全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 45(5): 449 ̄454(2015)
收稿日期: 2014 ̄06 ̄28ꎻ 修回日期: 2015 ̄05 ̄24
基金项目: 广东省现代农业产业技术体系创新团队专项ꎻ 广州市科技计划项目(2013J4100070ꎻ 2013J4500032)
通讯作者: 何自福ꎬ 研究员ꎬ 博士ꎬ 主要从事蔬菜病理学研究ꎻ E ̄mail: hezf@gdppri.com
第一作者: 佘小漫ꎬ女ꎬ 硕士ꎬ 主要从事植物病原细菌学研究ꎮ
doi:10.13926 / j.cnki.apps.2015.05.001
广东马铃薯黑胫病的病原鉴定
佘小漫1ꎬ2ꎬ 蓝国兵1ꎬ 何自福1∗ꎬ 汤亚飞1ꎬ 杜振国1ꎬ 罗方芳1
( 1广东省农业科学院植物保护研究所ꎬ广州 510640ꎻ 2 广东省植物保护新技术重点实验室ꎬ广州 510640)
摘要:通过对分离自马铃薯黑胫病的病原菌在选择性 CVP培养基上菌落形态观察、致病性测定及 16S rDNA 序列比较ꎬ鉴
定出引起广东省冬种马铃薯黑胫病的病原为 γ ̄变形菌门肠杆菌科果胶杆菌属黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atroseptic ̄
um)ꎮ 生理生化试验表明ꎬ该病原菌菌株不能在 37℃生长ꎬ能使明胶液化ꎬ具有运动性、耐盐性(5%NaCl)ꎬ对红霉素不敏
感ꎻ过氧化氢酶和蔗糖还原试验反应均为阳性ꎬ氧化酶、吲哚产生和磷酸酶活性试验均为阴性ꎻ可利用乳糖、麦芽糖、棉籽
糖、蜜二糖、纤维二糖、柠檬酸盐和 α ̄甲基酮葡萄糖苷ꎬ不能利用山梨醇、d ̄阿拉伯糖和丙二酸盐ꎮ 研究结果可为广东冬种
马铃薯黑胫病的综合防治提供科学依据ꎮ
关键词:马铃薯黑胫病ꎻ 黑腐果胶杆菌ꎻ 病原鉴定ꎻ 生理生化特征
Identification of the pathogen of potato blackleg disease in Guangdong SHE
Xiao ̄man1ꎬ2ꎬ LAN Guo ̄bing1ꎬ HE Zi ̄fu1∗ꎬ TANG Ya ̄fei1ꎬ DU Zhen ̄guo1ꎬ LUO Fang ̄fang1 ( 1 Plant
Protection Research Instituteꎬ Guangdong Academy of Agricultural Sciencesꎬ Guangzhou 510640ꎬ Chinaꎻ 2Guangdong Provincial
Key Laboratory of High Technology for Plant Protectionꎬ Guangzhou 501640ꎬ China)
Abstract: Based on the colony morphology on CVP mediumꎬ pathogenicity test and 16S rDNA sequence
comparisonꎬ the pathogen causing potato blackleg disease in the winter potato growing areas in Guangdong was
identified as Pectobacterium atrosepticum and belonged to Gamma ̄proteobacteriaꎬ Enterobacteriaceaeꎬ
Pectobacterium. The physiological and biochemical tests showed that the bacterium could not grow at 37℃ꎬ
could cause gelatin liquefactionꎬ had move ability and the tolerance to salt (in 5% NaCl)ꎬ and had no sensitivity
to erythromycin. The bacterium also gave a positive reaction for catalase and production of reducing substances
from sucroseꎬ but gave a negative reaction for oxidaseꎬ production of indole and phosphatase. The bacterium
could utilize lactoseꎬ maltoseꎬ raffinoseꎬ melibioseꎬ cellobioseꎬ citrate and α ̄methyl glucosideꎬ but not
d ̄arabitolꎬ sorbitol or malonate. These results provide scientific basis for the integrated control of potato blackleg
disease.
