全 文 ：书西北植物学报!
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收稿日期$!"#%)#")## &修改稿收到日期$
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基金项目$兵团博士资金专项" !"#%11""% #&石河子大学高层次人才启动项目" 2345!"#!#6 # 作者简介$张新宇"
#(,6
#!男!在读博士研究生!助理研究员!主要从事棉花遗传育种及功能功能基因组学研究
7)89.:
$;<= >! /<;?+ @A?+B0 " 通信作者$刘永昌!博士!副教授!主要从事棉花遗传育种及棉花功能基因组学研究
7)89.:
$:.? > C0 D B<90 D !""% ! #!*+BC8 盐胁迫对拟南芥 !#12%$%
基因的
诱导表达及其启动子分析
张新宇#!赵兰杰!!李艳军#!孙
!
杰#!刘永昌#"
"
#
石河子大学 农学院%新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室!新疆石河子
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石河子大学 生命科学学院!新疆石
河子
6%!"""
#
摘
!
要$用 %""88C: % EF93: 处理拟南芥幼苗!分别于处理后 " ( # ( ! ($
(
6
(
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(
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通过
FCGH<@G01:CH
检测其
!"#$%#6 基因的表达量结果显示$拟南芥
!"#$%#6 基因的表达量受高盐胁迫的诱导而升高!于处理后$<
表达
量达到最高!处理后
#*<
表达量最低采用
I32
技术克隆
!"#$%#6 的启动子!序列为 #(,$J
K
&序列分析发现启
动子内含有大量与非生物胁迫相关的顺式作用元件!如
LM7
(
EN2
(
O1M
及
P127
&将启动子克隆到表达载体
K
398J.9#%"")!!#)QRM
中!驱动报告基因
&$表达组织化学染色结果表明!未经过高盐处理的幼苗中 &$
基
因表达水平很低&
%""88C:
%
EF93:
处理后
&$基因表达量显著升高研究表明! !"#$%#6
的表达受高盐胁迫诱
导!且
!"#$%#6 基因的启动子是一个盐胁迫诱导型启动子 关键词$拟南芥&盐胁迫&
!"#$%#6 基因&启动子 中图分类号$
S,6*
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文献标志码$P & ( )*++#","-!#12%$%.-/*)0.1/0/)*++2)*./3*,/.,!
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&
K
GC8CH@G
!!
植物生活在外界环境中!时时刻刻都受到周围
环境的影响当环境不适合植物生长发育时就会对
植物产生胁迫!例如高盐(干旱(低温(高温或重金属
污染等等)#*由于不能像动物一样通过移动来趋利
避害!所以植物进化出一套完整机制来应对这些胁
迫当植物受到高盐胁迫时大量胁迫相关基因的表
达量上调!从而增强离子的运输能力(提高细胞的渗
透势或清除活性氧自由基等等!最终提高植物的成
活率)!*
高盐胁迫是最重要的非生物胁迫之一!严重影
响了农作物的产量和品质统计数据显示大约
!"^
的耕地和
&"^
的灌溉土地不同程度地受到盐
胁迫的影响)%*通过传统手段改良农作物耐盐性费
时费力!远远不能满足生产需要随着分子生物学
的发展!很多与植物抗盐相关的基因被克隆出来!如
4#
(
4!
(
4%
(
567
(
689
等)#)!*这些基因
的克隆及功能研究使得通过转基因手段提高作物的
耐盐性成为可能转基因技术主要是从转录水平调
控基因的表达!达到改变受体植物性状的目的启
动子是调控基因表达的重要顺式作用元件!在基因
表达过程中起着重要作用)$*启动子分为组成型启 动子和特异型启动子!其中组成型启动子调控的基 因表达水平恒定!不同组织间差别不大!也不受外界 诱导&特异型启动子包括组织特异性启动子和诱导 型启动子诱导型启动子在正常条件下不启动基因 转录!在特定条件刺激下才能大幅度提高基因表达 水平)$)&*已报道的转基因研究中所用到的启动子
主要为花椰菜病毒
%&M
启动子!是一个组成型高效
强启动子很多基因过量表达后!植物出现矮化(早
衰(不育或败育等生长缺陷!从而限制了众多基因资
源的应用)**诱导型启动子仅在特定条件下驱动下
游基因进行表达!可以避免持续高表达抗逆基因而
引起的植物生长缺陷拟南芥
R)JC=
泛素连接酶
基因
!"#$%#6 参与了拟南芥对高盐胁迫的响应! 与其同源基因 !"#$%#(
双突变后降低了植物对高
盐胁 迫 的 敏 感 性),*本 研 究 发 现
!"#$%#6 " PH#Q#"&*" #基因在高盐诱导后表达量明显升高! 推测其启动子可能为盐诱导型启动子!进而对该基 因的启动子进行了克隆和序列分析同时利用 !"( #$%#6
的启动子在野生型拟南芥中驱动
&$报告 基因的表达!研究高盐胁迫下该启动子的特异性及 启动能力!以期找到一个高盐诱导型启动子!为通过 转基因技术培育耐盐新品种提供有力工具 # ! 材料和方法$+$! 材 ! 料$+$+$
!
