全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$兵团博士资金专项"
!"#%11""%
#&石河子大学高层次人才启动项目"
2345!"#!#6
#
作者简介$张新宇"
#(,6
#!男!在读博士研究生!助理研究员!主要从事棉花遗传育种及功能功能基因组学研究
7)89.:
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通信作者$刘永昌!博士!副教授!主要从事棉花遗传育种及棉花功能基因组学研究
7)89.:
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盐胁迫对拟南芥
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基因的
诱导表达及其启动子分析
张新宇#!赵兰杰!!李艳军#!孙
!
杰#!刘永昌#"
"
#
石河子大学 农学院%新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室!新疆石河子
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石河子大学 生命科学学院!新疆石
河子
6%!"""
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摘
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要$用
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EF93:
处理拟南芥幼苗!分别于处理后
"
(
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(
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6
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(
!$
(
$6<
通过
FCGH<@G01:CH
检测其
!"#$%#6
基因的表达量结果显示$拟南芥
!"#$%#6
基因的表达量受高盐胁迫的诱导而升高!于处理后
$<
表达
量达到最高!处理后
#*<
表达量最低采用
I32
技术克隆
!"#$%#6
的启动子!序列为
#(,$J
K
&序列分析发现启
动子内含有大量与非生物胁迫相关的顺式作用元件!如
LM7
(
EN2
(
O1M
及
P127
&将启动子克隆到表达载体
K
398J.9#%"")!!#)QRM
中!驱动报告基因
&$
表达组织化学染色结果表明!未经过高盐处理的幼苗中
&$
基
因表达水平很低&
%""88C:
%
EF93:
处理后
&$
基因表达量显著升高研究表明!
!"#$%#6
的表达受高盐胁迫诱
导!且
!"#$%#6
基因的启动子是一个盐胁迫诱导型启动子
关键词$拟南芥&盐胁迫&
!"#$%#6
基因&启动子
中图分类号$
S,6*
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S,6(
文献标志码$
P
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K
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K
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&
K
GC8CH@G
!!
植物生活在外界环境中!时时刻刻都受到周围
环境的影响当环境不适合植物生长发育时就会对
植物产生胁迫!例如高盐(干旱(低温(高温或重金属
污染等等)#*由于不能像动物一样通过移动来趋利
避害!所以植物进化出一套完整机制来应对这些胁
迫当植物受到高盐胁迫时大量胁迫相关基因的表
达量上调!从而增强离子的运输能力(提高细胞的渗
透势或清除活性氧自由基等等!最终提高植物的成
活率)!*
高盐胁迫是最重要的非生物胁迫之一!严重影
响了农作物的产量和品质统计数据显示大约
!"^
的耕地和
&"^
的灌溉土地不同程度地受到盐
胁迫的影响)%*通过传统手段改良农作物耐盐性费
时费力!远远不能满足生产需要随着分子生物学
的发展!很多与植物抗盐相关的基因被克隆出来!如
4#
(
4!
(
4%
(
567
(
689
等)#)!*这些基因
的克隆及功能研究使得通过转基因手段提高作物的
耐盐性成为可能转基因技术主要是从转录水平调
控基因的表达!达到改变受体植物性状的目的启
动子是调控基因表达的重要顺式作用元件!在基因
表达过程中起着重要作用)$*启动子分为组成型启
动子和特异型启动子!其中组成型启动子调控的基
因表达水平恒定!不同组织间差别不大!也不受外界
诱导&特异型启动子包括组织特异性启动子和诱导
型启动子诱导型启动子在正常条件下不启动基因
转录!在特定条件刺激下才能大幅度提高基因表达
水平)$)&*已报道的转基因研究中所用到的启动子
主要为花椰菜病毒
%&M
启动子!是一个组成型高效
强启动子很多基因过量表达后!植物出现矮化(早
衰(不育或败育等生长缺陷!从而限制了众多基因资
源的应用)**诱导型启动子仅在特定条件下驱动下
游基因进行表达!可以避免持续高表达抗逆基因而
引起的植物生长缺陷拟南芥
R)JC=
泛素连接酶
基因
!"#$%#6
参与了拟南芥对高盐胁迫的响应!
与其同源基因
!"#$%#(
双突变后降低了植物对高
盐胁 迫 的 敏 感 性),*本 研 究 发 现
!"#$%#6
"
PH#Q#"&*"
#基因在高盐诱导后表达量明显升高!
