全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(1): 84-87(2012)
收稿日期: 2010-09-24; 修回日期: 2011-10-15
基金项目: 广东省科技攻关项目(2008B020100004); 公益性行业(农业)科研专项(201003031)
通讯作者: 周国辉,教授,主要从事植物病毒及病毒病害研究; Tel: 020-85280306, E-mail: ghzhou@scau. edu. cn。
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췍研究简报
南方水稻黑条矮缩病毒一步双重
RT-PCR检测技术及其应用
王 强, 周国辉*, 张曙光
(华南农业大学资源环境学院, 广州 510642)
Detection of Southern rice black-streaked dwarf virus using one-step dual RT-PCR
WANG Qiang, ZHOU Guo-hui, ZHANG Shu-guang　 (College of Resources and Enviroment, South China Agricul-
tural University, Guangzhou 510642, China)
Abstract: An one-step dual RT-PCR method was developed for Southern rice black-streaked dwarf virus
(SRBSDV) detection from host plants and insect vector white-backed planthopper (Sogatella furcifera Hor-
vath, Hemiptera: Delphacidae), from which two cDNA fragments of the viral genome S5 and S10 were am-
plified simultaneously. Two primer pairs, S5-F1 / S5-R2 (5′-ttacaactggagaagcattaacacg-3′ / 5′-atgaggtattgcgta-
actgagcc -3′) and S10-oF / S10-oR (5′-cgcgtcatctcaaactacag -3′ / 5′-tttgtcagcatctaaagcgc -3′), were selected
from 40 primer pairs based on SRBSDV genome sequences, and amplified viral S5 ORF1 fragment (819 bp)
and cp gene fragment ( 682 bp), respectively. Using total RNA extracts from infected plant leaf tissue or in-
dividual planthopper adult as templates, one step RT-PCR reaction in the conditions of annealing temperature
of 53℃ with the final concentrations of 240 nmol / L S5-F1 / S5-R2 and 120 nmol / L S10-oF / S10-oR generated
a similar yield of two amplicons in argrose electrophoresis analysis. Sequence analysis confirmed the correct
result of the amplification. Additionally, several commercal RNA extraction kits was proven to be fit for the
template preparation, and the protocol for total RNA extraction from plant leaf tissue and individual planthop-
per was simplified by sample grinding direct in eppendorf tube. This method can be used for SRBSDV detec-
tion of dried or 70% alcochol soaked planthopper samples stored over one month in room temprature.
Key words: Southern rice black-streaked dwarf virus; Sogatella furcifera Horvath
文章编号: 0412-0914(2012)01-0084-04
　 　 南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-
streaked dwarf virus, SRBSDV)是呼肠孤病毒科
(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的一个建议新
种[1 ~ 3],自然条件下,主要经白背飞虱 ( Sogatella
furcifera Horvath)传播侵染水稻、玉米、薏米、稗
草、白草和水莎草等[2]。 2009 年,该病毒在越南北
部 19 个省和我国南部 9 个省区流行成灾,超过
300 000 hm2 单季稻和晚稻受害,约 6 500 hm2 水
稻失收[4]。
白背飞虱以持久性方式传播 SRBSDV [2],病
毒可在虫体内增殖,虫体一旦获毒,即终身带毒。
该虫是一种典型的迁飞性害虫,其主要越冬基地为
西南半岛及海南岛,每年早春随西南气流不断北
迁,秋季再随东北气流南回[5]。 对于我国广大稻
　
　 1 期 　 　 王 强,等:南方水稻黑条矮缩病毒一步双重 RT-PCR检测技术及其应用
区,SRBSDV初侵染源主要为春季迁入的带毒白
背飞虱,病毒在早季稻或其他寄主植物上扩繁后,
再经白背飞虱传播侵染单季稻或晚季稻秧苗及分
蘖期稻株,造成严重为害[4]。 白背飞虱的带毒率
及早春寄主植物的感病率是我国单季稻及晚季稻
病害发生程度预测的重要依据,建立快速有效的
SRBSDV检测方法,十分必要。 本文报道一种基
于一步双重 RT-PCR的 SRBSDV 快速检测技术以
及应用该技术对多种寄主植物和白背飞虱的检测
结果。
1　 材料与方法
1. 1　 植物材料及其采样方法
感染 SRBSDV 的水稻和玉米植株采自海南
省,定植保存于防虫温室中。 供检疑似感病寄主植
物包括水稻、玉米、薏米和稗草,采自海南省、广东
省、湖南省和安徽省,整株拔起田间疑似感病植株,
保持鲜活,2 ~ 3 d 内带回或邮寄至实验室,取幼嫩
叶组织立即检测或保存于 -20℃冰箱待检。
1. 2　 白背飞虱及其保存方法
供试带毒白背飞虱为温室内感病水稻植株上
扩繁的人工种群。 供检白背飞虱为 2010 年 4 月采
自广州郊区 4 ~ 5 叶期稻田入侵代长翅成虫,虫体
自然风干后密封保存于小型容器(1. 5 mL 离心
管)或浸泡保存于 70%酒精溶液中待检。
1. 3　 样品总 RNA提取
分别采用下列试剂盒抽提样品总 RNA:RNA
分离试剂盒 I(洛阳华美生物工程公司)、RNA Rea-
gant(广州美津生物公司)、TaKaRa RNAiso Rea-
gent(宝生物工程(大连)有限公司)及 H. Q. &. Q.
