全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金项目"
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#
作者简介$王
!
芳"
#01#
#!女!博士!实验师!主要从事植物分子生物学研究
2(34-5
$
64/
7
8
!
34-5+9:4;+<=;+>/
"
通信作者$刘克德!教授!主要从事作物生物技术研究
2(34-5
$
?=5-;
!
34-5+9:4;+<=;+>/
!#1$23$2
共抑制植株死亡茎段的
显微和超微结构观察
王
!
芳!刘
!
超 !刘克德"
"华中农业大学 作物遗传改良国家重点实验室!武汉
$%""&"
#
摘
!
要$采用树脂包埋技术!以
!"#$%&!%
共抑制植株死亡发生茎段为实验材料!制备半薄切片和超薄切片!观察突
变体茎段死亡的细胞学特征结果表明$"
#
#共抑制植株茎细胞的死亡首先在表皮细胞层中发现!然后向切片圆周
两侧以及内侧细胞蔓延"
!
#共抑制植株茎细胞出现染色质边缘化(叶绿体内囊体片层膜数目减少(细胞器成分被
液泡吞噬等异常现象这些细胞学特征暗示共抑制植株茎段发生了细胞程序性死亡!由此推断
!"#$%&
基因对拟
南芥茎顶端细胞的生长有重要的维持作用
关键词$拟南芥&
@AB4CD!C
&死亡发生茎段&细胞程序性死亡
中图分类号$
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&
E!))
文献标志码$
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7
Q433<=><5=<4A9
"
YMD
#
!!
细胞程序性死亡 "
R
QN
7
Q433<=><5 =<4A9
!
YMD
#是由基因调控的主动的(有序的死亡方式!它
是生物体中广泛存在的一种自我调节和平衡机制!
是生命活动的重要组成部分植物在生长发育如胚
胎的发育)#*(茎的维管组织分化)!*(花的形成)%*(叶
片的衰老)$*等过程中都伴随着
YMD
的发生&另外!
在病原菌浸染)*和逆境胁迫条件下)*(&*也会发生
YMD
!以适应外界环境的变化细胞凋亡和自我吞
噬是
YMD
的两种主要细胞学形式凋亡性
YMD
在
动物细胞中发生频率高!它以染色质凝聚和边缘化(
DG@
裂解片段化以及凋亡小体的形成为主要生化
特征)1*而植物由于细胞壁的限制阻碍了周缘细胞
对凋亡小体的吸收!因此多数植物中发生的
YMD
往
往呈现出自噬的细胞学特征!表现为液泡的增大!液
泡对细胞器的吸收和裂解!液泡的降解等!最终引起
细胞的死亡)0*发生自噬细胞的有效成分被降解
后!可以运输到其它细胞加以循环利用!因此自噬性
YMD
是多细胞生物体在营养匮乏的逆境条件下!为
维持基本的生命活动而采取的自我保护行为!如拟
南芥的悬浮细胞生长在蔗糖缺乏的培养基条件下出
现自噬性细胞死亡现象)#"*
囊泡运输是真核生物细胞物质运输的一种重要
途径
B4C
类小
H
蛋白家族成员通过与
HDY
或
HUY
的结合!在活性与非活性形式之间转换!调节
不同细胞器间的囊泡运输过程!如
B4C#
亚家族蛋
白主要调控从内质网到高尔基体的囊泡运输过
程)##*
@AB4CD!C
是拟南芥
B4CD
亚家族蛋白的一
个成员在前期研究中!组成性激活形式的
@AB4(
CD!C
)
E*&J
*转化野生型拟南芥后获得了
!"#$%&!%
的共抑制突变体植株该突变体中
!"#$%&!%
以及
它的其它两个
B4C#
同源基因
!"#$%&!0
和
!"#$1
%&#
的表达都有所下降!共抑制突变体主茎或侧枝
在抽出后出现茎顶端死亡现象)#!*为了研究茎段
死亡产生的细胞学机制!我们通过光学显微镜和透
射电镜分别观察了死亡部位的细胞学特征!证实了
!"#$%&!%
(
!"#$%&!0
和
!"#$%&#
三个同源基因
的下调表达引起了茎顶端细胞的程序性死亡现象!
为进一步深入研究
@AB4CD!C
的功能奠定基础
#
!
材料和方法
?+?
!
