
[7.;7>4;.5.T4T=/T7=>?0;T.:045/T?@
H
:>!"#!#.0"$%&()
*
++,
90
*
:"!1
$
"$%&()
*
++
&
G
:/TTI40/54T.:0453:@.>.;4T.:0
&
G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#
G
:5
H
3=I4/=
&
G
I:]4I
H
:T.;=<
G
I=/+
/.:0
!!
多聚
EFC
核糖化(
G
:5
H
"
EFC+I.9./
H
5
#
4T.:0
)修
饰是一种稀有的翻译后修饰方式!该修饰由多聚
EFC
核糖聚合酶(
G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#
G
:5
H
3=I4/=
!
CEAC
)催化(#)
CEAC
与断裂
FJE
结合后被激
活!将细胞内
JEF
Q裂解为
EFC
核糖和尼克酰胺
两部分!然后将
EFC
核糖基团转移至受体蛋白上
CEAC
反复催化将导致在靶蛋白质上形成线性或带
分支的多聚
EFC
核糖链(#+!)多聚
EFC
核糖(
G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#!
CEA
)带负电!使得被修饰靶蛋白的
电化学性质发生改变&除了改变靶蛋白的特性外!
CEA
还与宏域"
2%-$)()2%3
#家族蛋白质具有亲
和结合力(%)!因此!在
FJE
修复过程中!发生多聚
EFC
核糖化修饰的蛋白质通过
CEA
募集宏域蛋白
质!如
PADD#
和
FJE
连接酶等
FJE
修复相关因
子($)!从而参与
FJE
修复反应多聚
EFC
核糖化
修饰是可逆的!靶蛋白上的
CEA
能被多聚
EFC
核
糖糖苷水解酶(
G
:5
H
"
EFC+I.9:/=
#
8
5
H
;:7
H
@I:54/=
!
CEAN
)水解(&+()
除酵母外!真核生物都有多个
!"#!
基因拟
南 芥 中 有
%
个
!"#!
$
!"#!#
*
!"#!!
和
!"#!%
(
*
)
拟南芥
CEAC#
与动物中的
CEAC#
在
一级结构上高度相似!它有
%
个独立的结构域$
#
个
FJE
结合区域*
#
个自我修饰区域和
#
个催化区
域
FJE
结合域由
%
个锌指"
6.0;>.0
8
=I
#基序组
成!作用是与
FJE
结合并且参与
CEAC#
同源二聚
体的形成(+1)自我修饰结构域上的某些谷氨酸残
基可作为
EFC
核糖的受体!被催化结构域修饰
值得注意的是!除了谷氨酸残基以外!自我修饰结构
域外的某些赖氨酸残基也能被修饰(#")由于蛋白
质上连上了多个
EFC
核糖!使得靶蛋白质的分子
量增加!电泳时泳动率发生改变
动物中
CEAC
的靶蛋白有
%"
个以上!但是已
发现的植物中
CECA
靶蛋白却很少动物中蛋白
质过度多聚
EFC
核糖修饰是有害的!一方面靶蛋
白被修饰失去原有的功能&另一方面
CEA
本身是
一种死亡信号(##)在拟南芥中通过基因沉默降低
!"#!
的表达!可使植株对氧化*高光照等非生物
胁迫的耐受性增强(#!)
CEAC
化学抑制剂处理拟
南芥后!能够提高它们在胁迫条件下的生物量和增
强抗性(#%)
目前对植物中
!"#!
基因功能了解非常少!其
体内功能和分子机制的深入研究需要从检测酶活性
入手因此!寻找一种易于操作的系统得到
CEAC
蛋白并进行活性测定就显得十分必要本研究采用
经典的原核表达手段!在大肠杆菌中表达并纯化得
到了具有催化多聚
EFC
核糖化反应活性的拟南芥
CEAC#
重组蛋白!从而为深入了解
CEAC
的功能
和作用机制提供条件
#
!
材料和方法
;,;
!
材
!