推测其启动子可能为盐诱导型启动子!进而对该基
因的启动子进行了克隆和序列分析同时利用
!"(
#$%#6
的启动子在野生型拟南芥中驱动
&$
报告
基因的表达!研究高盐胁迫下该启动子的特异性及
启动能力!以期找到一个高盐诱导型启动子!为通过
转基因技术培育耐盐新品种提供有力工具
#
!
材料和方法
$+$
!
材
!
料
$+$+$
!
植物材料
!
实验材料为野生型"生态型为
3C:?8J.9)"
#拟南芥"
!)*+,-.
/
0,0"1*2,*3*
#将拟
南芥种子用
#"^
次氯酸钠进行表面消毒
#&
"
!"
8.0
!再用灭菌蒸馏水冲洗种子
%
"
&
次灭菌后的
种子用含有
"+!^
琼脂粉的培养基重悬!播种在
#
%
!
OM
固体培养基
$_
处理
!
"
%A
后!放入标准培
养间进行培养
$+$+<
!
菌株(质粒及试剂
!
大肠杆菌
7:#(+2;<
(
农杆菌
=6!#"&
(植物表达载体
K
398J.9#%"")!!#)
QRM
由本实验室保存实验中所用的限制性内切
酶和
N
$
F`P
连接酶购自
N9Z929
公司&
9*
>
酶购
自北京天根公司&凝胶回收试剂盒购自博迈得"
1.)
C8@A
#公司&克隆载体
K
7PMV)1:?0H
购自全式金公
司!其他化学试剂均为国产或进口分析纯
$+<
!
方
!
法
$=<=$
!
>?4
的提取及杂交
!
取
%""88C:
%
EF93:
处理拟南芥幼苗!分别于处理后
"
(
#
(
!
(
$
(
6
(
#*
(
!$
和
$6<
采样!采用热酚法提取拟南芥总
2FP
)
6
*
每个
样品取
#"
#
D
2FP
用于杂交分析!通过琼脂糖凝胶
电泳分离总
2FP
!转移到硝酸纤维素膜上!紫外交联
后进行
FCGH<@G01:CH
!用%!
I
标记的
!"#$%#6
探针
检测 基 因 表 达 量扩 增 探 针 所 用 引 物 为
I
#
"
PQPQPNPQPNQ3PQPP3QQNNPQPNQ
#和
I
!
"
NPQN3N3QN3N3NQNNNNPQ3N33NN3
#
$=<=<
!
!#12%$%
基因启动子序列的克隆及测序
!
从
NPU2
"
N<@!)*+,-.
/
0,0U0XCG89H.C02@/C?GB@
#
中获得了
!"#$%#6
基因
PNQ
前
#(,$J
K
的启动
子序列根据
!"#$%#6
启动子和
K
398J.9#%"")
!!#)QRM
载体的序列!利用
a@BHCGFNU
软件设计带
有
6,3A
$
和
7+*
%
酶切位点的特异引 物
I
%
"
NQPPQ3NNNQNQ3NNNQQNN3PNQPNQ
#和
I
$
"
P3N3NPQPQ3NQ3NPNQP3NNNQNPQPN
#以
拟南芥基因组
F`P
为模板进行
I32
扩增!扩增条
件为
($_
预变性
&8.0
(
$_
变性
%"/
(
&6_
退火
%"/
(
,!_
延伸
#8.0$"/
!
%"
个循环!
,!_
延伸
#"
8.0

I32
产物用
#^
琼脂糖凝胶电泳分离后!切
胶利用凝胶回收试剂盒回收目的片段!连入克隆
载体
K
7PMV)1:?0H
进行测序
&&
#
期
!!!!!!!!!
张新宇!等$盐胁迫对拟南芥
!"#$%#6
基因的诱导表达及其启动子分析
$=<=@
!
!#12%$%
基因启动子的序列分析
!
选取
!"#$%#6
起始密码子
PNQ
前
#(,$J
K
的序列在
线分析其包含的顺式作用原件"
K
$%%
J.C.0XCG89)
H.B/+
K
/J+?
D
@0H+J@
%
[@JHCC:/
%
K
:90HB9G@
%
%#
$=<=A
!
!#12%$%
基因启动子载体构建及拟南芥的
转化
!