实验材料
野生型拟南芥"
MN5;3C-4
型#植株和
!"#$%&!%
共抑制突变体的种子点播在含蛭石和腐植土"
#Z#
#
的营养土中!置于
!"[
(
#*9
%
19
光周期(
#)"
"
3N5
+
3
!
+
.
#的培养箱中萌发并生长
?+$
!
茎半薄切片的制备及光学显微镜观察
将切取的拟南芥茎段放入
I@@
固定液"每
#""
3J
溶液含
)3J
福尔马林!
)3J
冰醋酸!
0"3J
&"乙醇#后抽真空!常温固定
!$9
&在梯度浓度乙
醇溶液中"
&"乙醇!
9
&
1)乙醇!
9
&无水乙醇!
过夜&无水乙醇!
#9
#进行脱水处理&随后将材料换
入预渗透液)渗透液
Z
无水乙醇
]#Z#
"
2
%
2
#*中静
置或者缓慢摇动
#
#
!9
&换入渗透液"
#""3JU<(
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树脂中加入
#
7
T4Q=$
#渗透
!9
&
取出材料置于
YMB
管底!加入包埋剂)渗透液
Z
T4Q=%
]#)Z#
"
2
%
2
#*进行包埋!在包埋剂凝固
前!将材料按照合适的位置放好!
1[
烘箱过夜放
置&然后转入
%&[
烘箱烘干后备用
取出包埋块!用切片机"
J<->4LM*;5AQ43->(
QNAN3<
#进行切片!切片厚度为
!
"
3
&用
"+")的
甲苯胺蓝染液滴染色&中性树胶封片后在光学显微
镜"
G-?N/2>5-
R
.<1"-3->QN.>N
R
<
#下观察并照相
?+@
!
超薄切片制备及透射电镜观察
将选取茎段在
!+)戊二醛"
R
T]&+$
#中前固
定
%9
后置于
$[
过夜&磷酸缓冲液"
"+#3N5
%
J
!
R
T&+%
#洗涤
%
次!每次
#)3-/
&
!锇酸固定液室
温后固定
#!9
&然后用梯度浓度的丙酮溶液"
%"(
)"(
&"(
0"(
0)和
#""#进行脱水&将脱水
后的样品用梯度浓度)
%Z#
(
#Z#
(
#Z%
"
2
%
2
#*的丙
酮%
XYK(Y^ G1#!
树脂依次进行渗透!最后用
#""的
XYK(Y^ G1#!
树脂包埋&超薄切片机"
J<->4LM*
;5AQ43->QNAN3<
#进行切片!厚度在
1"
#
0"/3
&切片
用柠檬酸铅"每
)"3J
双蒸水溶液含
#+%%
7
硝酸铅
和
#+&*
7
柠檬酸三钠#染色
%"3-/
后!用双蒸水清洗
%
次!然后用
!乙酸铀酰"
3
%
2
#染色
%"3-/
!再用双
蒸水清洗
%
次&在透射电镜"
T-A4>9-T(&*)"AQ4/.3-.(
.-N/<5<>AQN/3->QN.>N
R
<
#下进行观察并照相
!
!
结果与分析
$A?
!
!#1$23$2
共抑制植株中死亡发生茎段的显
微结构观察
与野生型植株的茎发育"图版
$
!
#
#不同!共抑
制植株的主茎或侧枝在抽出后生长大约
!
#
)=
期
间!茎尖由绿变紫"图版
$
!#!并随着茎的伸长!紫
色向茎尖下部蔓延!而后紫色枝条部分逐渐坏死萎
蔫"图版
$
!
%
#!因此茎尖部分由绿变紫可能是茎段
坏死的前兆为了在细胞学水平研究茎段坏死的机
制!我们切取了野生型植株的正常茎段茎尖下方约
"+)>3
长部分(共抑制植株的紫色茎段和已坏死茎
段的相同方位部分"图版
$
!
$
#!用树脂包埋后制备
了连续的半薄切片从茎段下部到上部的连续切片
中!分别选取部分切片在光学显微镜下进行观察
野生型植株茎切片的细胞形态表现正常一致!无细
胞死亡等形态的改变"图版
$
!
)
(
*
#&共抑制植株紫
色茎段从下向上的茎切片中出现了细胞不同程度死
亡的表型"图版
$
!
&
#
##
#在茎段下部的切片中!
1
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表皮细胞层首先出现一些死亡细胞!它们比周围细
胞的溴酚蓝染色加深&细胞外围皱缩!其它部位的细
胞形态相对正常"图版
$
!