料
拟南芥"
"$%&()
*
++4.%0%3%L,
#为
D:5?39.4
生态型"
D:5+"
#将种子用
*"^
乙醇消毒后!播种在
#
%
!_R
培养基上光照培养箱培养! 周后取幼苗
用博来霉素"
M0Z.TI:
8
=0
公司#处理!然后液氮速冻
待用
;,<
!
方
!
法
;=<=;
!
4!54;
基因
&>?
检测与
>%@
序列的扩增
!
拟南芥幼苗用博莱霉素处理后在液氮中研磨!用
BI.6:5C5?/
"
B4]4I4
公司#提取总
AJE
提取的
AJE
经
FJ4/=M
"
B4]4I4
公司#处理后!用反转录酶
"
B4]4I4
公司#反转录根据
!"#!#
的
;FJE
序
列信息!设计定量
CDA
引物
CEAC#
+
Y
"
&`+END+
DBNEENNDDDNNNBEEDE+%`
#和
CEAC#
+
A
"
&`+NDBNBDBDENBBBBNNDBNDDN+%`
#内参
基因
"-43!
的引物为
EDB!
+
Y
"
&`+EBDNNBN+
NBBDDEBBDBBNDBBD+%`
#和
EDB!
+
A
"
&`+BN+
NEDDBNDDBDEBDEBEDBDN+%`
#使用
B4]4I4
公司
RabA
"
CI=3.<2<5%
6
B_
"
B5.AJ4/=WC5?/
#
试剂盒进行
CDA
扩增!反应在
EbM*&""
荧光定量
CDA
仪上进行
CDA
扩增程序为$
1&O
预变性!
%"
/
&
1&O
!
&/
!
&O
!
%$/
!
$"
个循环用
!
)
##
DT方法
计算基因相对表达值为了扩增
!"#!#
基因全长
;FJE
!根据
!"#!#
基因全长
;FJE
序列信息!在
起始密码子上游与终止子下游附近序列设计正向引
物"
&`+BEEEEDDENEEEDEBDBEDEEDNDD+%`
#
和反向引物"
&`+NBBDNBBBEDBDBBBBNBNBD+
NDEB+%`
#用保真度较高的
CI.3=RBEAFJE
聚合酶"
B4]4I4
公司#进行扩增
;,<,<
!
原核表达克隆的构建
!
将目的条带割胶回
收后!用
&`
端分别带有
7%-
#
和
8)4
#
限制性酶切
位点的引物
CEAC#+R4;
#
"
&`+NNENDBDEBN+
NDEENDDDEDEBE+%`
#和
CEAC#+J:T
#
"
&`+
NNDNNDDNDBDEBDBDBBNBNDBBE+%`
#再 次
扩增!回收大小正确的条带!用
B
$
FJE
连接酶
"
B4]4I4
公司#连接到
G
DA+b5?0T
$
"
M0Z.TI:
8
=0
公
司#载体!转化大肠杆菌
FW&
%
!挑选单菌落!摇菌并
抽提质粒!测序得到序列正确的克隆后!抽提
*(
&
期
!!!!!!!!!!
张海磊!等$拟南芥多聚
EFC
核糖聚合酶
#
的原核表达与活性检测
FJE
进行双酶切!与带有
7%-
#
和
8)4
#
粘性末端
的
G
2B%!4
载体连接!转化
FW&4
感受态细胞!挑单
菌落摇菌并抽提质粒!酶切鉴定确认克隆
G
2B%!4+
CEAC#
构建完成
;,<,A
!
重组蛋白的预表达
!
得到的
G
2B%!4+
CEAC#
质粒用于转化表达宿主菌
KI.
8
43.
"
F2%
#感
受态细胞!挑单菌落!摇菌至
KF
(""
为
",
时加入
MCBN
至终浓度为
",%33:5
%
L
然后在
#(O
继续
培养
!"7
离心收集菌体!重悬后超声仪破碎最
后利用
RFR+CEN2
电泳检测目的蛋白的表达
;,<,B
!