Key words: Potato blackleg diseaseꎻ Pectobacterium atrosepticumꎻ pathogen identificationꎻ physiological
and biochemical characteristics
中图分类号: S432.42 文献标识码: A 文章编号: 0412 ̄0914(2015)05 ̄0449 ̄06
由黑腐果胶杆菌 Pectobacterium atroseptic ̄
um[1](先前称之为胡萝卜欧文氏菌黑腐亚种ꎬ
Erwinia carotovora subsp. atroseptica[2] )侵染引起
的黑胫病是马铃薯生产的重要病害之一ꎮ 该病原
菌除了能引起采收后马铃薯块茎的软腐外ꎬ还能潜
伏在种薯中引起田间马铃薯植株发病[3]ꎮ 马铃薯
黑胫病田间症状表现为植株矮化、叶片黄化、萎蔫ꎬ
由茎基部开始向上变黑软腐ꎬ发病后期茎秆中空ꎬ
植物病理学报 45卷
最终导致植株死亡[3]ꎮ
近年来ꎬ广东省冬种马铃薯发展较快ꎬ种植面
积逐年增加ꎮ 据统计ꎬ2010 年广东省冬种马铃薯
面积已达 6.7万 hm2ꎮ 2008年ꎬ江门冬种马铃薯田
零星发生黑胫病ꎻ2012年ꎬ惠州市惠东县和广州市
白云区冬种马铃薯产区黑胫病发生严重ꎬ田间病株
率达 20%ꎻ2013年ꎬ广州市增城区小楼镇冬种马铃
薯产区亦发生马铃薯黑胫病ꎮ 黑胫病在广东冬种
马铃薯产区有逐年蔓延扩展趋势ꎮ 本文对引起广
东省马铃薯黑胫病的病原菌进行鉴定ꎬ并对病原菌
的生物学特性进行研究ꎬ以期明确广东马铃薯黑胫
病的病原ꎬ为该病害的防治提供科学依据ꎮ
1 材料与方法
1.1 病样采集及培养基
马铃薯黑胫病病株采集自广东省惠州市惠东
县铁涌镇及广州市白云区钟落潭镇的冬种马铃薯
生产田ꎮ
CVP 选择性培养基[4]:蛋白胨 1 g、柠檬酸三
钠 5 g、硝酸钠 2 g、10% 二水氯化钙溶液 10.2 mL、
0.075% 结晶紫溶液 2 mL、5 mol / L 氢氧化钠溶液
2.6 mL、琼脂粉 4 g、聚果胶酸钠 18 gꎬ用去离子水
混合配制 1 000 mLꎮ
LB 培养基:胰蛋白胨 1 g、酵母提取物 0.5 g、
氯化钠 1 g、琼脂粉 1. 5 gꎬ用去离子水混合配制
1 000 mLꎮ
1.2 病原菌分离
采用常规组织分离方法分离病原菌ꎮ 切取病
茎组织大小约 0.5 mm × 0.5 mmꎬ在 75%乙醇和
0.1%升汞溶液各表面消毒 1 minꎬ用无菌水清洗 3
次后用灭菌吸水纸吸干水分ꎮ 将消毒后的病组织
放在洁净无菌的培养皿中ꎬ加入 800 μL无菌水ꎬ将
组织捣碎后静置 10 minꎮ 用接种环蘸悬浮液在
CVP选择性培养基平板上划线ꎬ25℃ ~ 28℃培养
48 hꎮ 挑取 CVP 平板上的单菌落在 LB 平板上划
线ꎬ26℃培养 48 hꎬ挑取单菌落保存ꎮ
1.3 致病性测定
1.3.1 接种马铃薯植株 随机取保存的 10 个菌
株ꎬ在 LB培养基平板上划线ꎬ26℃培养 48 h后ꎬ挑
取单菌落接种到 LB 液体培养基ꎬ26℃培养过夜ꎮ
菌液经 5 000 rpm离心 10 min收集菌体ꎬ用无菌水
配制成浓度为 1×108 CFU / mL 悬浮液ꎮ 用无菌接
种针注射接种 4 ~ 6 叶期健康马铃薯植株茎基部ꎬ
接种菌液量为 1 mL /株ꎬ每个菌株接种 15 株马铃
薯ꎮ 以注射接种 LB 液体培养基和清水作为对照ꎮ
接种后植株置于大棚中ꎬ昼夜温度 16℃ ~ 21℃ꎬ 湿
度 65%~85%ꎮ 每天观察与调查接种马铃薯植株的
发病情况ꎮ 调查结束后ꎬ从病株上再分离病原菌ꎮ
1.3.2 组织浸解 马铃薯块茎用 5%的次氯酸钠