植物材料
!
实验材料为野生型"生态型为
3C:?8J.9)"
#拟南芥"
!)*+,-.
/
0,0"1*2,*3*
#将拟
南芥种子用
#"^
次氯酸钠进行表面消毒
#&
"
!"
8.0
!再用灭菌蒸馏水冲洗种子
%
"
&
次灭菌后的
种子用含有
"+!^
琼脂粉的培养基重悬!播种在
#
%
!
OM
固体培养基
$_ 处理 ! " %A 后!放入标准培 养间进行培养$+$+< ! 菌株(质粒及试剂 ! 大肠杆菌 7:#(+2;< ( 农杆菌 =6!#"& (植物表达载体 K 398J.9#%"")!!#) QRM 由本实验室保存实验中所用的限制性内切 酶和 N$
F`P
连接酶购自
N9Z929
公司&
9*
>
酶购
自北京天根公司&凝胶回收试剂盒购自博迈得"
1.)
C8@A
#公司&克隆载体
K
7PMV)1:?0H
购自全式金公
司!其他化学试剂均为国产或进口分析纯
$+< ! 方 ! 法$=<=$! >?4 的提取及杂交 ! 取 %""88C: % EF93: 处理拟南芥幼苗!分别于处理后 " ( # ( ! ($
(
6
(
#*
(
!$和$6<
采样!采用热酚法提取拟南芥总
2FP
)
6
*
每个
样品取
#"
#
D
2FP
用于杂交分析!通过琼脂糖凝胶
电泳分离总
2FP
!转移到硝酸纤维素膜上!紫外交联
后进行
FCGH<@G01:CH
!用%!
I
标记的
!"#$%#6 探针 检测 基 因 表 达 量扩 增 探 针 所 用 引 物 为 I # " PQPQPNPQPNQ3PQPP3QQNNPQPNQ #和 I ! " NPQN3N3QN3N3NQNNNNPQ3N33NN3 #$=<=<
!
!#12%$% 基因启动子序列的克隆及测序 ! 从 NPU2 " N<@!)*+,-. / 0,0U0XCG89H.C02@/C?GB@ # 中获得了 !"#$%#6
基因
PNQ
前
#(,$J K 的启动 子序列根据 !"#$%#6
启动子和
K
398J.9#%"")
!!#)QRM
载体的序列!利用
a@BHCGFNU
软件设计带
有
6,3A
$和 7+* % 酶切位点的特异引 物 I % " NQPPQ3NNNQNQ3NNNQQNN3PNQPNQ #和 I$
"
P3N3NPQPQ3NQ3NPNQP3NNNQNPQPN
#以
拟南芥基因组
F`P
为模板进行
I32
扩增!扩增条
件为
($_ 预变性 &8.0 ($_
变性
%"/
(
&6_
退火
%"/
(
,!_
延伸
#8.0$"/ ! %" 个循环! ,!_ 延伸 #" 8.0 I32 产物用 #^ 琼脂糖凝胶电泳分离后!切 胶利用凝胶回收试剂盒回收目的片段!连入克隆 载体 K 7PMV)1:?0H 进行测序 && # 期 !!!!!!!!! 张新宇!等$盐胁迫对拟南芥
!"#$%#6 基因的诱导表达及其启动子分析$=<=@
!
!#12%$% 基因启动子的序列分析 ! 选取 !"#$%#6
起始密码子
PNQ
前
#(,$J
K
的序列在
线分析其包含的顺式作用原件"
K
$%%
J.C.0XCG89)
H.B/+
K
/J+?
D
@0H+J@
%
[@JHCC:/
%
K
:90HB9G@
%
%#
$=<=A ! !#12%$%
基因启动子载体构建及拟南芥的
转化
!
