全 文 ：书西北植物学报!
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&修改稿收到日期$!"#$*"!*"+
基金项目$国家自然科学基金" %"+""#& # 作者简介$苏
!
杰"
#1&%(
#!女!硕士!讲师!主要从事植物生物化学与分子生物学研究
2*34.5
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"
通信作者$王瑞刚!博士"后#!教授!博士生导师!主要从事植物生物化学与分子生物学研究 过表达 12!+"$
基因对拟南芥根长
及
%&%
与糖响应的影响
苏
!
杰#!!郭荣起%!姜树原+!邸
!
娜$!李国婧!!王瑞刚!" " # 内蒙古农业大学职业技术学院!内蒙古土右旗 "#+#"1 & ! 内蒙古农业大学 生命科学学院!呼和浩特 "#""#& & % 内蒙古呼伦贝 尔市农业科学研究所!内蒙古牙克石 #!$"
&
+
包头医学院中心实验室!内蒙古包头
"#+"+"
&
$河套学院!内蒙古临河 "#$"""
#
摘
!
要$为初步探讨液泡 : ; *<=>4/78 亚基基因" !"#$%#
#在植物生长发育及信号转导中的作用!该实验构建了
拟南芥
!"#$%# 的过表达载体!转化并获得转基因拟南芥纯合株系!通过半定量 ?=*>@? 技术分析了 !"#$%#
的
表达量!然后对其进行暗培养)
和糖处理结果显示$" # #该实验获得 ) 个 = ! 代转基因纯系!其 3?B< 表达水 平均高于野生型!表明过表达载体的构建是有效的" ! #黑暗条件下! 个拟南芥 !"#$%#
过表达纯合株系的根长
变短"
%
#光照条件下!
+
个转基因株系主根伸长和子叶的展开以及
)
个转基因株系的种子萌发对
的抑制不
敏感"
+
#分别有
$个和 + 个转基因株系的种子萌发对葡萄糖和蔗糖的抑制不敏感推测 !"#$%#
可能参与了
和糖介导的信号转导途径!并可能影响了拟南芥根细胞的扩展
关键词$拟南芥& !"#$%#
&过表达&暗培养&
&糖
中图分类号$C)&$
&
C)&1
文献标志码$< (()*+",-""+.), / +0 ! -)1 2 ",1)1+"%&%3,!45 / 36 7 8 9:)6); 2 6)11#, / !($3-.&
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液泡
:
;
*<=>4/7
"
Q*<=>4/7
#!最早发现于液
泡!存在于真核细胞各种分泌系统膜上*#+!是一种由
#%
个亚基组成的寡聚酶!分
Q
#
和
Q
"
!
个结构域
Q
#
域突出膜外!由
<
"
:
共
&
个亚基构成
Q
"
域镶
嵌于膜内!由
4
)
8
)
8`
)
7
和
S
共
$个亚基组成*!+ 在对 Q*<=>4/7 各亚基的研究中! 8 亚基倍受 关注!它与酵母的 Q34% 和 [*<=>4/7 的 8 亚基同 源*#+它的分子量约为 #ZN !是形成膜 Q " 域的主 要组件&同时!它是质子转运的通道!与 : ;转运有 关 *%*++此外! 8 亚基对 Q # *Q " 的装配也是必不可 少的缺少 8 亚基时!酵母突变体能够合成 Q # 域! 但不能被组装到膜上此外! 8 亚基是细胞通讯中 间隙联结的部分!是神经递质释放介导体的组分!也 是某种罕见的病毒癌基因产物的靶蛋白*%+这些结 果表明 8 亚基在细胞信号转导过程中起重要作用 拟南芥" #&()*+ , -)-./0)1 # Q*<=>4/7 的 8 亚 基 属 于 多 基 因 家 族 " !"#$%
#!由
!"#$%#
"
I
%+)!"
#)
!"#$%!
"
I
#11#"
#)
!"#$%%
"
I
%&1!"
#)
!"#$%+
"
I
)$%" #和 !"#$%$
"
I
#$#" #共$
个同源基因编码!它们编码的脂质
蛋白分子量约为
#ZN
*
!
!
+
+
研究表明!光照)外源激
素和营养等非生物胁迫与拟南芥
Q*<=>4/78
亚基
基因表达调节有关邸娜*$+证实 !"#$%
基因对外
源激素)高盐)渗透胁迫及水分胁迫有响应
>4S*
3404X40
等*+的研究表明!