溶液型 RNA抽提试剂盒(安徽优晶生物工程有限
公司)。 对于植物样品,取新鲜或冷藏的幼嫩叶组
织 50 ~ 100 mg,于研钵中加液氮研磨成粉状,加入
1 mL RNA 抽提液,稍做研磨后,溶液转入 1. 5 mL
离心管中;对于白背飞虱样品,取单头虫体,置于
1. 5 mL 离心管中,加入 200 μL RNA 抽提液,用适
当粗细的玻棒或竹签将虫体充分捣碎;此后的操作
按试剂盒说明进行。 RNA 抽提物溶于 100 μL
DEPC处理的 ddH2O中,作为 RT-PCR 模板(保存
于 -20℃)。
1. 4　 RT-PCR检测
1. 4. 1　 SRBSDV特异引物的设计　 根据 GenBank
中公布的 SRBSDV 广东分离物(GD)及海南分离
物 ( HN ) S5 ( FN563987, FN563993 ) 和 S10
(EU784840, EU523360)序列设计 2 对引物,S5-
F1 / S5-R2 ( 5′-ttacaactggagaagcattaacacg-3′ / 5′-at-
gaggtattgcgtaactgagcc-3′ 和 S10-oF / S10-oR ( 5′-
cgcgtcatctcaaactacag-3′ / 5′-tttgtcagcatctaaagcgc-3′),
预期扩增产物分别为病毒基因组 S5 ORF1 3′区段
和 S10 病毒外壳蛋白编码区,大小为 819 bp和 682
bp。
1. 4. 2　 一步法双重 RT-PCR扩增　 采用 One Step
RT-PCR Kit(宝生物工程(大连)有限公司)对样品
总 RNA抽提物进行扩增。 反应总体积 20 μL,内
含样品总 RNA抽提物溶液 1 μL,其他各组份参照
试剂盒说明。 对各引物终浓度为 60、120、180、240
nmol / L及其不同组合反应体系的扩增效果进行比
较,确定最佳引物浓度。 反应程序为 50℃反转录
30 min;94℃预变性 3 min;94℃变性 30 s,53℃退
火 30 s,72℃延伸 50 s,35 个循环;72℃延伸 10
min。 反应结束后,取 5 μL 反应产物,经 1. 2%琼
脂糖凝胶电泳,Goldview(广州威佳生物工程有限
公司)染色,在 UVP凝胶成像系统中观察并照相。
1. 5　 RT-PCR产物测序及序列分析　
将 RT-PCR产物稀释 50 倍,取 1 μL 为模板,
以 S10-oF / S10-oR为引物,进行 50 μL体积的 PCR
反应。 将产物送至北京奥科生物技术公司进行测
序。 测序结果在 NCBI 网站 ( http: / / blast. ncbi.