浸泡表面消毒 10 minꎬ重复 3 次ꎬ然后自然干燥ꎮ
将消毒的马铃薯块茎纵横各一刀ꎬ然后分别用细菌
悬浮液注射接种这些块茎组织ꎬ接种浓度为 1×108
CFU / mLꎬ接种细菌悬浮液量为 0.1 ~ 0.2 mLꎮ 以
注射 LB液体培养基和清水作为对照ꎮ 试验重复 3
次ꎮ 在 26℃下培养 24~48 hꎬ然后观察马铃薯块茎
组织是否有腐烂或者发生浸解ꎮ
1.4 病原细菌形态观察
采用 2.5%戊二醛、1%锇酸双固定方法处理细
菌样品[5]ꎬ扫描电镜(JEM-6360型)观察细菌的形
态ꎬ并随机测定 20个菌体的大小ꎮ
1.5 病原细菌分子生物学鉴定
1.5.1 16S rDNA 序列分析 应用细菌通用引物
扩增病原细菌的 16S rDNA 基因ꎬ引物序列为 27f
(5′ ̄AGAGTTTGATCGGCTCAG ̄3′)和 1541r ( 5′ ̄
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA ̄3′) [6]ꎮ PCR 反
应体系为 Premix Ex Tag 25 μLꎬDNA 模板 50 ngꎬ
引物 27f和 1541r各 6 pmolꎬ加灭菌的双蒸水至 50
μLꎮ 反应程序:96℃预变性 5 minꎻ94℃ 1 minꎬ
50℃ 1 minꎬ72℃ 3 minꎬ35 个循环ꎻ72℃ 延伸 10
minꎮ 对 PCR产物进行测序ꎬ利用 NCBI中 BLAST
程序进行序列同源性搜索与比较ꎮ
1.5.2 特异性 PCR检测 利用胡萝卜软腐欧文氏
黑腐亚种的特异引物 Y45 ( 5′ ̄TCACCGGACGC ̄
CGAACTGTGGCGT ̄3′)和 Y46(5′ ̄TCGCCAACG
TTCAGCAGAACAAGT ̄3′) [7]对病原菌分离物的
基因组 DNA 进行 PCR 检测ꎮ PCR 反应体系为
Premix Ex Tag 25 μLꎬDNA 模板 50 ngꎬ引物 Y45
和 Y46各 6 pmolꎬ加灭菌的双蒸水至 50 μLꎮ 反应
程序:96℃预变性 4 minꎻ94℃ 1 minꎬ52℃ 1 minꎬ
72℃ 1 minꎬ 35 个循环ꎻ 72℃ 延伸 10 minꎮ 取
10 μL PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶中电泳ꎮ
054
5期 佘小漫ꎬ等:广东马铃薯黑胫病的病原鉴定
Fig. 1 Morphology of the pathogen on CVP(A) and LB (B)medium
1.6 生理生化反应测定
参照«植病研究方法»[8]、«植物病原细菌鉴定试
验指导»(第 3版)[9]和«胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐致
病亚种定量与鉴定手册»[10]ꎬ观察病原菌在 37℃条件
下以及 5%NaCl溶液中的生长情况ꎬ测定病原细菌的
过氧化氢酶反应、氧化酶反应、运动性、明胶液化、蔗
糖还原、磷酸酶活性、对红霉素的敏感性、吲哚产物、
碳水化合物产酸以及有机盐产酸等情况ꎮ
2 结果与分析
2.1 病原菌分离与形态特征
显微镜下及肉眼均可见马铃薯病茎组织的切
口处有大量细菌喷出呈雾状ꎮ 在选择性 CVP培养
基平板上形成大小不一、浅凹陷、深紫色的菌落
(图 1 ̄A)ꎬ在 LB培养基平板上菌落乳白色、圆形、
光滑、边缘整齐、隆起、黏稠(图 1 ̄B)ꎮ
2.2 致病性测定结果
2.2.1 回接马铃薯植株 取纯化保存的 10 个菌
株ꎬ分别回接 4 ~ 6 叶期健康的马铃薯植株ꎮ 26℃