"#$% 基因对细胞扩增 起重要作用!尤其对根冠作用更加明显郭荣起*)+ 研究发现 !"#$%#
沉默纯合体的根和下胚轴长度
短于对照于秀敏等*&+的研究也揭示
!"#$%! ) !"#$%%
和
!"#$%$
均可被
+a
低温和光照促进表
达这些结果都证明了拟南芥
Q*<=>4/78
亚基在
植物响应非生物胁迫过程中可能具有重要作用
为了更深入地了解拟南芥
!"#$% 基因的功 能!本实验构建了 !"#$%#
基因的过表达载体转化
野生型拟南芥!并对
!"#$%#
基因的过表达纯合体
进行了暗培养)
处理和糖处理!为进一步探明
!"#$% 基因在植物非生物胁迫方面的抗性机制提 供了初步的理论依据 # ! 材料和方法$,$! 材 ! 料 拟南芥野生型 @9563X.4 生态型" @95*" #由内蒙 古农业大学植物分子生物学实验室提供培养条 件$
!!a
!
#L
光照%
&L
黑暗!相对湿度约
"b

$,> ! 方 ! 法$?>?$! 12!+"$
基因过表达载体的构建及农杆菌
转化
!
采用
@=法*1+提取拟南芥基因组
NB<

然后以拟南芥基因组
NB<
为模板!扩增
!"#$%# 目的片段! >@? 引物的设计为$8#*H*c
0
"
$d*GG*
=<@@=@#和
%8#*
H*D45
"
$d*G=@G<@====GG==@@@G<=G<=<* @<*%d #为了方便构建 !"#$%#
基因的表达载体!
在
!
条引物的
$d* 端分别引入了 3 , 1 # 和 40 # 的 酶切位点 >@? 反应条件为$
1&a
预变性
#3.0
&
然后
1&a
变性
#"/
!
$&a 退火 %"/ ! )!a 延伸 ! 3.0 !共 %" 个循环&最后 )!a 延伸 3.0 将 >@? 产物纯化和凝胶回收!再连接到 GV* = 载体"天根公司#进行测序测序证明序列正确 后!利用 3 , 1 # 和 40 # 酶切 GV*=*8# 载体获得 目的片段!与利用相同酶切的 @:[% 载体连接并 转化大肠杆菌 N:$
$!获得目标过表达载体 @:[%* 8# 将过表达质粒载体 @:[%*8# 用电击法*#"+转 化到农杆菌 GQ%#"# 细胞中!取$"
%
O
转化产物涂
于含
!$% I % 3OG70R 和 #"" % I % 3OD 78R 固体培养 基上! &a 培养 % " +&L !筛选阳性克隆$,>,>
!
拟南芥的转化及转基因纯合体的获得
!
拟
南芥的转化采用浸花法*##+!转化后将植株在正常条
件下继续培养
%
"
+
周!收取成熟种子将种子播种
于含
%"
%
I
%
3Oc40
的
#
%
!VD
选择培养基中!
!
a
培养!
#"
"
#!S
后挑选阳性植株!待其成熟后分
单株收取种子"
=
#
代#&
=
#
代种子按单株种于含
%"
%
I
%
3Oc40
的选择培养基上!选择有
%e#
性状分
离的株系!将绿苗移至蛭石上培养!单株收取种子
"
=
!
代#&
=
!
代种子按单株在含
%"
%
I
%
3Oc40
的
培养基上继续筛选!不再分离的即为纯合体株系!用
于本次实验的各项分析
$?>?@ ! 12!+"$
转基因植物半定量
-ABCD-
鉴定
!
提取野生型和过表达转基因纯合体拟南芥的总
?B<
*
#!
+
!参照
=4Z4?4
公司反转录试剂盒说明书反
转录得到
8NB<
再以
8NB<
为模板!对
%.)1
"
I
#!##"
#和
!"#$%# 基因进行 >@? 扩增! %.)1 引物为 48R.0*?=*[ "$d*<=GG@&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
<@<==@#和
48R.0*?=*?
"
$d*G<=@@=G=GG<@=<==G<*%d
#!
"#$%# 引物为 8#* ?=*[ "$d*G<===<@=@@G<@*%d
#和
8#*?=*?
"
$d*=@@=<@<<=<*
#半定量
?=*>@?
反应条件$1+a 预变性$3.0
&然后!
1+a
变性
%"
/
!
$"a 退火 %"/ ! )!a 延伸 1"/ !$
个循环&最后
)!a
延伸
$3.0 * + 将 >@? 产物于 #,$b
琼脂糖凝
胶电泳!凝胶成像分析"
D
M
0
I
707
公司凝胶成像仪#
$?>?E ! 12!+"$
转基因纯合体的暗培养
!
