全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
!"#$*"#*#!
&修改稿收到日期$
!"#$*"$*"
基金项目$新疆生产建设兵团博士资金专项"
!"#%11""%
#&石河子大学高层次人才启动项目"
2345!"#!#
#
作者简介$赵兰杰"
#6()
#!女!硕士!主要从事植物功能功能基因组学研究
7*89.:
$
(#,6!(%$
!;;
+<=8
"
通信作者$刘永昌!博士!讲师!主要从事棉花遗传育种及棉花功能基因组学研究
7*89.:
$
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=0
@
@
!""%
!
#!,+<=8
拟南芥
$%&()*
的亚细胞定位和
酶活性及
!#12%)*
的表达
赵兰杰#!朱守鸿!!张新宇!!李艳军!!孙
!
杰!!刘永昌!"
"
#
石河子大学 生命科学学院!新疆石河子
%!"""
&
!
石河子大学 农学院%新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室!新疆石
河子
%!"""
#
摘
!
要$通过
2B*C32
技术从拟南芥中克隆到
!"#$%#
全长
D2E
利用
FG和
L7MN&+"
对蛋白序列进
行生物信息学分析结果显示!
NHCO1#
和
NHCO1#6
蛋白序列相似性为
($+6P
!一致性为
,%+&P
&构建
!"#$%#
启动子"
#6($Q
R
#融合
&$
报告基因载体并转化拟南芥!组织化学染色分析显示!低温和干旱诱导后转基因植株
中
!"#$%#
表达水平显著提高&构建
!"#$%#
与绿色荧光蛋白基因"
&(#
#融合的瞬时表达载体并转化原生质
体!激光共聚焦显微镜观察发现!
NHCO1#*MEC
融合蛋白分布在细胞核和细胞质中&构建
!"#$%#
与麦芽糖结合
蛋白基因"
)%#
#融合表达载体并转化大肠杆菌表达融合蛋白!纯化后的蛋白进行泛素连接酶活性检测结果显示!
在小麦泛素激活酶
7#
和人泛素结合酶
7!
存在时!
NHCO1#
具有泛素连接酶活性研究表明!
NHCO1#
是一个
有功能的泛素连接酶!定位在细胞膜和细胞质中!可能参与拟南芥对非生物胁迫的响应
关键词$拟南芥&
NHCO1#
&泛素连接酶&非生物胁迫
中图分类号$
S(6
文献标志码$
N
+,-./0,123".10#41%#"515!3#
6
17/$.%#8#%
9
":!#12%)*15!
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4
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VA.AGZ.
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5.0
-
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G=YN
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!
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-
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3A.09
#
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$
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0
1-1"2+3-+4+Q
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2B*C32+K0Y=I89H.<
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@
G0GH=
@
G0GI*
9HGHI90/
@
G0.R
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@
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Q
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A./H=?
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@
IGG0Y:>=IG/R
I=HG.0
"
&(#
#
@
G0GH=
@
G0GI9HG9
HI90/.G0HG_
R
IG//.=0[G/.=0
R
I=HG.0 9^/G_
R
IG//G].0!5"2+3-+4+
R
I=H=
R
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/GI[G]>/.0
@
<=0Y=<9:8.R
G+BAGIG/>:H/A=^ G]HA9HNHCO1#*MECY>/.=0
R
I=HG.0]./HI.Q>HG].00>*
<:G>/90]<
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H=/=:
&
!"#$%# 9^/Y>/G] .^HA89:H=/GQ.0].0
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I=HG.0
"
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#
@
G0GH=
@
G0GI9HG]NHCO1#*
L1CY>/.=0
R
I=HG.0.0657/3-Y=I>Q.
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9/G9?
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>Q.
;
>.H.0:.
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9/G9?
.^HAHAG
R
IG/G08907!+D>I/H>].G/.8
R
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9^/9Y>0@
9/G90]:=<9:.ZG].00><:G>/90]<
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H=/=:
!
90]8.
@
AHQG.0[=:[G].0HAGIG/
R
=0/GH=9Q.*
=H.?/
9
@"2!7
$
!*+,-./
0
1-1"2+3-+4+
&
NHCO1#
&
7%:.