用
6,3A
$和 7+* % 酶切 K 398J.9#%"")!!#) QRM 和含有目的片段的 K 7PMV)1:?0H 克隆载体! 回收目的片段与载体片段利用 N$
F`P
连接酶
!!_
连接过夜!转化大肠杆菌
7:#(%2;<
!提取并鉴
定重组质粒酶切鉴定正确的载体转入农杆菌
=6!#"&
!通过农杆菌介导的拟南芥花序抽真空遗
传转化方法转化野生型拟南芥)(*
$+<+B ! 转基因拟南芥筛选及盐胁迫处理 ! 利用潮 霉素对转基因拟南芥 N ! 代种子进行筛选!鉴定出 的纯和转基因株系用于盐胁迫处理和组织化学染色 分析将固体 # % !OM 培养基中培养 ! 周左右的拟 南芥移植到液体 # % !OM 中!$<
后更换含有
%""
88C:
%
EF93:
的新鲜培养基!处理
$< 后取样!用于 组织化学染色同时!用不含有 F93: 的培养基处 理的幼苗作为对照将处理后的幼苗浸泡在染色液 中" +!8C: % EF9L ! IT$
+
L
!
T
!
%+(8E
&
"+!8C:
%
EF9
!
LIT
$+ !L ! T ! *+#8E & #""88C: % E5) D :?B ! !"" # E #!放置于 %,_%"8.0 "取决于染色情况#! 用 ,&^ 乙醇脱色至透明 ! ! 结果与分析 <=$
!
!#12%$% 高盐胁迫下的表达模式 为了研究 !"#$%#6
在高盐胁迫下的表达模
式!通过
FCGH<@G01:CH
检测盐胁迫处理后基因的表
达水平结果"图
#
#显示!拟南芥未经过诱导时!
!"#$%#6 转录水平很低而高盐处理后! !"( #$%#6
表达量明显升高!而且表达水平随处理时间
的延长先增加再降低!然后又增加在处理后
$< 达到顶峰!处理后 #*< 表达量最低实验结果表 明! !"#$%#6
基因表达量受高盐胁迫的诱导
图
#
!
!"#$%#6 在 %""88C: % EF93: 处理 不同时间的表达分析 b. D +# ! N<@@= K G@//.C0CX!"#$%#6.0G@/
K
C0/@
HCF93:?0A@GA.XX@G@0HH.8@
K
@G.CA/
<=<
!
!#12%$% 启动子片段的扩增与序列分析 !"#$%#6
是一个盐胁迫诱导的基因!所以推测
该基因启动子可能为盐诱导型启动子利用特异引
物进行
I32
扩增!克隆
!"#$%#6
启动子
I32
产
物通过
#^
琼脂糖凝胶电泳分离出一条约
!\J
的特
异条带"图
!
#回收目的片段!连接至克隆载体
K
7PMV)1:?0H
中进行测序
通 过
K
:90HB9G@
"
K
$%%
J.C.0XCG89H.B/+
K
/J+
?
D
@0H+J@
%
[@JHCC:/
%
K
:90HB9G@
%
%#预测其中包
含的顺式作用元件!结果发现
!"#$%#6 的启动子 内除了含有启动子必需的核心元件 3PPN)JC= 和 NPNP)JC= 外!还包含很多与胁迫相关的元件!部 分顺式作用元件与非生物胁迫相关!部分与生物胁 迫相关非生物胁迫相关调控元件包括调控 P1P 反应的 P127 &与低温胁迫相关的 EN2 &干旱胁迫 诱导的 OV1 转录因子结合位点(热激反应调控元 件 LM7 及参与防护和胁迫的富含 N3 的顺式作用 元件有 ! 个与生物胁迫相关的顺式调控元件!一 个是响应真菌刺激的 1C=)c# !另一个是参与水杨 酸反应的 N3P 元件除了与胁迫相关的顺式调控 元件外!还发现了参与光响应的元件!主要包括 P37 ( 1C=$
(
Q)1C=
(
QPQ)8CH.X
(
U)JC=
(
OFb#
(
M
K
#
及
OV1
结合位点"表
#
#通过对
!"#$%#6 启动 子的序列分析推测 !"#$%#6
的启动子可能是一个
胁迫诱导型的启动子
<=@
!
!#12%$% 启动子表达载体的构建与重组子的 酶切鉴定 将 !"#$%#6
的启动子克隆至
K
398J.9#%"")
!!#)QRM
载体中驱动
&$基因表达"图 % #由于 图 ! ! 拟南芥 !"#$%#6
启动子的扩增
O+O9G\@G M`&"""
&
I+I32
扩增产物
b.