条件下ꎬ接种 24 h后ꎬ植株茎基部即开始出现褐色
斑点ꎮ 随着时间的推移ꎬ病株症状逐渐加重ꎮ 72 h
后病株茎基部完全变黑ꎬ植株倒伏ꎬ与田间黑胫病
症状表现一致(图 2)ꎮ 10 个菌株对马铃薯均具有
强致病力ꎬ接种各处理的病株率均为 100%ꎮ 从接
种发病株中均可再分离到该病原菌ꎮ 结果表明ꎬ分
离获得的细菌即是引起马铃薯黑胫病的病原菌ꎮ
2.2.2 组织浸解测定 将注射接种的马铃薯块茎
组织放置 26℃培养 24 h后ꎬ接种点周围组织变软ꎬ
Fig. 2 Symptoms of potato blackleg disease
in fields(A)and the inoculated potato
plants in incubator(B)
48 h 后呈现大面积水浸软腐症状ꎬ而对照马铃薯
块茎组织未出现水浸软腐症状ꎮ 该结果说明:分离
获得的病原细菌对马铃薯有浸解能力ꎮ
2.3 病原细菌的形态特征
扫描电镜观察结果(图 3)显示ꎬ菌体为短杆
状ꎬ两端钝圆ꎮ 随机测量 20 个菌体ꎬ平均长为
1.198 μm (1.058~1.338 μmꎬSE=0.14)ꎬ平均宽为
0.466 μm (0.437~0.495 μmꎬSE=0.029)ꎮ
154
植物病理学报 45卷
Fig. 3 Shape of the pathogen bacteria infec ̄
ting potato under scan electron mi ̄
croscopy(Model JEM ̄6360)
2.4 病原菌分子生物学鉴定结果
2.4.1 16S rDNA序列比较 应用细菌 16S rDNA
通用引物 27f和 1541rꎬ从 10个分离菌株中均能扩
增出约 1 400 bp特异性片段ꎮ 序列测定结果表明ꎬ
10个菌株 16S rDNA 近全长均为 1 434 bp(Gen ̄
Bank登录号:KC695819 ~ KC695828)ꎬ序列间同
源率为 100%ꎮ BLAST 结果显示ꎬ这 10 个序列与
Pectobacterium atrosepticum CFBP 1526 (GenBank
登录号:JN600332) 16S rDNA 的同源率为 100%ꎮ
这些结果说明ꎬ引起广东马铃薯黑胫病的病原菌为
黑腐果胶杆菌ꎮ
2.4.2 病原菌特异分子鉴定 用胡萝卜欧文氏菌
黑腐亚种特异引物 Y45 / Y46 对 10 个菌株进行
PCR检测ꎬ结果显示ꎬ从这些菌株的 DNA 中均能
扩增出大小约 440 bp左右的特异条带(图 4)ꎮ 该
结果进一步支持引起广东马铃薯黑胫病的病原菌
为黑腐果胶杆菌ꎮ
2.5 生理生化反应测定
10个菌株均不能在 37℃生长ꎬ具有运动性、耐
盐性(5%NaCl)ꎬ对红霉素不敏感ꎬ能使明胶液化ꎬ
过氧化氢酶和蔗糖还原试验反应均为阳性ꎬ氧化
酶、吲哚产生和磷酸酶活性试验均为阴性ꎮ 可以利
用乳糖、麦芽糖、棉籽糖、蜜二糖、纤维二糖、柠檬酸
盐和 α ̄甲基酮葡萄糖苷ꎻ不能利用山梨醇、d ̄阿拉
伯糖和丙二酸盐(表 1)ꎮ 这些结果与报道的黑腐
果胶杆菌(即胡萝卜欧文氏菌黑腐亚种)特征均相
吻合[10]ꎮ
3 结论与讨论
马铃薯黑胫病是马铃薯生产上重要病害之一ꎬ
近年来由于广东不断扩大冬种马铃薯生产规模ꎬ黑
胫病在广东发生范围也在扩展蔓延ꎮ 通过对广东
省广州市和惠州市马铃薯黑胫病的病原菌分离、选
择性培养基平板形态观察、致病性测定及 16S rD ̄
NA基因序列比较ꎬ明确引起广东省马铃薯黑胫病
的病原为变形菌门肠杆菌科黑腐果胶杆菌 Pecto ̄
bacterium atrosepticum ( Erwinia carotovora subsp.