@
9/G
&
9Q.=H.!!
植物固着生长的特性使其在生长发育过程中不
可避免地与外界环境有着密切关联高盐(干旱(低
温(高温或重金属污染等不利因素影响植物正常生
长和发育!并造成农作物减产或绝收植物通过在
基因表达的不同水平进行调控从而应对各种非生物
胁迫!如转录调控(转录后调控(翻译调控和翻译后
修饰)#*作为重要的蛋白翻译后修饰!泛素化在植
物响应非生物胁迫的过程中起了重要作用泛素
"
>Q.
;
>.H.0
#是一种由
(,
个氨基酸组成的小蛋白!其
氨基酸序列和结构在不同生物中都高度保守)!*底
物蛋白质的泛素化需要多个酶的共同参与!其中主
要有泛素激活酶
7#
(泛素结合酶
7!
(泛素连接酶
7%
在这个过程中!泛素连接酶
7%
决定了底物特异
性目前植物中泛素连接酶
7%
分为
$
类$
T73B
"
T=8=:=
@
=>/H= 7,*NC 3DDT*BGI8.0>/
#(
2KJM
"
2G9:
?
K0HGIG/H.0
@
JG^ MG0G
#(
O*Q=_
和
<>:.0*2KJM
"
32U/
#
)
%
*

O*Q=_
结构域最早从酵母蛋白
OE`!
"
>Q.
;
>.H.0Y>/.=0]G
@
I9]9H.=0
R
I=HG.0*!
#中发现!含有
("
多个保守氨基酸)$*在拟南芥中!预测有
,$
个基
因编码含
O*Q=_
结构域的泛素连接酶)&*
O*Q=_
泛素连接酶能使底物蛋白和自身泛素
化!是泛素%蛋白酶系统的重要组分以前的研究表
明!
O*Q=_
泛素连接酶在植物应对非生物胁迫过程
中具有重要作用
!"89:#
编码一个
O*Q=_
类型
的泛素连接酶!其表达水平受热(冷(盐的诱导
!"89:#
编码的蛋白可以促进
E/HT#
和
E/HT!
的
降解!降低拟南芥在高光强条件清除损伤蛋白的能
力),*除此之外!该基因过表达植株增强了对低温
的敏感性)(*拟南芥
!"#$%!!
和
!"#$%!%
及其
在辣椒中的同源基因
8+#$%#
受低温和干旱诱导!
负调控植物的抗旱性)*6*
!"#$%#6
表达水平在干
旱(高盐(冷和
N1N
诱导后明显升高
!"#$%#6
的
B*` JN
插入突变体表现为对
N1N
的敏感性增
加!并加强了
N1N
诱导的气孔关闭进而提高植物
耐旱性)#"*
!"#$%#
与
!"#$%#6
高度同源!但其
在植物响应非生物胁迫过程中的分子机理还不清
楚本研究通过
2B*C32
技术克隆到
!"#$%#
的
D2E
序列!并对蛋白序列(基因表达模式(蛋白的亚
细胞定位及泛素连接酶活性等方面进行了研究!为
进一步阐明
!"#$%#
在拟南芥抗逆过程中的生物
学功能奠定了基础
#
!
材料和方法
)+)
!
材
!
料
实验材料为野生型拟南芥"生态型为
3=:>8Q.*
9*"
#将拟南芥种子用
#"P
次氯酸钠进行表面消毒
#&
"
!"8.0
!灭菌蒸馏水冲洗种子
%
"
&
次灭菌后
的种子用
"+!P
琼脂粉培养基重悬!播种在
#
%
!LV
固体培养基
$a
处理
!
"
%]
后!放入标准培养间
进行培养
)+A
!
方
!
法
)BAB)
!
!#12%)*
基因克隆及序列分析
!
以培养
#"
]
的拟南芥幼苗为材料!提取总
2JN
用
B9\929
的
0`9/G
除去
2JN
中的
J`N
并反转为
<` JN
的
第一条链进行
C32
扩增
!"#$%#
!扩增产物连接
到克隆载体
R
7NVW*1:>0H
中进行测序利用
FG<*
H=IJBK
软件进行蛋白序列比对!并用
L7MN&+"
软件构建系统进化树
)BABA
!