D
+!
!
P8
K
:.X.B9H.C0CX!"#$%#6 K GC8CH@G XGC8!)*+,-. / 0,0"1*2,*3* O+O9G\@G M`&""" & I+I3298 K :.X.B9H.C0CX!"#$%#6
K
GC8CH@G
*&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 表$
!
拟南芥
!#12%$% 的启动子区包含的顺式调控元件 N9J:@# ! 3./)9BH.0 D @:@8@0H/.0 K GC8CH@GCX!"#$%#6
元件
7:@8@0H
位置
M.H@
功能
b?0BH.C0
数量
F?8J@G
P127 #6$& !&$
&
#*,(
脱落酸响应元件
P1PG@/
K
C0/.Y@0@// %
P37 !&!
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// #
P?=22)BCG@ ##%*
&
#%"&
生长素响应元件
P?=.0G@/
K
C0/.Y@0@// !
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&
*$"
&
6*,
&
##%!
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@/// $1C=)c# ("! 真菌激活子响应元件 b?0 D 9:@:.B.HCGG@/ K C0/.Y@0@// # Q)1C= #6* & !," & !&$
&
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&
*,!
&
#*,(
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// *
QPNP)8CH.X #,**
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// #
QP27)8CH.X *(#
赤霉素响应元件
Q.JJ@G@:.0)G@/
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C0/.Y@0@// #
LM7 %$#
&
,(#
热激元件
L@9H/HG@//G@/
K
C0/.Y@0@// !
U)JC= #,,(
光响应元件
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D
K
C0/.Y@0@// #
EN2 %6*
低温响应元件
EC[)H@8
K
@G9H?G@G@/
K
C0/.Y@0@// #
O1M #%##
&
#**&
干旱诱导的
OV1
结合位点
G`C?
D
D
/.H@ !
OFb# ,"%
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// #
M
K
# ,((
&
#,(&
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// !
N3)G.BK
@9H/ #!6(
&
#$$*
防御和胁迫响应元件
@`X@0/@90A/HG@//G@/
K
C0/.Y@0@// !
N3N)8CH.X ##&,
光响应元件
E.
D
K
C0/.Y@0@// #
O27 #"",
光反应的
OV1
结合位点
E.
D
D
/.H@ #
图
%
!
!"#$%#6 启动子重组质粒酶切鉴定 O+#\J F`P:9AA@G & I+ 重组质粒的双酶切产物 b. D +% ! UA@0H.X.B9H.C0CXG@BC8J.090H K :9/8.ABC0H9.0.0 D !"#$%#6
K
GC8CH@GJ
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A.
D
@/H.C0
O+#\J F`P:9AA@G
&
I+2@BC8J.090H
K
:9/8.A
A.
D
@/H@A[.H<6,3A
$90A7+* % 在 I32 引物中引入了 6,3A$
和
7+*
%
酶切位点!
筛选出阳性重组子后!双酶切检测目的片段是否连
入载体酶切产物通过
#^
琼脂糖凝胶电泳进行分
离!结果出现
!
条带$一条带大小约为 ##\J !与载体 片段大小相一致&另一条带大小约为 !\J !与启动 子片段大小相一致"图 % #!表明 !"#$%#6
的启动子
成功克隆至
K
398J.9#%"")!!#)QRM
载体中
<+A
!
转基因拟南芥在盐胁迫下的组织化学染色
分析
为了研究
!"#$%#6 启动子在高盐胁迫下的特 异性及启动能力!将构建的 !"#$%#6
启动子表达
载体转化野生型的拟南芥!得到纯和转基因株系!高
盐处理后观察报告基因表达情况结果"图
$#表 明!未经高盐处理时!报告基因在幼苗中表达微弱! 主要在根中表达!尤其是在根尖中的表达量很高"图$
!
9
(
B
#经过
F93:
处理后!无论在幼苗的地上部分
还是地下部分!
&$基因的表达量均明显上调但 与根中的表达相比!报告基因在地上部位的表达量 上调更为明显"图$
!
J
(
A
#以上结果表明!
!"(
#$%#6 的启动子为高盐诱导的特异型启动子在 正常条件下! !"#$%#6
的启动子驱动下游基因进行
微弱表达!可以避免持续高表达抗盐基因而引起的
植物生长缺陷&在高盐条件下!该启动子可以明显增
强下游基因的表达量!从而增强转基因植物耐盐性
%
!