重组蛋白的纯化
!
在上述表达条件下扩大
菌体培养量!收集菌体并超声破碎!离心收集上清!
利用
W./C?IJ.+JBE
亲和介质进行纯化上样缓
冲液"
#"33:5
%
LBI./
G
W*,
!
#^ BI.T:0P+#""
!
&
33:5
%
L
咪唑!
&""33:5
%
L
氯化钠!
",#^ C_RY
#!
洗涤缓冲液"
#"33:5
%
LBI./
G
W*,
!
#^ BI.T:0
P+#""
!
*"33:5
%
L
氯化钾!
%&33:5
%
L
咪唑!
",#^
C_RY
#!洗脱缓冲液"
#"33:5
%
LBI./
G
W*,
!
#^
BI.T:0P+#""
!
*"33:5
%
L
氯化钾!
%""33:5
%
L
咪
唑!
",#^ C_RY
#纯化的
BI<+CEAC#
在缓冲液
"
!"33:5
%
LBI./
G
W*,&
!
&"33:5
%
L
氯化钠!
*,&
33:5
%
L
氯化镁!
",!33:5
%
L
二硫苏糖醇#和
#"
&
3:5
%
L
超声断裂的
FJE
中透析
;=<=C
!
&$?&;
的活性分析
!
将反应缓冲液分成若
干等分!每
#""
&
L
反应液加入约
#&
&
8
BAP+
CEAC#
或
%
&
8
BAP
!并加入终浓度为
",!33:5
%
L
的
JEF
Q起始反应在不同时间点加入预冷的丙
酮终止反应!然后用
RFR+CEN2
分析样品!考马斯
亮蓝染胶
;=<=D
!
E01+0286"++#2
F
分析
!
于反应后的融合蛋
白
BAP+CEAC#
样品中加入
%
倍体积的预冷丙酮!
终止反应
#!"""
8
离心
#&3.0
!取沉淀加入
!"
&
L
的
#cRFR+CEN2
上样缓冲液混匀!沸水浴

3.0
!离心取上清再将样品稀释
#""
倍!取
#&
&
L
进行
RFR+CEN2
分析!然后转至硝酸纤维素膜上
转膜完成后!用少量去离子水清洗
!
次!放入封闭液
中封闭
#7
!之后用
#"3LBbRB
缓冲液"
!"33:5
%
LBI./+WD5
G
W*,&
!
#&" 33:5
%
L J4D5
!
","&^
B[==0!"
#洗涤
#"3.0
!重复
%
次!在膜上加入
BbRBQ
兔抗
CEAC#
抗体"
#d#""
稀释#!室温孵
育
#7
之后用
BbRB
缓冲液洗涤
%
次!每次
#"
3.0
沥干
BbRB
缓冲液后!加入羊抗兔
M
8
N
二抗
"
#d$"""
稀释#浸没膜!室温再次孵育
#7
然后
BbRB
缓冲液清洗
#"3.0
!重复
%
次!最后曝光
!
!
结果与分析
<=;
!
4!54;
基因原核表达载体的构建
拟南芥
!"#!#
基因在正常情况下表达水平较
低!但受
FJE
损伤诱导博莱霉素能够引起
FJE
断裂!提高
!"#!#
基因转录水平"图
#
#为了便
于扩增
!"#!#
基因的
;FJE
!用浓度为
#"
&
8
%
3L
博莱霉素处理
!
周大小的拟南芥幼苗
!7
后提取
总
AJE
!进行反转录后扩增
!"#!#
编码序列琼
脂糖电泳检测到目标条带"图
!
#!回收目标片段
设计带有
7%-
#
和
8)4
#
酶切位点的引物!扩增
CEAC#
蛋白的编码序列!克隆到中间载体!得到测序
正确的克隆后!酶切后与带有同样粘性末端的
G
2B%!4
相连!得到
G
2B%!4+CEAC#
表达载体"图
!
#
<=<
!
G.7&$?&;
重组蛋白的表达
将
G
2B%!4+CEAC#
转入
KI.
