全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(２): １１３￣１２０(２０１５)
收稿日期: ２０１３￣１０￣０６ꎻ 修回日期: ２０１４￣１２￣１１
基金项目: 山东省自然科学基金资助项目(ＺＲ２０１２ＣＭ０３２)
通讯作者: 竺晓平ꎬ博士ꎬ主要从事植物病毒和抗病基因工程研究ꎻＴｅｌ: ０５３８￣８２４７７８１￣８５１０ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｚｈｕｘｐ＠ｓｄａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 陈妮ꎬ山东蓬莱人ꎬ从事植物保护和植原体病害研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｃｈｅｎｎｉｃｈｎ＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０２.００１
山东省枣疯病植原体的鉴定及分子变异分析
陈 妮１ꎬ２ꎬ 刘永光３ꎬ 仇平平１ꎬ 刘文浩１ꎬ 苏文敏１ꎬ 竺晓平１∗
( １山东农业大学植物保护学院植物病理系ꎬ泰安 ２７１０１８ꎻ ２福山区农业局ꎬ福山 ２６５５００ꎻ ３潍坊科技学院ꎬ潍坊 ２６２７００)
摘要:本研究对山东省 １１个地区的枣疯病样品进行了鉴定和分子变异分析ꎮ 以样品总 ＤＮＡ 为模板ꎬ经扩增和序列测定ꎬ
分别得到 １６Ｓ ｒＲＮＡ (１ ４３２ ｂｐ)、核糖体蛋白基因 ｒｐ (１ １９６ ｂｐ)、转运蛋白基因 ｓｅｃＡ (８３６ ｂｐ) 和 ｓｅｃＹ (１ ４２１ ｂｐ) 的序列ꎬ
ｓｅｃＡ基因序列是首次从枣疯病植原体中扩增获得ꎮ 对获得的序列与 ＮＣＢＩ数据库中相关植原体序列进行聚类和核苷酸变
异分析ꎬ结果显示山东省枣疯病植原体属于 １６ＳｒⅤ￣Ｂ、ｒｐⅤ￣Ｃ、ｓｅｃＹⅤ￣Ｃ亚组ꎬ相对于 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因ꎬｒｐꎬｓｅｃＡ和 ｓｅｃＹ变异更
大ꎬ非同义突变更多ꎬ更利于对国内不同来源的枣疯病植原体的精细系统进化分析ꎮ
关键词:枣疯病ꎻ 植原体ꎻ 分子鉴定ꎻ 序列多态性
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ｂｒｏｏｍ ｉｎ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ＣＨＥＮ Ｎｉ１ꎬ２ꎬ ＬＩＵ Ｙｏｎｇ￣ｇｕａｎｇ３ꎬ ＱＩＵ
Ｐｉｎｇ￣ｐｉｎｇ１ꎬ ＬＩＵ Ｗｅｎ￣ｈａｏ１ꎬ ＳＵ Ｗｅｎ￣ｍｉｎ１ꎬ ＺＨＵ Ｘｉａｏ￣ｐｉｎｇ１ ( １Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔａｉａｎ ２７１０１８ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｆｕｓｈａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｆｕｓｈａｎ ２６５５００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
３Ｗｅｉｆａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｗｅｉｆａｎｇ ２６２７００ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ (ＪＷＢ) ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｓｏｍｅ ｔｙｐｉｃａｌ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｔｈｅｎ ａｎａｌｙｚｅｄ. Ｆｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ
ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ １.４ ｋｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡꎬ １.２ ｋｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｒｐ ｇｅｎｅꎬ ０.８ ｋｂ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｃＡ ｇｅｎｅꎬ １. ４ ｋｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｃＹ ｇｅｎｅꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｃＡ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｆｉｒｓｔ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｊｕｊｕｂｅ
ｗｉｔｃｈｅｓ’ ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｍａ. Ｔｈｅ ＰＣＲ￣ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｉｎ ＮＣＢＩ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ｂｒｏｏｍ
ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ｂｅｌｏｎｇ ｔｏ ｓｕｂｇｒｏｕｐ １６ＳｒⅤ￣Ｂ、 ｒｐ Ⅴ￣Ｃ、 ｓｅｃＹⅤ￣Ｃ. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｒｐꎬ ｓｅｃＡ ａｎｄ ｓｅｃＹ ｃｏｎｔａｉｎ ｍｏｒｅ ｎｏｎ￣ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｒｅ ｍｏｒｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｈａｎ
１６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｕｓｅ ｆｏｒ ｆｉｎｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’
ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ｂｒｏｏｍꎻ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
中图分类号: Ｓ４３２.４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０２￣０１１３￣０８
植原体(ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ)是一种无细胞壁的原核
生物ꎬ专性寄生于植物的筛管内ꎬ主要依靠叶蝉和
飞虱等从韧皮部取食的半翅目昆虫传播ꎬ也可通过
菟丝子和嫁接传播ꎬ能够引起世界范围内 ２００ 多种
重要的经济作物病害[１]ꎬ造成巨大的经济损失ꎬ主
要症状为丛枝、黄化、簇生等ꎮ
植原体不能人工培养ꎬ使得其在形态和代谢方
面的差别难以确定ꎬ因此一直没有形成系统的植原
体分类鉴定方法ꎮ 在植原体的分类鉴定中ꎬ
１６Ｓ ｒＲＮＡ是系统发育的首选标记ꎬ但越来越多的
植物病理学报 ４５卷
研究发现ꎬ有时仅依据 １６Ｓ ｒＲＮＡ不足以实现对植
原体种类的进一步科学划分ꎬ促使一些相对变异较
大的区域也被用于植原体的分类中[２]ꎮ Ｌｅｅ
等[３ꎬ ４]根据 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因和 ｒｐ 基因等的 ＲＦＬＰ
分析将植原体 ３４ 个典型的株系划分为 １４ 个组和
３２个亚组ꎻ２００６年 Ｌｅｅ等[５]通过 ｓｅｃＹ 基因序列分
析ꎬ在翠菊黄化组(ＡＹ)内划分出 １０ 个独立的进
化枝ꎻ２００８年 Ｊｅｎｎｉｆｅｒ等[６]报道了各组代表性植原
体的 ｓｅｃＡ 基因ꎬ发现 ｓｅｃＡ 基因的遗传距离更大ꎬ
并证明该基因可以用于植原体分类研究ꎮ
枣树(Ｚｉｚｙｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂａ)是我国重要的干果和特
色经济树种之一ꎬ已有 ８ ０００ 多年的栽培历史ꎮ 枣