转基因
纯合体和野生型拟南芥种子同时种在
#
%
!VD
*
#%
+培
养基上!暗培养
$S 后!统计根的长度*+$?>?F
!
不同浓度
%&%
处理
12!+"$
转基因纯合体
"
#
#转基因纯合体和野生型拟南芥种子同时种在
#
%
!
VD
培养基中!
+a
春化
%S
!
!a
)
#L
光照%
&L
黑
暗条件下培养
+&L
后!转移至含有不同浓度
")
+
)
&
和
#!
%
395
%
O
#的
#
%
&VD
的方平板上!竖直
放置!
#L
光照%
&L
黑暗培养
+S
!统计主根的
长度
"
!
#转基因纯合体和野生型拟南芥种子同时种
在含有不同浓度
")
",$) # 和 ! % 395 % O #的 # % ! VD 培养基中! +a 春化 %S !再于 !!a ) #L 光照% &L 黑暗条件下培养 !S !统计萌发率*#++$?>?G
!
不同浓度糖处理
12!+"$转基因纯合体 ! 转基因纯合体和野生型拟南芥种子同时种在含有 " ) +b )$b
和
b
蔗糖或葡萄糖的
#
%
!VD
培养基
中!
+a
春化
%S
!再于
!!a
)
#L
光照%
&L
黑暗条
件下培养
%S
!统计其萌发率*#$*#+ ! ! 结果与分析 >?$
!
12!+"$基因过表达载体构建和农杆菌转化 以拟南芥基因组 NB< 为模板!扩增 !"#$%#
基因的目的片段!扩增产物的片段为
#""X
"图
#
#!
>@?
产物与
GV*=
载体连接后!命名重组质粒
为
GV*=*8#
!转化大肠杆菌
N:
挑取白色单菌
落!进行
>@?
扩增及酶切鉴定!送上海生工生物技
术有限公司测序验证目的片段正确后!将阳性质
粒
GV*=*8#
和表达载体
@:[%
用
3
,
1
#
和
40
#
双酶切连接酶切产物获得重组质粒
@:[%*
8#
!转化大肠杆菌
N:
!提取阳性克隆的质粒!进
行
3
,
1
#
和
40
#
的双酶切电泳电泳结果与预期
结果一致"图
!
#由此可见!过表达
!"#$%# 基因 的重组质粒 @:[%*8# 构建成功用电击法将重组 质粒 @:[%*8# 转化农杆菌 GQ%#"# !挑选培养在 含 D 78R 和 G70R 两种抗生素的 OA 固体培养基上的 单克隆!进行菌落 >@? 检测呈阳性!证明重组质粒 @:[%*8# 已经转入农杆菌 GQ%#"# 中 >?> ! 拟南芥 12!+"$
转基因植株的筛选
重组质粒
@:[%*8#
经农杆菌介导转入野生型
拟南芥经筛选获得
=
#
代转基因株系
!!
个!经进
一步筛选!最终获得
)
个
=
!
代转基因纯系"过表达
纯合株系#!这
)
个株系分别为
8#*%*&
)
8#*1*#
)
8#*#%*
%
)
8#*#+*
)
8#*#*+
)
8#*!"*1
)
8#*!*#%

提取野生型"
P=
#拟南芥和
!"#$%# 过表达纯 合体总 ?B< !用半定量 ?=*>@? 进行检测"图 % # 将 P= 的 !"#$%#
转录水平定为
#""b
!过表达纯
合体中
8#*#%*%
和
8#*#+*
的
3?B<
表达水平较
强&
8#*%*&
)
8#*1*#
)
8#*#*+
)
8#*!*#%
的
3?B<
表达
水平居中&
8#*!"*1
的
3?B<
表达水平较弱
图
#
!
!"#$%# 目的片段的 >@? 扩增 V,NO!""" &下同 [. I ,# ! >@?43 5.T.84R.909T!"#$%#
I
707
V,NO!"""
&
=L7/4374/X759]
图
!
!
重组质粒
@:[%*8#
的酶切鉴定
[.
I
,!
!
KS70R.T.84R.909TRL7U7893X.040R
@:[%*8#
54/3.SS.
I
7/R7S].RL3
,
1
#
40S40
#
图
%
!