!#12%)*
启动子融合
720
基因载体构建
及组织化学染色
!
以拟南芥基因组
J`N
为模板!
克隆
!"#$%#
启动子序列"
NBM
上游
#6($Q
R
的
J`N
序 列#!上 游 引 物
C
#
"
BMNNM3BBBMB*
M3BBBMMBB3NBMNBM
!下划线为
9-4]
#
酶切
位点#!下游引物为
C
!
"
N3B3BNMNM3BM3BNB*
MN3BBBMBNMNB
!下划线为
;,+
$
酶切位点#
将克隆的片段连接到
R
398Q.9#%""*!!#
载体中!将
重组载体转入农杆菌
69!#"&
中!花序侵染法转化
野生型拟南芥!纯合转基因株系用于组织化学染色
将
!
周左右的拟南芥移植到液体
#
%
!LV
中!
!$A
后更换新鲜的培养基!置于
$a
培养箱!进行低温处
理
$A
&同时!将幼苗置于滤纸上!进行模拟干旱处
理
$A
!用不处理的幼苗作为对照将处理后的幼
苗浸泡在染色液中"
"+!8=:
%
UJ9T
!
CD
$
+
T
!
D
!
%+68U
&
"+!8=:
%
UJ9
!
TCD
$
+
!T
!
D
!
,+#8U
&
#""
88=:
%
8U5*
@
:><
!
!""
%
U
#!放置于
%(a
过夜!用
(&P
乙醇脱色至无色
)BABC
!
$%&()*DEF&
融合载体构建及原生质体转
化
!
将
!"#$%#
全长
D2E
克隆到原核表达载体
R
MEC!
中!用于转化拟南芥原生质体)##*上游引物
为
C
%
"
N33B3MNMNBMNB33NBN3MNNNN3*
3MMMB3BM
!下划线为
;2/
$
酶切位点#!下游引
物为
C
$
"
N3MMBN3333NMM3MBMNN3MNN3*
$(
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
3MB3
!下划线为
<
0
4
$
酶切位点#
)BABG
!
$%&()*DH(&
原核表达载体构建及体外
泛素连接酶活性检测
!
将
!"#$%#
全长
D2E
克
隆到原核表达载体
R
L9:3!
中!用于原核表达融合
蛋白上游引物为
C
&
"
N33B3MNMNBMNB33NB*
N3MNNNN33MMMB3BM
!下划线为
;2/
$
酶切
位点#!下游引物为
C
,
"
N33BM3NMB3N33NM*
M3MBMNN3MNN33MB3
!下划线为
#1"
$
酶切位
点#融合表达载体通过热激转化法转入大肠杆菌
%=!#
中!利用
KCBM
诱导后表达融合蛋白超声破
碎细胞后提取总蛋白!利用
L1C
抗体的琼脂糖珠
进行蛋白纯化纯化后的融合蛋白
L1C*NHCO1#
与小麦泛素激活酶
7#
"
O1N#
#(人泛素结合酶
7!
"
O13A&Q
#及 带 有
TKV
标 签 的 拟 南 芥 的 泛 素
"
O1S#$
#混合!
%"a
孵育
#+&A
反应产物经过
#!P
的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离!利用
N0H.*TKV
的抗体
进行蛋白杂交检测蛋白体外泛素化连接酶活性)#!*
!
!
结果与分析
AB)
!
!#12%)*
的克隆与序列分析
以拟南芥
<` JN
为模板!通过
2B*C32
技术扩
增
!"#$%#
"
NH#M#"&,"
#全长
D2E
序列回收
C32
产物并对其进行连接(转化和测序为了研究
NHCO1#
与其他物种中
O*Q=_
类型泛素连接酶的
亲缘关系!对
NHCO1#
与其他物种中已报道的
O*
图
#
!
NHCO1#
与其他物种
CO1
蛋白氨基酸
序列的系统进化分析
标尺表示演化距离
E.
@
+#
!
CA
?
:=
@
G0GH.<909:
?