疯病( ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ｂｒｏｏｍ)是由植原体引起的一
类病害ꎬ具有毁灭性ꎬ遍布于我国的各大枣区ꎬ严重
阻碍了枣树产业的发展ꎮ 我国及韩国和日本科研
工作者对枣疯病的分类和鉴定做了大量的工作ꎮ
Ｚｈｕ等[７]报道了中国枣疯病作为候选种新的亚组ꎬ
属于 １６ＳｒＶ￣Ｂ亚组ꎻＪｕｎｇ 等[８]将枣疯病植原体作
为一个独立的候选种‘Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｚｉｚ￣
ｉｐｈｉ’ꎮ 到目前为止ꎬ对枣疯病植原体的研究主要
集中在 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因上ꎬＷａｎｇ 等[９]对陕西省枣
疯病和酸枣丛枝病植原体 １６Ｓ ｒＲＮＡ 和 ｔｕｆ基因的
序列进行了同源性分析ꎻＸｕ 等[１０]通过 １６Ｓ ｒＲＮＡ、
１６Ｓ￣２３Ｓ间区序列(ＳＲ)及 ｓｅｃＹ基因对中国各地不
同枣树品种上枣疯病植原体进行了 ＰＣＲ检测及分
子变异分析ꎮ
本研究通过对采集自山东省 １１个地区的枣疯
病植原体样品的 １６Ｓ ｒＲＮＡ、ｒｐ、ｓｅｃＡ 及 ｓｅｃＹ 基因
进行序列分析和 ＲＦＬＰ分析ꎬ从多个基因层面分析
了山东枣疯病植原体归属和分子变异情况ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
枣疯病材料采自山东省泰安(ＷＪＷＢ￣ＴＳ)、宁
阳(ＪＷＢ￣ＮＹ)、济阳( ＪＷＢ￣ＪＹ)、博山( ＪＷＢ￣ＢＳ)、
临沂 ( ＪＷＢ￣ＬＹ)、平邑 ( ＪＷＢ￣ＰＹ)、章丘 ( ＪＷＢ￣
ＺＱ)、招远 ( ＪＷＢ￣ＺＹ)、莱芜 ( ＪＷＢ￣ＬＷ )、龙口
(ＪＷＢ￣ＬＫ)和枣庄( ＪＷＢ￣ＺＺ) １１ 个地区ꎮ 感染枣
疯病植原体的组培苗由中国林业科学研究院森林
生态环保所田国忠研究员提供ꎮ 克隆载体
ｐＭＤ１８￣Ｔ、ＰＣＲ 产物回收试剂盒、高保真 ＤＮＡ 聚
合酶 Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、限制性内切酶及其
它酶类等分子生物学试剂产品均购自 ＴａＫａＲａ 公
司ꎮ
１.２ 植株总 ＤＮＡ提取及 ＰＣＲ扩增
样品总 ＤＮＡ 的提取参照 Ｌｉｕ 等[１１]的 ＳＤＳ￣
ＣＴＡＢ 法ꎬ植原体 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因扩增采用 Ｌｅｅ
等[１２]报道的通用引物Ｒ１６ｍＦ２ / Ｒ１６ｍＲ１ (５′￣ＣＡＴＧ￣
ＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＡ￣３′ꎬ ５′￣ＣＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＴＣＡＴ
ＣＧＡＣ￣３′ꎻ退火温度 ６０℃)ꎬｒｐ 基因扩增根据 Ｇｅｎ￣
Ｂａｎｋ 登录的序列设计引物对 ｒｐＦ２ / ｒｐＲ２ (５′￣ＡＧ￣
ＧＣＧＡＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＡＡＡ￣３′ꎬ ５′￣ＧＧＣＡＴＴＡＡＣ
ＡＴＡＡＴＡＴＡＴＴＡＴ￣３′ꎻ退火温度 ５５℃)ꎬｓｅｃＡ 基因扩
增采用 Ｈｏｄｇｅｔｔｓ 等[２]报道的引物对 ＳｅｃＡｆｏｒ１ / Ｓｅｃ￣
Ａｒｅｖ３ ( ５′￣ＧＡＲＡＴＧＡＡＡＡＣＴＧＧＲＧＡＡＧＧ￣３′ꎬ ５′￣
ＧＴＴＴＴＲＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＮＣＣ￣３′ꎻ 退 火 温 度
５３℃)ꎬｓｅｃＹ基因扩增采用Ｄａｉｒｅ等[１３]设计的特异引
物对 ＦＤ９ｆ / ｒ ( ５′￣ＧＡＡＴＴＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＧＡＡＧＡＣ
Ｇ￣３′ꎬ ５′￣ＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＡＴＣＴＴＧＴＡＴＣＧ￣３′ꎻ退火
温度 ５２℃)ꎮ 反应体系为 ２５ μＬꎬＰＣＲ 产物于 ０.８％
琼脂糖凝胶电泳检测ꎬＰＣＲ 反应分设阳性对照(枣
疯病组培苗)和阴性对照(健康枣树)ꎮ
１.３ 序列测定及分析