8
43.
"
F2%
#表达宿
图
#
!
拟南芥
!"#!#
基因受博莱霉素诱导后的相对表达
Y.
8
,#
!
B7=I=54T.Z==<
G
I=//.:05=Z=5:>!"#!#
.0"$%&()
*
++4>T=I95=:3
H
;.0.0@?;T.:0
图
!
!
!"#!#
基因
;FJE
"左#的扩增结果和
G
2B%!4+CEAC#
质粒双酶切产物"右#
_,FJE
分子量标准&
#,
目的基因
!"#!#
的
;FJE
片段&
!,
G
2B%!4+CEAC#
重组质粒经过
7%-
#
和
8)4
#
酶切的产物
Y.
8
,!
!
D5:0=@;FJE:>!"#!#
8
=0=
"
5=>T
G
40=5
#
40@
I=/TI.;T.:0@.
8
=/T.:0:>
G
2B%!4+CEAC#
G
54/3.@
"
I.
8
7T
G
40=5
#
_
!
FJE3:5=;?54I[=.
8
7T/T40@4I@
&
#,;FJE:>!"#!#
8
=0=
&
!,F.
8
=/T=@
G
2B%!4+CEAC#
G
54/3.@
(
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
主菌中!当培养物
KF
(""
达
",
时!加入
MCBN
至终
浓度为
",%33:5
%
L
!在不同的诱导温度表达目标
蛋白!通过
RFR+CEN2
电泳比较细菌裂解液中上清
与沉淀中的
BAP+CEAC#
蛋白含量结果表明!当
诱导温度为
#(O
!诱导时间为
!"7
时!上清中有较
多的分子量大小为
#%"]F
左右的
BAP+CEAC#
目
的蛋白虽然大部分融合蛋白以不可溶的包涵体形
式存在!但是仍然有足够量的
BAP+CEAC#
融合蛋
白留在上清中"图
%
#!可以用于目的蛋白质纯化并
进行活性分析
<=A
!
G?H7&$?&;
重组蛋白及标签蛋白
G?H
的纯化
在上述条件下扩大培养菌体!同时为了排除标
签蛋白
BAP
对重组蛋白活性的贡献!用
G
2B%!4
空
载体转化表达宿主菌!利用与
BAP+CEAC#
表达条
件一致的条件表达标签蛋白质
BAP
!最后用
W./+
C?IJ.+JBE
亲和介质分别纯化这
!
个蛋白质为
了去除洗脱缓冲液中的咪唑等杂质!将从亲和介质
上洗脱下来的
BAP+CEAC#
重组蛋白与标签蛋白
BAP
在反应缓冲液中透析
CEAC#
理论等电点为
,
!为了避免透析过程中出现沉淀失活!把透析缓
冲液
G
W
调到
*,&
!以远离等电点!同时选择在
$O
条件下透析最后经过
RFR+CEN2
胶检测!确认得
到了符合活性测定要求的标签蛋白
BAP
和
BAP+
CEAC#
重组蛋白"图
$
#
<=B
!
G?H7&$?&;
重组蛋白的活性测定
拟南芥
CEAC#
具有
%
个结构域!催化结构域
图
%
!
BAP+CEAC#
重组蛋白表达产物的
RFR+CEN2
电泳分析
#,MCBN
诱导前总蛋白&
!
*
%,
分别为
#(O
时!
MCBN
诱导后的可溶蛋白
与不溶蛋白&黑色和白色箭头分别指示可溶与不可溶目标蛋白
Y.
8
,%
!
RFR+CEN2=5=;TI:
G
7:I=/./4045
H
/./:>
T7==<
G
I=//.:0
G
I:@?;T:>BAP+CEAC#
#,S7:5=;=55
H
/4T=[.T7:?TMCBN.0@?;T.:0
&
!
!
%,R:5?95=40@
.0/:5?95==<
G
I=//.:0
G
I:@?;T/
!
I=/
G
=;T.Z=5
H
!