用
6,3A
$
和
7+*
%
酶切
K
398J.9#%"")!!#)
QRM
和含有目的片段的
K
7PMV)1:?0H
克隆载体!
回收目的片段与载体片段利用
N
$
F`P
连接酶
!!_
连接过夜!转化大肠杆菌
7:#(%2;<
!提取并鉴
定重组质粒酶切鉴定正确的载体转入农杆菌
=6!#"&
!通过农杆菌介导的拟南芥花序抽真空遗
传转化方法转化野生型拟南芥)(*
$+<+B
!
转基因拟南芥筛选及盐胁迫处理
!
利用潮
霉素对转基因拟南芥
N
!
代种子进行筛选!鉴定出
的纯和转基因株系用于盐胁迫处理和组织化学染色
分析将固体
#
%
!OM
培养基中培养
!
周左右的拟
南芥移植到液体
#
%
!OM
中!
$<
后更换含有
%""
88C:
%
EF93:
的新鲜培养基!处理
$<
后取样!用于
组织化学染色同时!用不含有
F93:
的培养基处
理的幼苗作为对照将处理后的幼苗浸泡在染色液
中"
+!8C:
%
EF9L
!
IT
$
+
L
!
T
!
%+(8E
&
"+!8C:
%
EF9
!
LIT
$
+
!L
!
T
!
*+#8E
&
#""88C:
%
E5)
D
:?B
!
!""
#
E
#!放置于
%,_%"8.0
"取决于染色情况#!
用
,&^
乙醇脱色至透明
!
!
结果与分析
<=$
!
!#12%$%
高盐胁迫下的表达模式
为了研究
!"#$%#6
在高盐胁迫下的表达模
式!通过
FCGH<@G01:CH
检测盐胁迫处理后基因的表
达水平结果"图
#
#显示!拟南芥未经过诱导时!
!"#$%#6
转录水平很低而高盐处理后!
!"(
#$%#6
表达量明显升高!而且表达水平随处理时间
的延长先增加再降低!然后又增加在处理后
$<
达到顶峰!处理后
#*<
表达量最低实验结果表
明!
!"#$%#6
基因表达量受高盐胁迫的诱导
图
#
!
!"#$%#6
在
%""88C:
%
EF93:
处理
不同时间的表达分析
b.
D
+#
!
N<@@=
K
G@//.C0CX!"#$%#6.0G@/
K
C0/@
HCF93:?0A@GA.XX@G@0HH.8@
K
@G.CA/
<=<
!
!#12%$%
启动子片段的扩增与序列分析
!"#$%#6
是一个盐胁迫诱导的基因!所以推测
该基因启动子可能为盐诱导型启动子利用特异引
物进行
I32
扩增!克隆
!"#$%#6
启动子
I32
产
物通过
#^
琼脂糖凝胶电泳分离出一条约
!\J
的特
异条带"图
!
#回收目的片段!连接至克隆载体
K
7PMV)1:?0H
中进行测序
通 过
K
:90HB9G@
"
K
$%%
J.C.0XCG89H.B/+
K
/J+
?
D
@0H+J@
%
[@JHCC:/
%
K
:90HB9G@
%
%#预测其中包
含的顺式作用元件!结果发现
!"#$%#6
的启动子
内除了含有启动子必需的核心元件
3PPN)JC=
和
NPNP)JC=
外!还包含很多与胁迫相关的元件!部
分顺式作用元件与非生物胁迫相关!部分与生物胁
迫相关非生物胁迫相关调控元件包括调控
P1P
反应的
P127
&与低温胁迫相关的
EN2
&干旱胁迫
诱导的
OV1
转录因子结合位点(热激反应调控元
件
LM7
及参与防护和胁迫的富含
N3
的顺式作用
元件有
!
个与生物胁迫相关的顺式调控元件!一
个是响应真菌刺激的
1C=)c#
!另一个是参与水杨
酸反应的
N3P
元件除了与胁迫相关的顺式调控
元件外!还发现了参与光响应的元件!主要包括
P37
(
1C=$
(
Q)1C=
(
QPQ)8CH.X
(
U)JC=
(
OFb#
(
M
K
#
及
OV1
结合位点"表
#
#通过对
!"#$%#6
启动
子的序列分析推测
!"#$%#6
的启动子可能是一个
胁迫诱导型的启动子
<=@
!