1
(
0
#茎段中部切片的死
亡细胞面积扩大!死亡由表皮细胞逐渐向两侧的表
皮细胞以及内侧的皮层细胞蔓延&中部的髓细胞形
态也发生了较大的改变!细胞形状由圆型变为椭圆
或不规则的锯齿状!细胞之间的间隙明显增大"图版
$
!
#"
#在茎段上部切片中!大部分细胞染色较深!
细胞形态极度不规则!呈现死亡状态"图版
$
!
##
#
共抑制植株完全死亡茎段的切片细胞则极端皱缩和
不规则!呈现出完全的坏死萎蔫表型"图版
$
!
#!
#
这些光学显微观察结果表明共抑制植株中茎细胞的
死亡发生在茎段出现紫色表型时!而且随着茎的生
长!细胞死亡向上推进死亡首先在表皮细胞层发
现!然后以辐射状沿两侧和内侧蔓延
$A$
!
!#1$23$2
共抑制植株中死亡发生茎段细胞
的超微结构观察
为了更加详细地研究细胞死亡过程中细胞器的
变化!选取共抑制植株紫色部分茎段和野生型植株
中相同部位的茎段分别制备超薄切片!并在超微电
镜下观察切片细胞的形态野生型植株茎段切面上
的大部分细胞具有正常的结构!如有一个大的液泡
或者一些小的分散液泡&一个圆形或椭圆形的细胞
核!许多排列完整(发育良好的细胞器如叶绿体(线
粒体(内质网和高尔基体等均匀散布在细胞中"图版
%
!
#
#共抑制突变体的茎段切面细胞的细胞器形
态发生了不同程度的变化"图版
%
!
#
#!
#!分别处
于细胞死亡过程的不同阶段主要的差异表现在以
下几个方面$
$+$+?
!
细胞核染色质形态的变化
!
突变体相对野
生型细胞!染色质发生凝聚并紧贴在细胞核的核膜
上而产生边缘化现象"图版
%
!#&随后!染色质边缘
化程度加深!部分细胞核膜消失!形成缺口"图版
%
!
%
#&细胞死亡后期!细胞内所有成分降解"图版
%
!
#!
#
$+$+$
!
叶绿体细胞器形态的变化
!
野生型植株细
胞叶绿体呈现规则的椭圆形!并且有排列整齐且较
多的内囊体片层膜"图版
%
!
#
#而突变体中大部分
细胞的叶绿体呈现出近似圆形或葫芦形状!叶绿体
内部内囊体片层膜数目明显减少!而且排列不规则
"图版
%
!
$
(
)
#&叶绿体的淀粉粒大而多!有的叶绿体
几乎全部充满了淀粉粒"图版
%
!
$
#
$+$+@
!
吞噬现象的发生
!
在突变体细胞行使死亡
过程的不同阶段!还观察到了细胞器成分被液泡吞
噬的现象图版
%
!
*
#
##
显示了细胞器被逐渐吞
噬的过程在最初的吞噬阶段!一部分液泡膜出现
内陷"图版
%
!
*
#或者细胞器膜突出后向液泡内部凹
陷"图版
%
!
&
#&随后!液泡膜进一步向内凹陷!同时
叶绿体和线粒体等细胞器和一些小的囊泡等细胞学
成分出现在凹陷的液泡膜周围"图版
%
!
1
(
0
#!并逐
步向凹陷部位推进"图版
%
!
#"
#&最后细胞器被完全
包裹在液泡中!此时液泡几乎充斥整个细胞!细胞质
其他成分被压缩在一个小范围内"图版
%
!
##
#吞
噬的细胞成分最终被消化!液泡也随之消失!细胞膜
破裂!导致细胞死亡"图版
%
!
#!
#
%
!
讨
!
论
本研究中!
!"#$%&!%
基因共抑制植株所观察
到的死亡表型发生在特定的时期!基本都是在主茎
抽出后继续生长的
!
#
$=
内!这段时间是茎的快速
生长阶段!也是大量需要养分的时期&同时!死亡也
发生在特定的部位!即茎尖下部的紫色区段!说明茎
段上部的死亡过程是主动有序的光学显微镜观察
结果进一步在细胞学层面上证实了茎段细胞死亡的
有序性!死亡起始于茎细胞最外层的表皮细胞!而后
有序地向切面内部蔓延透射电镜结果则显示了细
胞死亡的过程!其中细胞核染色质的凝聚和边缘化!