/./=Y98.0=9<.]/G
;
>G0NHCO1#90]8G8QGI/=YCO1
R
I=HG.0/YI=8=HAGI/
R
G<.G/
V<9:G
R
:9HGIG
R
IG/G0H/HAGG[=:>H.=0]./H90R
:90H/
Q=_
类型泛素连接酶进行了系统进化分析利用
L7MN&+"
软件构建系统进化树!结果表明
NHCO1#
"
JC
,
#(!&!,+#
#与
NHCO1#6
"
JC
,
#(,!!&+#
#亲缘关系
最近!首先聚类在一起利用
FG对
NH*
CO1#
和
NHCO1#6
的蛋白序列进行比对分析发现
!
个蛋白序列相似性为
($+6P
!一致性为
,%+&P

NHCO1#
与其他已经报道的
O*Q=_
泛素连接酶的
亲缘关系比较远!包括拟南芥中含有
BC2
结构域的
NH3TKC
"
JC
,
&,,%"&+#
#(含有
b $`"
结构域的
NH*
CO1&6
"
JC
,
&,%("+#
#和
NHCO1,"
"
JC
,
""#"%#$(#+#
#及含有
OE` !
结构域的
NHOE` !
"
JC
,
&,%#%+!
#"图
#
#
ABA
!
!#12%)*
低温和干旱诱导后的表达
为了研究
!"#$%#
的胁迫诱导表达模式!克
隆了
!"#$%#
起始密码子
NBM
前
#6($Q
R
启动
子序列!并驱动
&$
基因在野生型拟南芥中表达
取
!
周左右转基因幼苗!经
$a
和干旱处理后!通过
组织化学染色方法观察基因表达情况结果表明!
未经胁迫处理时!报告基因在幼苗中有微弱表达
经过
$a
和干旱处理
$A
后!
&$
基因表达水平明
显上调"图
!
#以上结果表明!
!"#$%#
为低温和
干旱胁迫诱导的基因
ABC
!
$%&()*
的亚细胞定位分析
为了研究
NHCO1#
的亚细胞定位!构建
NH*
CO1#*MEC
瞬时表达载体!转化拟南芥原生质体
转化的原生质体细胞培养
#]
后!利用荧光共聚焦
显微镜观察蛋白亚细胞定位结果显示!绿色荧光
在细胞核与细胞质中都有分布"图
%
#!说明
NH*
CO1#
定位于细胞核与细胞质中
ABG
!
$%&()*
的体外泛素连接酶活性分析
为了研究
NHCO1#
的泛素连接酶活性!构建
L1C*NHCO1#
原核表达载体并转化大肠杆菌
%=!#
表达融合蛋白!纯化得到
L1C*NHCO1#
融
合蛋白在
NBC
提供能量!小麦
7#
"
O1N#
#(人
7!
"
O13A&Q
#和拟南芥的泛素蛋白"
O1S#$
#存在条件
下!进行体外泛素化反应结果表明!在小麦
7#
(人
7!
及
NHCO1#
同时存在时!可以检测到被泛素化
的
NHCO1#
!而在其他泳道均检测不到被泛素化的
NHCO1#
"图
$
#
%
!
讨
!
论
在很多国家!非生物胁迫已经成为影响作物产
量的主要原因)#%*每年由于非生物胁迫引起的农
作物减产或绝收占总产量损失的
&"P
!直接经济损
&(
&
期
!!!!!!!!!
赵兰杰!等$拟南芥
NHCO1#
的亚细胞定位和酶活性及
!"#$%#
的表达
图
!
!
转基因拟南芥低温和干旱胁迫后组织化学染色分析
N+
对照!
#
%
!LV
培养液处理的幼苗&
1+$a
处理
$A
的幼苗&
3+
干旱处理
$A
的幼苗
E.
@
+!
!
BAGA./H=?
=YHI90/
@
G0.:=^ HG8
R
GI9H>IG90]]I=>
@
AH/HIG//HIG9H8G0H
N+C:90H/HIG9HG] .^HA:.
;
>.]#
%
!LV9/<=0HI=:
&
1+C:90H/HIG9HG] .^HA$aY=I
Y=>IA=>I/
&
3+C:90H/HIG9HG] .^HA]I=>
@
AH/HIG//Y=IY=>IA=>I/
图
%
!