ＰＣＲ 产物经纯化回收ꎬ与 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体连
接ꎬ转化大肠杆菌 ＤＨ５a感受态细胞ꎬ筛选含有目
的片段的重组克隆送北京博尚生物技术公司进行
序列测定ꎮ 将所得 ＤＮＡ 序列输入 ＧｅｎＢａｎｋ 进行
Ｂｌａｓｔ 检索ꎬ选择并下载相应序列ꎬ采用 ＤＮＡ￣
ＳＴＡＲ、ＤＮＡＭＡＮ 和 ＭＥＧＡ５ 软件进行序列分析ꎬ
并构建系统进化树ꎬ采用 ｐＤＲＡＷ３２软件进行模拟
ＲＦＬＰ分析ꎮ
２ 结果与分析
２.１ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因和 ｒｐ 基因 ＰＣＲ 扩增结果及
序列分析
对山东省 １１ 个枣疯病植原体样品利用引物
Ｒ１６ｍＦ２ / Ｒ１６ｍＲ１进行 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因 ＰＣＲ 扩增
和测序ꎬ结果表明ꎬ １１ 个样品均扩增得到了
１ ４３２ ｂｐ的核苷酸序列ꎬＪＷＢ￣ＺＹ和 ＪＷＢ￣ＪＹ的 Ｇ＋
Ｃ含量为 ４６.１％、ＪＷＢ￣ＬＹ和 ＪＷＢ￣ＺＱ的 Ｇ＋Ｃ含量
为 ４６.２％ꎬ其余均为 ４６％ꎮ 将 １１ 个样品的序列与
已经报道的河南枣疯病( ＪＷＢ￣Ｈｅｎａｎꎬ ＦＪ４４５３８９)、
４１１
２期 陈 妮ꎬ等:山东省枣疯病植原体的鉴定及分子变异分析
北京香山枣疯病(ＪＷＢ￣Ｘｉａｎｇｓｈａｎꎬ ＦＪ５７３２２９)和陕
西枣疯病(ＪＷＢ￣Ｓｈａｎｘｉꎬ ＤＱ９１９０６０)３ 个地区的枣
疯病的 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列利用 ＭｅｇＡｌｉｇｎ 软件分
析ꎬ结果表明 １４ 个地区的枣疯病的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基
因序列同源性在 ９９.２％ ~ １００％之间(表 １)ꎮ １１ 个
样品的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中已登陆
的 １６ＳｒＶ组(榆树黄化组)各亚组(Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ)
典型植原体、亚洲和国内其他地区枣疯病植原体样
品的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 的核苷酸序列进行比对并构建系
统发育树(图 １)ꎬ结果表明枣疯病植原体与 １６ＳｒＶ￣
Ｂ亚组处于同一分支ꎬ不同来源的枣疯病植原体序
列相似性与地理位置有一定相关性ꎬ来源于日本和
韩国的序列相似性差异较小ꎬ聚在一起ꎬ山东省 １１
个聚为一簇ꎬ与北京香山的枣疯病植原体序列相似
性最为接近ꎬ来源于不同枣树品种的河北枣疯病植
原体也基本聚在一起ꎮ
利用引物对 ｒｐＦ２ / ｒｐＲ２ 进行 ＰＣＲ 扩增了 １１
个样品的 ｒｐ基因ꎬ均扩增得到 １ １９６ ｂｐ 的核苷酸
序列ꎬ包括部分 ｒｐｓ１９ꎬ全部 ｒｐｌ２２ 和 ｒｐｓ３ 基因ꎬ同
源性比对发现得到的 １１个核苷酸序列的同源性在
９９.７％~１００％之间ꎮ 利用得到的序列与已报道的
ｒｐＶ组１２个亚组( Ａ￣Ｍ的 ｒｐ基因序列进行同源
性比对ꎬ构建系统进化树(图 １)ꎬ１１ 个样品与 ｒｐＶ￣
Ｃ 亚组聚为一簇ꎬ并且与同亚组的樱桃致死黄化
(ＣＬＹ５)和桃树黄化印度分离株系(ＰＹ￣Ｉｎ)的亲缘
关系最近ꎬ共聚为一个大的分支ꎮ 利用 ｐＤＲＡＷ３２
软件对 １１ 个枣疯病病原的序列( ｒｐＦ２ / ｒｐＲ２ 引物
对 ＰＣＲ扩增序列)ꎬ参考文献 Ｌｅｅ等[４]的方法利用
ＡｌｕＩ等 ９种限制性内切酶的模拟 ＲＦＬＰ分析ꎬ山东
省 １１ 个枣疯病植原体的酶切图谱一致ꎬ均属于
ｒｐＶ￣Ｃ亚组(图片未列出)ꎮ
单核苷酸多态性分析( ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙ￣
ｍｏｒｐｈｉｓｍｓꎬ ＳＮＰ)分析结果表明ꎬ１１ 个地区枣疯病
植原体核苷酸序列存在以下差异:(１) １６Ｓ ｒＲＮＡ
基因序列之间存在 １ ~ １５ 个碱基差异ꎬ共计 １５ 处
碱基多态位点ꎬ且全为单一变异位点和同义突变ꎬ
莱芜分离物( ＪＷＢ￣ＬＷ)在 １ ４２９ ~ １ ４３１ 处缺失