!#12%$%
启动子表达载体的构建与重组子的
酶切鉴定
将
!"#$%#6
的启动子克隆至
K
398J.9#%"")
!!#)QRM
载体中驱动
&$
基因表达"图
%
#由于
图
!
!
拟南芥
!"#$%#6
启动子的扩增
O+O9G\@G M`&"""
&
I+I32
扩增产物
b.
D
+!
!
P8
K
:.X.B9H.C0CX!"#$%#6
K
GC8CH@G
XGC8!)*+,-.
/
0,0"1*2,*3*
O+O9G\@G M`&"""
&
I+I3298
K
:.X.B9H.C0CX!"#$%#6
K
GC8CH@G
*&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
$
!
拟南芥
!#12%$%
的启动子区包含的顺式调控元件
N9J:@#
!
3./)9BH.0
D
@:@8@0H/.0
K
GC8CH@GCX!"#$%#6
元件
7:@8@0H
位置
M.H@
功能
b?0BH.C0
数量
F?8J@G
P127 #6$
&
!&$
&
#*,(
脱落酸响应元件
P1PG@/
K
C0/.Y@0@// %
P37 !&!
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// #
P?=22)BCG@ ##%*
&
#%"&
生长素响应元件
P?=.0G@/
K
C0/.Y@0@// !
1C=$ $"6
&
*$"
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6*,
&
##%!
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@/// $
1C=)c# ("!
真菌激活子响应元件
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D
9:@:.B.HCGG@/
K
C0/.Y@0@// #
Q)1C= #6*
&
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光响应元件
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QPNP)8CH.X #,**
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// #
QP27)8CH.X *(#
赤霉素响应元件
Q.JJ@G@:.0)G@/
K
C0/.Y@0@// #
LM7 %$#
&
,(#
热激元件
L@9H/HG@//G@/
K
C0/.Y@0@// !
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光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// #
EN2 %6*
低温响应元件
EC[)H@8
K
@G9H?G@G@/
K
C0/.Y@0@// #
O1M #%##
&
#**&
干旱诱导的
OV1
结合位点
G`C?
D
D
/.H@ !
OFb# ,"%
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// #
M
K
# ,((
&
#,(&
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// !
N3)G.BK
@9H/ #!6(
&
#$$*
防御和胁迫响应元件
@`X@0/@90A/HG@//G@/
K
C0/.Y@0@// !
N3N)8CH.X ##&,
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// #
O27 #"",
光反应的
OV1
结合位点
E.
D
D
/.H@ #
图
%
!
!"#$%#6
启动子重组质粒酶切鉴定
O+#\J F`P:9AA@G
&
I+
重组质粒的双酶切产物
b.
D
+%
!
UA@0H.X.B9H.C0CXG@BC8J.090H
K
:9/8.ABC0H9.0.0
D
!"#$%#6
K
GC8CH@GJ
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A.
D
@/H.C0
O+#\J F`P:9AA@G
&
I+2@BC8J.090H
K
:9/8.A
A.
D
@/H@A[.H<6,3A
$
90A7+*
%
在
I32
引物中引入了
6,3A
$
和
7+*
%
酶切位点!
筛选出阳性重组子后!双酶切检测目的片段是否连
入载体酶切产物通过
#^
琼脂糖凝胶电泳进行分
离!结果出现
!
条带$一条带大小约为
##\J
!与载体
片段大小相一致&另一条带大小约为
!\J
!与启动
子片段大小相一致"图
%
#!表明
!"#$%#6
的启动子
成功克隆至
K
398J.9#%"")!!#)QRM
载体中
<+A
!
转基因拟南芥在盐胁迫下的组织化学染色
分析
为了研究
!"#$%#6
启动子在高盐胁迫下的特
异性及启动能力!将构建的
!"#$%#6
启动子表达
载体转化野生型的拟南芥!得到纯和转基因株系!高
盐处理后观察报告基因表达情况结果"图
$
#表
明!未经高盐处理时!报告基因在幼苗中表达微弱!
主要在根中表达!尤其是在根尖中的表达量很高"图
$
!
9
(
B
#经过
F93:
处理后!无论在幼苗的地上部分
还是地下部分!
&$
基因的表达量均明显上调但
与根中的表达相比!报告基因在地上部位的表达量
上调更为明显"图
$
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#以上结果表明!
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的启动子为高盐诱导的特异型启动子在
正常条件下!