NHCO1#
的亚细胞定位
N+
表达
NHCO1#*MEC
融合蛋白的拟南芥原生质体&
1+
叶绿体自发荧光&
3+N
和
1
的叠加图
E.
@
+%
!
V>Q:9I:=<9:.Z9H.=0=YNHCO1#.0
R
I=H=
R
:9/H/=Y!5"2+3-+4+
N+3=0Y=<9:/GR
I=H=
R
:9/HG_
R
IG//.0
@
NHCO1#*MECY>/.=0
R
I=HG.0
&
1+E:>=IG/R
A
?
:
&
3+N90]18GI
@
G].89
@
G
图
$
!
NHCO1#
的体外泛素化活性检测
E.
@
+$
!
7%>Q.
;
>.H.0:.
@
9/G9?
9//9
?
=YNHCO1#-4>-"*/
失大约上亿美元)#$*在非生物胁迫中!对植物危害
最大胁迫因子主要包括干旱(高盐和低温)#&*大量
研究表明拟南芥
O*Q=_
泛素连接酶参与调控植物
响应非生物胁迫的过程!如
!"89:#
(
!"#$%!!
(
!"#$%!%
(
!"#$%#6
等
前期研究表明!
!"#$%#6
负调控了拟南芥的抗
旱性及对
N1N
的响应
!"#$%#
与
!"#$%#6
同
源关系最近!但与其相关的研究很少有研究表明
在干旱和
N1N
诱导后!
!"#$%#
起始密码子
NBM
上游
#cQ
的启动子区就可以驱动
&$
基因表达!
而诱导前检测不到
MOV
活性!但实时定量
C32
结
果却显示
!"#$%#
诱导前有少量表达)#,*因此!
本研究利用
!"#$%#
上游
#6($Q
R
的启动子驱动
&$
基因表达!结果发现诱导前报告基因有少量表
达!诱导后
MOV
的表达水平明显升高!从而推测
#
,(
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
cQ
后的启动子区对维持胁迫诱导前
!"#$%#
的
表达量有重要作用前期研究表明
!"#$%#
的启
动子在高盐胁迫后也能够驱动报告基因表达!序列
分析发现启动子内包含多个非生物胁迫响应的顺式
作用元件!如
TV7
(
N127
(
LW1
和
UB2
等)#(*同
时!
!"#$%#
和
!"#$%#6
的双突变体在萌发阶段
表现出对高盐抑制的不敏感性!也增强了拟南芥的
抗旱性!更加明确证明了
!"#$%#
调控了拟南芥
对非生物胁迫的响应)#&*#,*
CO1/
蛋白家族中很多
蛋白都定位在细胞膜上!如
NHCO1!(
(
NHCO1$!
(
NHCO1$%
(
NHCO1$$
)
#
*
有研究表明
CO1/
的定位
与蛋白内的
N2L
结构域有关!去掉
N2L
结构域
的
NHCO1$$
能够从细胞膜进入细胞质内)#*
NH*
CO1#
的
3
端也具有
N2L
结构域!但
NHCO1#*
MEC
融合蛋白定位细胞核和细胞质中同时!将
MEC
融合到
NHCO1#
的
J
端也得到了同样的结
果!暗示
NHCO1#
可能具有不同的生物学功能!能
够特异降解细胞质和细胞核蛋白质)#,*泛素连接
酶可以使底物蛋白泛素化!进而促进底物蛋白的降
解
NHCO1#
在酵母
7#
和拟南芥
NHO13(
存在
时具有很强泛素酶活性!但
NHO13
存在时其泛素
酶活性很弱)#6*本研究发现在小麦
7#
和人
7!
存
在时!
NHCO1#
也具有很强的泛素酶活性!说明
NHCO1#
泛素连接酶活性的强弱与泛素结合酶
7!
具有很大关系虽然已经明确
NHCO1#
参与调控
拟南芥对非生物胁迫的响应!但其底物蛋白及其参
与调控植物对非生物胁迫应答的分子机制还有待于
进一步研究
参考文献!
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