nlm. nih. gov / Blast. cgi)上进行 BLAST比对。
2　 结果与分析
2. 1　 引物及其工作浓度筛选
本研究根据 SRBSDV 基因组全序列,设计了
40 对引物(结果未显示),从中筛选到 2 对最佳引
物:S5-F1 / S5-R2 和 S10-oF / S10-oR,2 对引物扩增
产物电泳条带单一明亮,大小分别为 819 bp和 682
bp,适于组合建立双重 RT-PCR以提高检测的准确
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植物病理学报 42 卷
性。 在双重 RT-PCR 中,S5-F1 / S5-R2 和 S10-oF /
S10-oR终浓度分别为 240 nmol / L 和 120 nmol / L
时,扩增的 2 个目标产物在琼脂糖凝胶电泳中条带
亮度基本一致(图 1、图 2)。
2. 2　 植株组织中 SRBSDV检测
采用引物对 S5-F1 / S5-R2 和 S10-oF / S10-oR
一步法双重 RT-PCR 可特异性地检测到新鲜及冷
藏水稻叶组织中的 SRBSDV,得到同预期大小相符
的 2 条 DNA 片段(图 1)。 在我国境内广东省(包
括雷州、遂溪、阳西、汕尾、翁源和广州)、广西壮族
自治区北海市和柳州市、海南省三亚市和万宁市、
湖南省长沙市、安徽省合肥市和安庆市以及越南等
地田间采集的水稻、玉米、薏米及稗草等发病植物
叶组织样品中检测到 SRBSDV。
2. 3　 单头白背飞虱体内 SRBSDV检测
采用上述一步双重 RT-PCR 可检出干燥或
70%酒精浸泡保存 1 个月的白背飞虱单头虫体内
的 SRBSDV,尽管部分样品扩增产物产率有所降
低,但能够满足电泳结果判定的要求,而且 2 个扩
增产物的显示,增大了结果判定的可靠性。 图 2 显
示了室内病株上扩繁的第 2 代白背飞虱成虫,干燥
保存及酒精浸泡保存 1 个月后带毒率检测结果,阳
性率约 57% (12 / 21);多次从田间病株或室内保存
毒源植株上采集扩繁 2 代白背飞虱成虫,带毒率检
测结果均为 60% ~ 70% ,说明虫体干燥或酒精浸
泡保存对病毒检测不产生明显的影响。 对 2010 年
4 月 13 日和 4 月 22 日广州郊区早稻田中入侵的
长翅白背飞虱成虫进行 SRBSDV 检测,阳性率分
别为 5. 36% (3 / 56)和 8. 33% (8 / 96)。
Fig. 1　 Dual RT-PCR detection for SRBSDV from leaf tissue of rice plants
M: DNA marker;1: Fresh infected plant; 2: Fresh healthy plant; 3,4: Frozen infected plants;
5,6: Frozen heathy plants; 7-13: Field infected samples.
Fig. 2　 Dual RT-PCR detection for SRBSDV from individual white-backed planthopper adults
M: DNA marker; " + " : SRBSDV positive; " - " : SRBSDV negative.
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　 1 期 　 　 王 强,等:南方水稻黑条矮缩病毒一步双重 RT-PCR检测技术及其应用
2. 4　 PCR产物序列比对
将一步双重 RT-PCR 产物稀释 50 倍后,以引
物对 S10-oF / S10-oR 进行 PCR 扩增,可得到单一
的 682 bp 目的条带(图片未显示),PCR 产物直接
测序后经 BLAST 比对,结果表明,上述多地水稻、
玉米及白背飞虱样品中获得的 RT-PCR 产物核甘
酸序列(病毒外壳蛋白编码区)同 SRBSDV 海南分
离物(EU523360)及广东分离物(FN563993)的同
源性均高于 98% ,而同水稻黑条矮缩病毒 (Rice
black-streaked dwarf virus, RBSDV)各分离物的同
源性均低于 83% 。
3　 结论与讨论
本文报道了一种用于植物叶组织及单头白背
飞虱虫体内 SRBSDV 快速检测的一步双重 RT-
PCR方法,对于熟练的操作人员,一天内能完成约
100 个样品的检测,为该病毒的流行监测提供了技
术保障。 试验证明,该方法不但能检出新鲜寄主植
物和白背飞虱单头虫体内的病毒,而且还能检出干
燥保存或 70%酒精浸泡保存的白背飞虱虫体中的
病毒,使该技术在生产中的应用更为便利。 本研究
采用的双重 RT-PCR 能使一个阳性样品在一次反
应中产生 2 条清晰可辨的电泳条带,可有效地减小
实际操作中因电泳条带太弱或非特异产物的干扰
而造成的结果判定困难,尤其是对白背飞虱样品的
检测,这一点显得更为突出。
由于 SRBSDV 仅分布于寄主植物的韧皮部,
病株体内病毒含量很低,且病毒粒体为球状,外壳
蛋白极不稳定,提纯十分困难,难以获得足量纯化
的病毒抗原用以制备血清学检测所需的抗体。 曾
有研究者采用原核表达技术分别制备了与 SRBS-
DV同属的 RBSDV P8 蛋白、P9 蛋白及外壳蛋白多
克隆抗体,但都因病毒粒体特性(由多种结构蛋白
组成)以及抗血清效价和特异性较低等问题未能在
生产上广泛应用。 因此,近期内 SRBSDV 的检测
将以分子生物学技术为主。
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[2] 　 Zhou G H, Wen J J, Cai D J, et al. Southern rice
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责任编辑:于金枝
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