ＴＡＡ ３个碱基ꎮ 多态位点从 ５′到 ３′的范围内分布
不均匀ꎬ多集中于两端ꎬ从 ５′端至 ６４０位碱基之间ꎬ
有 ８个多态位点ꎬ从 ６４１ 至 １ ２００ 位碱基之间有 ２
个多态位点ꎬ从 １ ２０１ 至 １ ４３１ 位碱基之间有 ５ 个
多态位点ꎻ(２) ｒｐ 基因序列之间存在 １ ~ ５ 个碱基
差异ꎬ共计 ５ 处碱基多态位点且全为单一变异位
点ꎬ其中 ４(２２２、１ １２０、１ １２３、１ １３８)处为非同义突
变ꎬ多态位点也大多集中在 ５′和 ３′附近(表 ２)ꎮ
Ｔａｂｌｅ １ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ(％) ｏｆ １４ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｏｆ ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ｂｒｏｏｍ
Ｉｓｏｌａｔｅ ＢＳ ＪＹ ＬＫ ＬＷ ＬＹ ＮＹ ＰＹ ＺＱ ＺＹ ＺＺ ＴＳ Ｓｈａｎｘｉ Ｘｉａｎｇｓｈａｎ Ｈｅｎａｎ
ＢＳ １００ ９９.９ １００ １００ ９９.９ １００ １００ ９９.８ ９９.９ ９９.９ ９９.９ ９９.５ １００ ９９.９
ＪＹ １００ ９９.９ ９９.９ ９９.７ ９９.９ ９９.９ ９９.７ ９９.８ ９９.７ ９９.７ ９９.４ ９９.９ ９９.８
ＬＫ １００ １００ ９９.９ １００ １００ ９９.８ ９９.９ ９９.９ ９９.９ ９９.５ １００ ９９.９
ＬＷ １００ ９９.９ １００ １００ ９９.８ ９９.９ ９９.９ ９９.９ ９９.５ １００ ９９.９
ＬＹ １００ ９９.９ ９９.９ ９９.７ ９９.８ ９９.７ ９９.７ ９９.４ ９９.９ ９９.８
ＮＹ １００ １００ ９９.８ ９９.９ ９９.９ ９９.９ ９９.５ １００ ９９.９
ＰＹ １００ ９９.８ ９９.９ ９９.９ ９９.９ ９９.５ １００ ９９.９
ＺＱ １００ ９９.７ ９９.６ ９９.６ ９９.３ ９９.７ ９９.７
ＺＹ １００ ９９.８ ９９.８ ９９.４ ９９.９ ９９.９
ＺＺ １００ ９９.７ ９９.４ ９９.９ ９９.８
ＴＳ １００ ９９.４ ９９.９ ９９.８
Ｓｈａｎｘｉ １００ ９９.５ ９９.４
Ｘｉａｎｇｓｈａｎ １００ ９９.９
Ｈｅｎａｎ １００
５１１
植物病理学报 ４５卷
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｌｏｃｉ ｉｎ １６Ｓ ｒＲＮＡꎬ ｒｐ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
Ｉｓｏｌａｔｅ
Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ
１６Ｓ ｒＲＮＡ ｒｐ
３８ ５７ １３７ ２５５ ２７７ ３４３ ３６１ ４１５ ６５０ ８２４ １２１２ １３６８ １４２９ １４３０ １４３１ １５１ ２２２ １１２０ １１２３ １１３８
ＢＳ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ
ＪＹ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ
ＬＫ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ
ＬＷ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ / / / Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ
ＬＹ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ｔ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ
ＮＹ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ
ＰＹ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ
ＺＱ Ｔ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ
ＺＹ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ Ｔ
ＺＺ Ｔ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｃ
ＴＳ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ
Ｆｉｇ. １ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ ( ｌｅｆｔ) ａｎｄ ｒｐ (ｒｉｇｈｔ) ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｊｕｊｕｂｅ
ｗｉｔｃｈｅｓ’ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ
Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｓｈｏｗｎ ｏｎ ｂｒａｎｃｈｅｓ (１ ０００ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ)ꎻ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ ａｒｅ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓꎬ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ.
６１１
２期 陈 妮ꎬ等:山东省枣疯病植原体的鉴定及分子变异分析
２.２ ｓｅｃＹ和 ｓｅｃＡ基因 ＰＣＲ扩增结果及序列分析
利用 ＦＤ９ｆ / ｒ引物对ꎬ对山东省 １１个枣疯病植
原体样品进行扩增ꎬ均得到 １ ４２１ ｂｐ 的特异片段ꎬ
经分析该序列包括部分核糖体蛋白基因 ｒｐｌ１５ 和
部分 ｓｅｃＹ基因ꎬ其中 ｓｅｃＹ基因长度为 １ ２１１ ｂｐꎬ共
编码 ４０３个氨基酸ꎮ １１个样品的 ｓｅｃＹ基因同源性
在 ９９.６％ ~ １００％之间ꎮ 与植原体榆树黄化组的
ｓｅｃＹ基因序列共同构建系统进化树(图 ２)ꎬ山东省
枣疯病植原体与 ｓｅｃＹ Ｖ￣Ｃ亚组的典型成员同为枣
疯病的 ＪＷＢ(ＡＹ１９７６９５)聚为一支ꎬ且与 ｓｅｃＹ Ｖ￣Ｂ
亚组的樱桃致死黄化(ＣＬＹ５)和 ｓｅｃＹ Ｖ￣Ｍ亚组的
桃树致死黄化印度分离株系(ＰＹ￣Ｉｎ)的亲缘关系
最近ꎮ
利用引物 ＳｅｃＡｆｏｒ１ / ＳｅｃＡｒｅｖ３ 对山东省 １１ 个
枣疯病样品进行 ＰＣＲ 扩增得到 ｓｅｃＡ 基因的部分
序列约 ８００ ｂｐ 的特异片段ꎬ结果表明该序列片段
长 ８３６ ｂｐꎬ编码 ２７０个氨基酸ꎬ１１ 个枣疯病植原体
样品的 ｓｅｃＡ基因同源性在 ９９.３％ ~ １００％之间ꎬ基
于 ｓｅｃＡ 基因构建系统进化树(图 ２)ꎬ枣疯病植原
体株系与 １６ＳｒＶ 组典型成员 ＵＬＭ(ＥＵ１６８７４１)聚
为一个进化分支ꎮ
ｓｅｃＹ基因序列之间存在 １~ １６ 个碱基差异ꎬ共
计 １６处碱基多态位点ꎬ包括 １１个单一变异位点和
５个简约信息位点ꎬ其中在单一变异位点中存在 ２
个(８６７ꎬ１ ３８６)非同义突变ꎬ多态位点从 ５′到 ３′的
范围内分布不均匀ꎬ从５′端至４００位碱基之间ꎬ有
Ｆｉｇ. ２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｃＡ( ｌｅｆｔ)、ｓｅｃＹ (ｒｉｇｈｔ)ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ｂｒｏｏｍ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ
Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｓｈｏｗｎ ｏｎ ｂｒａｎｃｈｅｓꎻ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ ａｒｅ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓꎬｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ.