!"#$%# 转基因纯合体 3?B< 表达水平 P=, 野生型"对照#& # " ) 分别是转基因株系 8#*%*& ) 8#*1*# ) 8#*#%*% ) 8#*#+* ) 8#*#*+ ) 8#*!"*1 ) 8#*!*#% [. I ,% ! =L7RU40/8U. R57W759T!"#$%#
I
707
.0RL79W7U7^
U7//.90RU40/
I
70.8
540R/
P=,P.5SR
M7
"
890RU95
#&
#(),=U40/
I
70.8
540R/
8#*%*&
!
8#*1*#
!
8#*#%*%
!
8#*#+*
!
8#*#*+
!
8#*!"*140S8#*!*#%
!
U7/
78R.W75
M
)&
$期 !!!!!!!!!! 苏 ! 杰!等$过表达
!"#$%#
基因对拟南芥根长及
与糖响应的影响
>?@
!
12!+"$转基因纯合体的根变短 在正常光照培养下" #L 光照% &L 黑暗#! !"#$%#
过表达纯合体与野生型拟南芥未见明显差
异根据
>4S3404X40
等*+研究方法!将
!"#$%# 过表达纯合体和对照种子!暗培养$S
后测量根长
度"图
+
#结果"图

#显示!

个株系的平均根长比
对照分别短
#!b
)
b
)
#!b
)
#$b ) %b 和 )b !且 8#* #+* 与对照之间根长的差异达到显著水平! 8#*#*+ 与对照之间根长的差异达到极显著水平这些结果 表明!在黑暗条件下! "#$%#
基因过量表达抑制了
根的生长
>?E
!
%&%
处理下
12!+"$转基因纯合体主根伸长 和种子萌发的变化 >?E?$
!
12!+"$
转基因纯合体主根伸长和子叶的
变化
!
不同浓度
处理后!
+
个株系的
!"#$%#
转基因纯合体主根相对伸长量大于对照&随着
浓度的增加!过表达纯合体和对照植株主根生长被
抑制的程度均增加!同时子叶的黄化程度增加!且
!"#$%# 转基因株系子叶的展开程度要高于对照 "图$
!以
8#*%*&
为例#在
+
%
395
%
O浓度下!
+
个株系主根的相对伸长量平均比对照分别增加
1b
)
#%b
)
#%b
和
!+b
&在
&
%
395
%
O浓度下!
分别增加
#)b
)
#!b
)
&b
和
b
&在
#!
%
395
%
O
浓度下!分别增加
&b
)
b
)
+b
和
#b
部分
浓度处理下主根的伸长量与对照之间的差异
达显著或极显著水平"图
)
#
>?E?>
!
12!+"$
转基因纯合体种子萌发率的变化
!
不同浓度
处理
!"#$%#
转基因纯合体!结
果显示!当
浓度大于
!,"
%
395
%
O
时!所有种
子的萌发几乎全部被抑制&当浓度介于
"
"
!,"
%
395
%
O
图
+
!
在暗培养条件下
!
个
!"#$%# 转基因纯合体根的表型 [. I ,+ ! =L7U99R L709R M79TR]9!"#$%#RU40/
I
70.8L939_
MI
96/5.07/
I
U9]0.0S4UZ
图
$
!
不同浓度
处理转基因株系
8#*%*&
的表型
[.
I
,$
!
=L7
L709R
M79TRL7RU40/
I
70.85.078#*%*&].RLRL7RU74R370R9TS.TT7U70R890870RU4R.90/9T&&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 时!所有 !"#$%#
过表达纯合体和野生型种子的萌
发都受到抑制!且随着
浓度的增大!种子萌发
率 均 下 降 在 不 同
浓 度 下!所 有
!"#$%# 转基因株系的萌发率均大于野生型& ",$
%
395
%
O时!
)
个株系的萌发率比野生型增加
%"b
)
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)
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)
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)
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和
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O!萌发率增加量分别为
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395
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O浓度下!萌发率增加量分别为
$&b ) #!b )$$b ) +&b ) +&b ) !+b 和 !%b !大部分株系与 P= 之间的 差异达到显著或极显著水平"图 & #以上结果表 图 ! 暗培养条件下 !"#$%#
不同
转基因纯合体株系的根长比较
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的
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分别为
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分别表示转基因株系与
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","$和 ","# 水平存在显著性差异&下同 [. I , ! @93 4U./909TRL7U99R570 I RL9TS.TT7U70R!"#$%#
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不同浓度
处理后
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基因的过表达降低了根)子叶和种子对
的敏感性
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!