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B7=954;]40@[7.T=4II:[/.0@.;4T=
/:5?95=40@.0/:5?95=T4I
8
=T
G
I:T=.0
!
I=/
G
=;T.Z=5
H
能够将
EFC
核糖转移到自我修饰结构域上!对自
身进行多聚
EFC
核糖化修饰多聚
EFC
核糖的
修饰会导致自身分子量的增加在
BAP+CEAC#
活性检测液中加入
JEF
Q底物!反应不同时间后加
入丙酮终止反应!然后经过
RFR+CEN2
分析
BAP+
CEAC#
泳动情况结果"图
&
#表明!
BAP+CEAC#
蛋白质在加入
JEF
Q 后!在
#%"]F
左右的
BAP+
CEAC#
主带逐渐变得模糊!呈现出向上的弥散!时
图
$
!
BAP+CEAC#
融合蛋白与其标签蛋白
BAP
纯化后的
RFR+CEN2
电泳分析
_,
蛋白质分子量标准&
#,
未经
MCBN
诱导的含
G
2B%!4
质粒宿主菌
KI.
8
43.
"
F2%
#的总蛋白&
!,
含
G
2B%!4
质粒表达菌体经
MCBN
诱导
后的可溶蛋白&
%,
纯化的
BAP
蛋白&
$,
含
G
2B%!4+CEAC#
质粒
表达菌体经
MCBN
诱导后的可溶蛋白&
,
纯化的
BAP+CEAC#
蛋白
Y.
8
,$
!
RFR+CEN2=5=;TI:
G
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G
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G
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#
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#
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8G
2B%!4
G
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G
=;T.Z=5
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G
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&
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43.
"
F2%
#
;:0T4.0.0
8
BAP+CEAC#
G
54/3.@4>T=IMCBN.0@?;T.:0
&
,C?I.>.=@BAP+CEAC#
G
I:T=.0
图
&
!
CEAC#
活性的
RFR+CEN2
电泳分析
BAP+CEAC#
"上#和
BAP
"下#分别与
JEF
Q孵育不同时间后!
取反应产物经
RFR+CEN2
电泳分析分子量的变化红框中显示
由于蛋白质发生了自修饰而导致
BAP+CEAC#
条带逐渐向上模糊
Y.
8
,&
!
RFR+CEN2=5=;TI:
G
7:I=/./4045
H
/./
:>T7==06
H
34T.;4;T.Z.T
H
:>BAP+CEAC#
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Q
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G
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!
T7=I=4;T.:0
G
I:@?;T/:>BAP+CEAC#
"
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GG
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G
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#
40@BAP
"
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G
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G
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8
75.
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G
[4I@/3=4I:>BAP+CEAC#940@@?=
T:T7=4?T:+3:@.>.;4T.:04;T.Z.T
H
:>T7=
G
I:T=.0
1(
&
期
!!!!!!!!!!
张海磊!等$拟南芥多聚
EFC
核糖聚合酶
#
的原核表达与活性检测
间越长!主带越模糊!而向上扩散越严重!出现凝胶
阻滞现象&以同样的条件进行反应!作为标签蛋白的
BAP
的分子量和条带都没有明显变化"图
&
#由
此可见!
CEAC#
发生了多聚
EFC
核糖修饰!引起分
子量增加以上结果表明!大肠杆菌中表达的
CEAC#
具有自我修饰活性!能够催化多聚
EFC
核
糖修饰反应
<=C
!
E01+0286"++#2
F
分析
G?H7&$?&;
重组蛋白
的活性
为了进一步证实
CEAC#
催化自身的多聚
EFC
核糖化反应!用
CEAC#
抗体检验反应前后
CEAC#
分子量变化
S=/T=I095:TT.0
8
结果表明!随着多聚
EFC
核糖化反应的进行!共价结合在
CEAC#
上的
多聚
EFC
核糖基团逐渐增大!导致
CEAC#
的分子
量逐渐增大!出现凝胶阻滞现象"图
(
#随着
CEAC#
上结合的多聚
EFC
核糖基团增大!