７１１
植物病理学报 ４５卷
Ｔａｂｌｅ ３ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｌｏｃｉ ｉｎ ｓｅｃＡꎬ ｓｅｃＹ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
Ｉｓｏｌａｔｅ
Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ
ｓｅｃＡ ｓｅｃＹ
３ １５ １１１ ２５２ ６０７ ７２８ ７３２ ８３１ ５８ ６８ １８４ ２１１ ３６２ ５０１ ５２２ ５５８ ５８５ ６０７ ６１１ ８３３ ８６７ ９１２ ９１７ １３８６
ＢＳ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｃ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ
ＪＹ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ
ＬＫ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｇ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ
ＬＷ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ
ＬＹ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ
ＮＹ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ
ＰＹ Ｇ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ
ＺＱ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ
ＺＹ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ
ＺＺ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ
ＴＳ Ｇ Ａ Ｎ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ
５个多态位点ꎬ从 ４０１至 ８００ 位碱基之间有 ８ 个多
态位点ꎬ从 ８０１至 １ ４２０位碱基之间有 ３ 个多态位
点ꎻｓｅｃＡ基因序列之间存在 １~８处碱基差异ꎬ共计
８处碱基多态位点ꎬ包括 ６ 个单一变异位点和 ２ 个
简约信息位点ꎬ其中在单一变异位点中存在 ３ 个
(１１１、 ６０７、 ７２８)非同义突变ꎬ多态位点从 ５′到 ３′
的范围内分布不均匀ꎬ从 ５′端至 ４８０ 位碱基之间ꎬ
有 ４个多态位点ꎬ从 ４８１至 ８３５位碱基之间有 ４ 个
多态位点(表 ３)ꎮ
３ 讨论
目前ꎬ枣疯病植原体的分子检测与鉴定主要根
据 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因的序列作为首选标记ꎮ 通过对
山东省 １１个地区的枣疯病植原体的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基
因的分析ꎬ结果表明ꎬ枣疯病植原体属于 １６ＳｒⅤ￣Ｂ
亚组ꎬ与 Ｗａｎｇ 等[９]、Ｘｕ 等[１０]和 Ｚｈｕ 等[７]报道的