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的启动子驱动下游基因进行
微弱表达!可以避免持续高表达抗盐基因而引起的
植物生长缺陷&在高盐条件下!该启动子可以明显增
强下游基因的表达量!从而增强转基因植物耐盐性
%
!
讨
!
论
高盐胁迫是一种危害农作物生长发育!影响作
物产量和品质的重要非生物胁迫转基因技术可以
突破传统育种的局限性!为作物分子育种提供一条
更有效的途径作为基因表达调控的重要组成部
分!启动子决定了基因表达的时间(空间和强度!也
是农作物转基因研究中的重要工具)#"*虽然以前
应用的
%&M
启动子能够持续高效表达目的基因!提
高了抗逆性!但往往阻碍植物生长发育)##*研究表
明利用组成型启动子
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驱动
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过表达可以
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期
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张新宇!等$盐胁迫对拟南芥
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基因的诱导表达及其启动子分析
图
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提高拟南芥的抗逆性!但却影响了拟南芥的生长和
育性&改用胁迫诱导基因
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的启动子驱动
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表达不但提高了植物的耐逆性也没有对植
株造成负面影响)#!*在水稻中组成型表达
5!A*
在提高抗逆性的同时也影响水稻的生长和产量!但
用胁迫诱导的
:9#
基因的启动子既能够提高水稻
耐逆性又不会造成减产)#%*在农作物的分子育种
中!利用盐胁迫诱导型启动子驱动抗逆基因在农作
物中表达是改良作物的耐逆性的有效方法!因此挖
掘盐胁迫诱导的高效启动子成为目前研究的热点问
题之一
目前已经鉴定的诱导型启动子很多!包括光诱
导启动子(激素诱导启动子(非生物胁迫诱导启动子
及生物胁迫诱导启动子)#$*很多研究仅仅局限在
启动子在一种或两种条件下的启动能力!如甘薯
B#!!
的启动子受到氧化胁迫的诱导!但对于低
温或激素的响应没有报道)#&*&水稻
:=!%)#
的启动
子能够在干旱的条件下驱动基因表达!但在高盐(低
温和激素处理条件下的驱动能力也未有报道)#**
序列分析发现
!"#$%#6
的启动子中含有多个与非
生物胁迫及
P1P
应答相关的顺式作用原件!如
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(
EN2
(
O1M
及
P127
为了详细研究
!"(
#$%#6
启动子的盐胁迫特异性!利用该启动子在拟
南芥中驱动报告基因进行表达转基因拟南芥组织
化学染色分析发现
&$
基因在没有经过高盐处理
时表达量较低!而在处理后表达量明显升高也有
研究表明在干旱和
P1P
诱导后!
!"#$%#6
起始密
码子
PNQ
上游
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的启动子区就可以驱动
&$
基因表达)#,*另外!在
PHIR1#6
启动子内!还有一
些与赤霉素(生长素应答相关的顺式作用元件及与
微生物诱导相关的调控元件这些顺式作用元件的
存在暗示
!"#$%#6
的启动子可能不仅响应非生物
胁迫!同时也可能是一个生物胁迫诱导的特异型启
动子!能够用于作物抗病的分子育种中!这一推测还
有待于进一步研究以上结果显示
!"#$%#6
是一
个可以受多种胁迫诱导的特异型启动子!包括干旱(
高盐和低温!具有较强的启动能力详细研究
!"(
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启动子的特异性并对启动子中的顺式作用
元件的功能进行深入分析可以为转基因技术培育抗
逆新品种提供有力工具
参考文献!
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封面植物介绍"""裸茎碎米荠
裸茎碎米荠"
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#隶属于十字花科"
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#碎米荠属多年生草本!高
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&叶
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!宽
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!基部心形!边缘波状或全缘无茎生叶总状花序
顶生!具
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朵花果期花梗直立或上升!长
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宽
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!+!88
!边缘膜质!白色透明花瓣白色!倒卵形!长
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!宽
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!顶端圆或微凹!基部
渐狭呈短爪中间一对花丝长
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!基部略扩大&外侧一对花丝长
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&花药狭长卵形!
长
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&花柱长
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每室具胚珠
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个长角果长
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光滑无毛种子淡褐色!长圆形!长
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!无翅花期
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裸茎碎米荠是中国特有一种药用植物!生长在海拔
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的灌木丛和潮湿地带分布于河
北(内蒙古(陕西(山西和四川
!图文由西北农林科技大学资环学院朱仁斌提供"
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