是细胞凋亡的一个重要特征)1*&同时观察到的液泡
对细胞器成分的吸收和消化!以及液泡的裂解等细
胞学特征符合细胞自噬的过程)0*而凋亡和自噬是
细胞程序性死亡的两种主要形式!因此该突变体中
的茎段上部细胞死亡过程属于细胞程序性死亡
透射电镜结果显示突变体细胞中叶绿体细胞器
的发育受到影响!如减少的内囊体片层膜!增大的淀
粉粒等内囊体片层膜的形成包括了许多细胞学过
程!如脂质的合成(片层膜的形成(蛋白的合成以及
蛋白的运输和转运等)#%*多数情况下!叶绿体膜蛋
白的合成在细胞质中完成!通过叶绿体定位的信号
肽转运到目的位点)#$*但是目前的研究表明也有
一些叶绿体膜蛋白的转运与从内质网到高尔基体的
运输途径有关)#)(#**!即由
!"#$%&
基因参与调控的
囊泡运输过程我们根据这一现象推断!共抑制突
变体中
%
个同源基因
!"#$%&!%
(
!"#$%&!0
和
!"1
#$%&#
的下调表达可能造成了叶绿体一些特定蛋
白的转运缺陷!从而产生了叶绿体细胞器内囊体片
层膜的发育缺陷
本研究中透射电镜结果显示在液泡对细胞器成
分进行吞噬之前!叶绿体细胞器形态已经发生改变!
0
#
期
!!!!!!!!!!!
王
!
芳!等$
!"#$%&!%
共抑制植株死亡茎段的显微和超微结构观察
而叶绿体内囊体片层膜是光合作用的位点!片层膜
结构的缺陷会导致光合作用减弱!与肉眼观察到的
茎段变紫相关联光合作用减弱将引起细胞营养成
分的缺乏)#&*吞噬是程序性细胞死亡的一种方式!
是细胞对营养缺乏产生的适应性反应)#1(#0*因此!
本研究观察到茎顶端组织的细胞出现了吞噬现象!
随后细胞死亡!产生茎顶端死亡的表型同时我们
还观察到
!"#$%&!%
共抑制植株出现侧枝增多!植
株丛生的现象)#!*!可能也是由于死亡茎段的营养成
分向其它侧枝不断输送的结果
总之!本研究通过对
!"#$%&!%
共抑制植株坏
死茎段的显微和超微结构观察!证实了
!"#$%&!%
(
!"#$%&!0
和
!"#$%&#
的下调表达可能影响了细
胞叶绿体的正常发育!并引发了液泡的吞噬过程!最
终导致细胞发生了程序性死亡!由此推断
!"#$%&
基因对植物茎顶端细胞的生长有重要的维持作用
这些研究结果将为深入研究
!"#$%&
基因在植物体
内的作用机制奠定基础
参考文献!
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图版
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野生型植株和
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共抑制植株上部茎段的显微结构观察
标尺
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皮层&
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Y+
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野生型植株的正常茎段&
!
(
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箭头指向共抑制植株上部死亡茎段&
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双向箭头指向茎段半薄切片取样区域&
)+
野生型茎段半薄切片&
*+
图
)
中局部图片的放大&
#
##+
共抑制植株死亡发生茎段由下部向上部的半薄切片!呈现逐步推进的细胞死亡状态!其中图
0
为图
1
中局部图
片的放大&
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共抑制植株完全死亡茎段的切片细胞形态
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芳!等$
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共抑制植株死亡茎段的显微和超微结构观察
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图版
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野生型植株和
!"#$%&!%
共抑制植株茎段细胞的超微结构观察
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G+
细胞核&
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野生型植株细胞核呈现正常形态&
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(
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共抑制植株细胞核呈现异常形态$
!+
染色质发生边缘化现象&
%+
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头所指#&
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共抑制植株的叶绿体形态&
*
#
#!+!"#$%&!%
共抑制植株死亡发生茎段出现细胞自噬现象$
*+
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指#出现轻微内陷&
+
叶绿体膜"箭头所指#向液泡内陷&
1
(
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叶绿体"
1
箭头所指#(线粒体"
0
中箭头所指#细胞器出现在凹陷的液泡膜周围&
#"+
叶绿体向液泡膜凹陷部位推进&
##+
叶绿体细胞器被完全包裹在液泡内&
#!+
液泡消失!细胞死亡
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