国内不同地区枣疯病植原体的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 的结果
一致ꎬ东亚的日本、韩国枣疯病植原体也同属于该
亚组[４]ꎮ 多态性位点的分布多集中于 ５′和 ３′两
端ꎬ这一点与 Ｘｕ 等[１０] 的报道类似ꎮ Ｓｅｅｍüｌｌｅｒ
等[１４]认为 １６ＳｒＶ组的植原体有一定的地理分布特
点ꎬＸｕ等[１０]和 Ｈａｎ 等[１５]根据对我国各地不同枣
树品种上的枣疯病植原体分子变异分析也表明ꎬ虽
然各地区间枣疯病植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列遗传距
离很小ꎬ但仍有一定的地理分布特点ꎬ虽然这种划
分并不十分严格ꎮ 本研究对 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列的分
析也表明ꎬ虽然国内不同地区的枣疯病植原体在聚
类分析上显示根据地理位置较集中于某一个分支ꎬ
但也有同一地区枣疯病植原体分布到不同分支的
情况出现ꎬ考虑到国内种苗调运非常频繁ꎬ这种情
况的出现也很正常ꎮ
山东省 １１个菌株的 ｒｐ 基因和 ｓｅｃＹ 基因都与
同亚组的樱桃致死黄化(ＣＬＹ５)和桃树黄化印度
分离株系(ＰＹ￣Ｉｎ)最接近ꎬ亚组归属也一致ꎮ Ｗｕ
等[１６]对陕西枣疯病植原体的 ｒｐ 基因的序列分析
和 Ｘｕ等[１０]对多个地区枣疯病植原体 ｓｅｃＹ基因的
序列分析也得出类似的结论ꎮ Ｌｅｅ 等[４]利用 ｒｐ 基
因和 ｓｅｃＹ基因分别将榆树黄化组(１６ＳｒⅤ)划分为
１２个 ｒｐ 亚组和 １３ 个 ｓｅｃＹ 亚组ꎬ目前尚没有针对
国内枣疯病植原体的 ｒｐ 基因和 ｓｅｃＹ 基因进行亚
组划分的分析ꎮ 本研究根据 Ｌｅｅ 所建立的分类体
系ꎬ通过系统进化树分析结合 ＲＦＬＰ分析ꎬ确定山东
省 １１ 个枣疯病植原体样品均归属于 ｒｐⅤ￣Ｃ、ｓｅｃＹ
Ⅴ￣Ｃ亚组ꎬ这也是首次确定中国枣疯病植原体 ｒｐ
亚组和 ｓｅｃＹ亚组的归属ꎮ 与 １６ｓ ｒＲＮＡ 基因的碱
基突变都为同义突变不同ꎬｒｐ 基因的碱基多态性
位点多为非同义突变ꎬ多态位点的分布与 １６ｓ
ｒＲＮＡ基因一样多集中于 ５′和 ３′附近ꎮ ｓｅｃＹ 基因
８１１
２期 陈 妮ꎬ等:山东省枣疯病植原体的鉴定及分子变异分析
的碱基序列的变异性比 １６ｓ ｒＲＮＡ 基因大ꎬ非同义
突变所占比例高ꎬ其突变位点多集中于序列的前中
部ꎬ与 Ｘｕ等[１０]报道的多集中于中部的结论类似ꎮ
Ｈｏｄｇｅｔｔｓ等[２]研究证明 ｓｅｃＡ 基因可以用于植
原体的分类ꎬ并且变异相对较大ꎬ更有利于亲缘关
系较近的亚组的划分ꎬ但并未建立系统的分类体
系ꎮ 本研究首次扩增得到枣疯病植原体的 ｓｅｃＡ 基
因ꎬ这也是 １６ＳｒⅤ￣Ｂ成员 ｓｅｃＡ基因的首次报道ꎬ基
于 ｓｅｃＡ基因构建系统进化树ꎬ结果分析表明枣疯
病植原体属于 １６ＳｒⅤ组ꎬ与已报道的结果一致ꎬ进
一步证明 ｓｅｃＡ 基因可以用于植原体的分类研究ꎬ
但基于 ｓｅｃＡ基因的具体分类地位还需要进一步的
研究ꎮ
枣疯病是枣树上危害最严重的病害之一ꎬ山东
是国内重要的枣产区ꎬ本研究对山东省 １１ 个重要
枣产区的枣疯病植原体病害样品进行了分子鉴定ꎬ
确定了其在 １６ｓ ｒＲＮＡ、ｒｐ及 ｓｅｃＹ各基因水平的归
属并分析了其核苷酸多态性ꎬ为研究枣疯病植原体
的遗传变异及致病机理奠定了一定的基础ꎮ
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责任编辑:李晖
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