CEAC#
与它的抗体的亲和力减弱!表现为越向上弥散的
CEAC#
呈现越弱的免疫信号推测
CEAC#
与它
的抗体的结合位点被多聚
EFC
核糖屏蔽!阻碍了
二者的结合!多聚
EFC
核糖基团越大!屏蔽越严
重&另外也可能由于多聚
EFC
核糖基团带负电!随
着负电荷的增加!抗原
+
抗体亲和力受到干扰而逐渐
减弱以上结果表明!
CEAC#
确实能够催化自身的
多聚
EFC
核糖化反应
图
(
!
S=/T=I095:TT.0
8
分析
BAP+CEAC#
的活性
BAP+CEAC#
与
JEF
Q孵育不同时间后!
取反应产物用
CEAC#
抗体进行检测
Y.
8
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!
S=/T=I095:TT.0
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G
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H
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G
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H
40T.+CEAC#40T.9:@
H
%
!
讨
!
论
为了深入研究植物
!"#!#
基因功能!尝试通
过原核表达来获得具有多聚
EFC
核糖聚合酶活性
的拟南芥
CEAC#
在催化多聚
EFC
核糖化反应过
程中!
CEAC
先将底物
JEF
Q 裂解为尼克酰胺和
EFC
核糖两部分!因此!在测定酶活时!有的方法通
过测定反应时释放的尼克酰胺的量来检测植物
CEAC
的活性(#$)!但这种方法比较间接通过观察
CEAC#
自身多聚
EFC
核糖化反应前后分子量和
凝胶迁移率的变化!可以直观地了解其酶活性!而且
实验系统比较简单!几乎所有分子生物学实验室都
能进行!实验重复性也较强除了本实验中用到的
KI.
8
43.
"
F2%
#宿主菌!还尝试了利用
bL!#
"
F2%
#
作为宿主菌来表达
!"#!#
基因!但没能表达出的
目标蛋白
KI.
8
43.
"
F2%
#是
J:Z4
8
=0
公司改造过
的利于外源蛋白正确折叠的宿主菌!
!"#!#
基因
能在
KI.
8
43.
"
F2%
#中表达!说明正确的折叠对
!"#!#
基因的表达很重要拟南芥
!"#!#
基因
作为最重要的
!"#!
成员!它的体外表达与对其酶
活性的研究将为深入研究
!"#!
的功能奠定基础
参与
FJE
损伤修复是动物
!"#!#
基因的一
个重要功能研究发现!拟南芥
!"#!#
转录受基
因毒剂诱导(#&)!它在正常情况下表达水平较低!而
在基因毒剂诱导下表达出现显著的上升!提示植物
!"#!#
基 因 可 能 参 与
FJE
损 伤 修 复除 了
CEAC#
蛋白自身!
CEAC#
还能多聚
EFC
核糖化修
饰组蛋白
W#
*
W!
等(#(+#)
CEA
带负电荷!能够中
和组蛋白上的正电荷!从而使组蛋白与
FJE
解合
变得松弛!有利于
FJE
修复蛋白接近
FJE
损伤的
位点从而行使修复功能
CEAC
活性的激活需要维持在适当水平
JEF
Q在细胞内起到维持氧化还原状态的作用!同
时它也是一个能量代谢的中间物当细胞出现严重
的
FJE
损伤时!
CEAC#
会被过度激活!消耗大量
的
JEF
Q
!
JEF
Q的合成需要
EBC
为前体!所以最
终导致
EBC
的大量消耗在能量衰竭的情况下!
细胞就会发生死亡本研究表明!拟南芥
CEAC#
消耗
JEF
Q速率较快!在
#"/
就有明显的泳动速率
变化!据此推测体内
CEAC#
的过度激活会消耗大
量的
JEF
Q

CEAC#
合成的
CEA
是一种死亡信
号(##)!能够激发细胞编程性死亡!所以需要及时被
多聚
EFC
核糖水解酶解现有研究发现!通过
AJE
干扰技术沉默植物
!"#!#
基因或是使用
CEAC
抑制剂能够降低
JEF
Q的消耗从而维持细
胞的能量平衡!增强植物对干旱和氧化等胁迫的耐
受性*减少胁迫造成的细胞死亡(#!)另外!