讨
!
论
高盐胁迫是一种危害农作物生长发育!影响作
物产量和品质的重要非生物胁迫转基因技术可以
突破传统育种的局限性!为作物分子育种提供一条
更有效的途径作为基因表达调控的重要组成部
分!启动子决定了基因表达的时间(空间和强度!也
是农作物转基因研究中的重要工具)#"*虽然以前
应用的
%&M
启动子能够持续高效表达目的基因!提
高了抗逆性!但往往阻碍植物生长发育)##*研究表
明利用组成型启动子
%&M
驱动
?@=%
过表达可以
,&
#
期
!!!!!!!!!
张新宇!等$盐胁迫对拟南芥 !"#$%#6
基因的诱导表达及其启动子分析
图
$! 转基因拟南芥高盐胁迫后组织化学染色分析 9 ( B+ 对照! # % !OM 培养液处理的幼苗& J ( A+ 含 %""88C: % EF93: 的 # % !OM 培养液处理$<
的幼苗
b.
D
+$
!
N<@<./HCB<@8.B9:QRM9//9
>
CXHG90/
D
@0.B!)*+,-.
/
0,09XH@G<.
D
>
/HG@//
990ABG@
K
G@/@0H
K
:90H/HG@9H@AJ
>
:.
]
?.A#
%
!OM[.H&
J90AAG@
K
G@/@0H
K
:90H/HG@9H@AJ
>
:.
]
?.A#
%
!OM[.H<%""88C:
%
EF93:XCG$< 提高拟南芥的抗逆性!但却影响了拟南芥的生长和 育性&改用胁迫诱导基因 @?!(! 的启动子驱动 ?@=% 表达不但提高了植物的耐逆性也没有对植 株造成负面影响)#!*在水稻中组成型表达 5!A* 在提高抗逆性的同时也影响水稻的生长和产量!但 用胁迫诱导的 :9# 基因的启动子既能够提高水稻 耐逆性又不会造成减产)#%*在农作物的分子育种 中!利用盐胁迫诱导型启动子驱动抗逆基因在农作 物中表达是改良作物的耐逆性的有效方法!因此挖 掘盐胁迫诱导的高效启动子成为目前研究的热点问 题之一 目前已经鉴定的诱导型启动子很多!包括光诱 导启动子(激素诱导启动子(非生物胁迫诱导启动子 及生物胁迫诱导启动子)#$*很多研究仅仅局限在
启动子在一种或两种条件下的启动能力!如甘薯
B#!!
的启动子受到氧化胁迫的诱导!但对于低
温或激素的响应没有报道)#&*&水稻
:=!%)#
的启动
子能够在干旱的条件下驱动基因表达!但在高盐(低
温和激素处理条件下的驱动能力也未有报道)#**
序列分析发现
!"#$%#6 的启动子中含有多个与非 生物胁迫及 P1P 应答相关的顺式作用原件!如 LM7 ( EN2 ( O1M 及 P127 为了详细研究 !"( #$%#6
启动子的盐胁迫特异性!利用该启动子在拟
南芥中驱动报告基因进行表达转基因拟南芥组织
化学染色分析发现
&$基因在没有经过高盐处理 时表达量较低!而在处理后表达量明显升高也有 研究表明在干旱和 P1P 诱导后! !"#$%#6
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码子
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上游
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的启动子区就可以驱动
&$基因表达)#,*另外!在 PHIR1#6 启动子内!还有一 些与赤霉素(生长素应答相关的顺式作用元件及与 微生物诱导相关的调控元件这些顺式作用元件的 存在暗示 !"#$%#6
的启动子可能不仅响应非生物
胁迫!同时也可能是一个生物胁迫诱导的特异型启
动子!能够用于作物抗病的分子育种中!这一推测还
有待于进一步研究以上结果显示
!"#$%#6 是一 个可以受多种胁迫诱导的特异型启动子!包括干旱( 高盐和低温!具有较强的启动能力详细研究 !"( #$%#6
启动子的特异性并对启动子中的顺式作用
元件的功能进行深入分析可以为转基因技术培育抗
逆新品种提供有力工具
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裸茎碎米荠"
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#隶属于十字花科"
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#碎米荠属多年生草本!高
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!无翅花期
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的灌木丛和潮湿地带分布于河
北(内蒙古(陕西(山西和四川
!图文由西北农林科技大学资环学院朱仁斌提供"
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基因的诱导表达及其启动子分析