不同浓度糖处理下
12!+"$
转基因纯合体种
子萌发率的变化
许多研究发现!植物响应
的生理过程与
糖有关!于是我们接着对过表达纯合体进行了糖处
图
&
!
不同浓度
处理下
!"#$%# 纯合体种子萌发率 [. I ,& ! =L7 I 7U3.04R.90U4R79T!"#$%#
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I
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9TS.TT7U70R890870RU4R.90/9T图
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!"#$%# 转基因株系种子萌发率 [. I ,1 ! =L7 I 7U3.04R.90U4R79T!"#$%#RU40/
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!"#$%#
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与糖响应的影响
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$b 和 b G58 "葡萄糖#处理下! 有$
个株系的种子萌发率均高于
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"图
1
!
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#!而
在浓度为
+b
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$b 和 bD68 "蔗糖#处理下!有 + 个 株系的种子萌发率均高于 P= "图 1 ! A # % ! 讨 ! 论 @?$
!
12!+"$在细胞扩展中的可能作用 Q*<=>4/7 某些亚基"如 < * #) + ) @ * #&*#1 +和 2 * !" + # 表达量的变化!影响了细胞扩展其机理是 Q*<=* >4/7 利用液泡中 <=> 的 & * 磷酸基团裂解时所释放 的能量!将质子泵到液泡腔中!产生 : ; 电化学梯 度!使液泡酸化!为物质运输提供能量!从而影响膨 压和细胞扩增*!#+ 对于 Q*<=>4/78 亚基! >4S3404X40 等*+已通 过 S/?B< 干扰发现拟南芥 5/$%#
突变株在暗培养
下根和下胚轴长度都变短!揭示
!"#$%# 在细胞扩 展中起重要作用本实验发现!暗培养下的拟南芥 !"#$%#
过表达纯合体的根变短!再次证实
!"#$%# 在细胞的扩展中起作用至于根为何变短!推测 可能是由于 !"#$%#
的上游调控区存在光敏感元
件
<2*X9^
)
G<=<
等!黑暗信号可能直接或间接影
响
!"#$%# 的过量表达!进一步影响 Q*<=>4/7 活 性!使得细胞扩展时质子的转运及液泡的酸化困难! 使物质运输时供能受阻至于是主根分生区变短还 是根细胞伸长受抑制!还有待于在细胞层次上进一 步验证 @?> ! 12!+"$
可能参与
%&%
和糖介导的信号转导
途径
是一种调节植物生长发育的激素!参与植
物生长过程!并且广泛存在于各种植物诸多生理活
动中!如参与种子休眠)叶及根的伸展以及叶片脱落
等
=/.04R./
等首次报道了
诱导
Q*<=>4/78
亚基的表达*!!+研究发现!对外源
有响应的
植株其
Q*<=>4/7
活性及
:
;转运活性增加*!!*!%+
本实验对获得的过表达纯合体的种子和幼苗进行
处理后发现!
"#$%#
的过表达导致转基因纯
合体种子萌发)主根伸长和子叶的扩展对
的
抑制不敏感我们推测很可能是由于
!"#$%#
基
因的过量表达影响了
Q*<=>4/7
的活性及
:
;转运
活性!进而影响了植物在种子萌发和生长过程中对
的响应和转运
有研究发现!植物响应
的生理过程与糖
有关
@L70
等*#++发现!对
不敏感的突变体
/
6
$
在种子萌发和幼苗生长方面对糖的抑制也不敏
感!可能是由于糖处理减弱了种子或幼苗对
的响应
[.0Z75/R7.0
等*!++将野生型和对
不敏
感"
4X.
#的拟南芥种子进行萌发实验后发现!低浓度
的葡萄糖)蔗糖或果糖影响
的抑制作用本
实验对过表达纯合体进行了糖处理!结果显示$过半 数的 !"#$%#
过表达纯合体株系的种子在用葡萄
糖和蔗糖处理后!萌发率较野生型高综合
和糖处理的结果!
"#$%#
的过表达导致种子的萌
发对外源
和糖处理都不敏感!至于在种子萌
发时!
和糖信号怎样介导种子萌发的信号转
导!以及
!"#$%#
的过量表达怎样影响了
Q*<=*
>4/7
的活性!从而降低了种子对
和糖的敏感
程度!还有待于进一步的研究证实
综上所述!本研究获得了拟南芥
!"#$%#
过表
达纯合体!对其进行暗培养)
处理和糖处理!发
现其表型与野生型不同!为进一步研究
!"#$%#
基
因在植物生长发育)激素响应和信号转导过程中的
功能奠定了基础
参考文献!
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