atroseptica)ꎮ 进一步测定该病原细菌的生理生化
特征ꎬ包括过氧化氢酶和氧化酶产生、运动性、明胶
液化、蔗糖还原、磷酸酶活性、对红霉素的敏感性、吲
哚产物、碳水化合物产酸、有机盐产酸、37℃及 5%
NaCl溶液中的生长情况ꎬ其与已报道的胡萝卜欧文
氏菌黑腐亚种ꎬ即黑腐果胶杆菌特征完全一致ꎮ
Fig. 4 Detection of the pathogenic bacteria using specific primers
Y45 and Y46 of Pectobacterium atrosepticum
254
5期 佘小漫ꎬ等:广东马铃薯黑胫病的病原鉴定
Table 1 The results of physiological and biochemical tests for ten strains
isolated from the diseased potato in Guangdong
Test 10 strains in the study Pectobacterium atrosepticum[10]
Cavity formation on CVP medium + +
Growth on NA at 37℃ - -
Move ability + +
Gelatin liquefaction + +
Growth in 5% NaCl + +
Sensitivity to erythromycin - -
Production of reducing substances from sucrose + +
Production of indole - -
Phosphatase - -
Catalase + +
Oxidase - -
Acid production from
lactose + +
maltose + +
α ̄methyl glucoside + +
cellobiose + +
sorbitol - -
raffinose + +
melibiose + +
d ̄arabitol - -
Utilization of organic acids
citrate + +
malonate - -
应用扫描电镜ꎬ本研究首次观察了引起广东省
马铃薯黑胫病病原细菌的形态特征为短杆状ꎬ两端
钝圆ꎬ长(1. 058 ~ 1. 338) μmꎬ宽(0. 437 ~ 0. 495)
μmꎮ
根据文献ꎬ引起马铃薯黑胫病的病原除了黑腐
果胶杆菌外ꎬ在一定的环境条件下ꎬDickeya spp.
(Erwinia chrysanthemi or Pectobacterium chrysan ̄
themi) [11]、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pec ̄
tobacterium carotovorum subsp. carotovorum) [1]和
胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种 ( Pectobacterium
carotovorum subsp. brasiliensis) [12]也可侵染马铃
薯引起类似黑胫病的症状ꎮ 一般认为ꎬ温带气候地
区马铃薯黑胫病的病原多以黑腐果胶杆菌为主ꎬ辅
之胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种[3ꎬ13]ꎻDickeya
spp.则是热带亚热带马铃薯黑胫病的主要病原[14]ꎻ
胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种仅在亚热带地区发
生过[15ꎬ16]ꎮ
我国马铃薯种植范围广ꎬ横跨温带、亚热带和
热带ꎬ而黑胫病在我国的黑龙江、内蒙古、甘肃及广
西等省(自治区)马铃薯产区均有发生[17]ꎮ Wang
等[18]报道内蒙古自治区马铃薯黑胫病的病原为胡
萝卜欧文氏菌黑腐亚种ꎮ 本研究从广东省惠州市
惠东县、广州市白云区和增城区、江门市马铃薯产
区的马铃薯黑胫病样中均分离到黑腐果胶杆菌ꎮ
另外ꎬ在广东省惠州市惠东县马铃薯黑胫病样中也
曾分离到胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种ꎬ用该亚
种菌株接种马铃薯植株亦能引起植株茎基部黑腐
症状ꎬ但接种马铃薯植株的茎基部变黑程度轻ꎬ与
田间马铃薯黑胫病发生症状有差异ꎬ并且胡萝卜软
腐果胶杆菌胡萝卜亚种菌株只占分离菌株的 5%ꎮ
因此ꎬ引起广东省马铃薯黑胫病的病原主要是黑腐
果胶杆菌ꎮ 关于黑腐果胶杆菌与胡萝卜软腐果胶
杆菌胡萝卜亚种二者在广东冬种马铃薯产区的分
布、扩散及复合侵染等有待于进一步研究ꎮ
354
植物病理学报 45卷
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责任编辑:于金枝
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