!"#!
基因可能调节细胞内的氧化还原状态!其表达与活
性与
NRW
在细胞内的积累和定位有关(#1)
虽然本研究报道了
CEAC#
自身进行多聚
EFC
核糖化修饰!但是能被
CEAC#
多聚
EFC
核糖化修
饰的靶蛋白不仅局限在它自身!动物中就已经发现
%"
个以上的靶蛋白!包括转录因子*
FJE
修复蛋
"*
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
白*细胞核结构蛋白等多聚
EFC
核糖化的修饰
导致靶蛋白结构的改变!最终导致蛋白与蛋白相互
作用*蛋白与
FJE
相互作用*酶活性或者亚细胞定
位的变化(!"+!#)例如!组蛋白
W#
*
W!E
和
W!b
的
多聚
EFC
核糖化修饰影响它们与
FJE
的结合!
G
&%
的多聚
EFC
核糖化修饰阻碍它与核输出蛋白
的相互作用(!!+!%)另外!
CEAC#
还能够多聚
EFC
核糖化修饰细胞核因子以及核酶(!!!$)最近有文
献报道拟南芥
CEAC
的活性与生长发育有关!抑制
CEAC
的活性能够影响细胞周期相关基因的表达*
影响初级和次级代谢途径*细胞内氧化还原状态以
及能量平衡(#%!&)
与动物
CEAC
相比!目前人们对植物
CEAC
蛋
白的认识还十分有限!尤其是植物中
CEAC
的靶蛋
白所知甚少!目前已知的只有组蛋白
W#
*
W!E
和
W!b
以及在病原菌浸染时一个被多聚
EFC
核糖修
饰的未知蛋白(!()!更多的靶蛋白还有待于发现为
了识别更多的
CEAC
靶蛋白!
S=/T=I095:TT.0
8
及
免疫共沉淀"
D:+MC
#是常用的实验手段这时就需
要多聚
EFC
核糖抗体!目前多聚
EFC
核糖的商业
化抗体所使用的抗原多为哺乳动物
CEAC
合成的
多聚
EFC
核糖原核表达拟南芥
CEAC#
合成的
CEA
可以用来来制备特异性更强的植物
CEA
抗
体另外!一旦发现新的
CEAC
靶蛋白!可以利用
本实验方法来体外验证该靶蛋白能否被
CEAC#
修饰
参考文献!
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封面植物介绍"""裸茎碎米荠
裸茎碎米荠"
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#隶属于十字花科"
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#碎米荠属多年生草本!高
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!花葶状!全株无毛根状茎纤细!匍匐生长茎单一直立!无叶基生叶单一&叶柄长
#

#!;3
&叶
近于圆形或肾状圆形!长
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!,";3
!宽
",&

%,";3
!基部心形!边缘波状或全缘无茎生叶总状花序
顶生!具
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朵花果期花梗直立或上升!长
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!基部的最长萼片卵圆形或椭圆形!长
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宽
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!边缘膜质!白色透明花瓣白色!倒卵形!长


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!宽
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!顶端圆或微凹!基部
渐狭呈短爪中间一对花丝长
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!基部略扩大&外侧一对花丝长
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$,&33
&花药狭长卵形!
长
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&花柱长
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每室具胚珠


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个长角果长
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!宽
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光滑无毛种子淡褐色!长圆形!长
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!宽
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!无翅花期
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(
月!果期
(

*
月
裸茎碎米荠是中国特有一种药用植物!生长在海拔
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!1""3
的灌木丛和潮湿地带分布于河
北*内蒙古*陕西*山西和四川
!图文由西北农林科技大学资环学院朱仁斌提供"
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西
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北
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植
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物
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