全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(5): 464鄄472(2011)
收稿日期: 2010鄄10鄄12; 修回日期: 2011鄄06鄄21
基金项目: 国家“973冶项目(2006CB101901); 国家自然科学基金资助项目(30871610; 30971949); 现代农业产业技术体系建设专项资
金资助项目(nycytx鄄02)
通讯作者: 陈 捷, 教授, 主要从事植物病理学研究; Tel: 021鄄34206141, E鄄mail:jiechen59@sjtu. edu. cn
第一作者: 王嘉渊 (1983 - ), 女, 上海人, 硕士研究生, 主要从事植物病理学研究; E鄄mail:jiayuanwang@sjtu. edu. cn。
玉米弯孢叶斑病菌 Clm1 基因的克隆及其功能验证
王嘉渊, 陈 捷*
(上海交通大学农业与生物学院, 都市农业(南方)重点开放实验室, 上海 200240)
摘要: 从玉米弯孢叶斑病菌中克隆到 MAPK 基因之一的 Clm1,其与玉米小斑病菌中的 ChMps1 基因同源。 采用 Inverse
PCR和 RACE技术获得了该基因的全序列及其所在区域的旁侧序列。 该基因 cDNA 全长 1. 251 kb,编码 416 个氨基酸。
通过农杆菌介导的转化方法对其进行了敲除。 Clm1 敲除突变体在细胞壁完整性,分生孢子产量及形态方面发生明显变
化,其侵染离体叶片的能力明显下降,纤维素酶活性有所下降,说明该基因与弯孢叶斑病菌细胞壁完整性及致病性有着密
切的联系。
关键词: 玉米弯孢叶斑病菌; Clm1; MAPK
Cloning and functional analysis of Clm1 in Curvularia lunata 摇 WANG Jia鄄yuan,
CHEN Jie摇 (School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Key Laboratory of Urban Agriculture (South),
Ministry of Agriculture, Shanghai 200240, China)
Abstract: A full鄄length of Clm1 gene from Curvularia lunata was cloned, which was highly homologous to
the mitogen鄄activated protein (MAP) kinase ChMps1 in Cochliobolus heterostrophus. The whole sequence
and flanking regions of Clm1 was amplified by Inverse PCR and RACE. Its full鄄length cDNA is 1. 251 kb, en鄄
coding 416 amino acid residues. The targeted disruption of Clm1 was obtained by Agrobacterium鄄mediated
transformation. Furthermore, it was found that the Clm1 mutants had impaired cell wall and caused low pro鄄
duction of conidiospores, deformed spore formation and decreased disease symptoms on maize leaves. In addi鄄
tion, the Clm1 mutants also had an effect on the activity of cellulase. The results above were indicated that
Clm1 played an important role in the cell wall integrity and pathogenicity in C. lunata.
Key words: Curvularia lunata; Clm1; MAPK
中图分类号: S432. 4摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)05鄄0464鄄09
摇 摇 玉米弯孢叶斑病是一种主要由新月弯孢 Cur鄄
vularia lunata(Wakker)Boedijn所引起的玉米叶部
真菌性病害。 其属于世界性病害,在我国玉米产区
分布广泛,20 世纪 90 年代给北方玉米生产带来了
严重的损失[1],近年来该病害在部分地区有加重
趋势。 关于该病害的发生规律和品种抗性鉴定国
内外有较多研究,但对其致病分子机理方面的研究
尚不深入。 因此,开展玉米弯孢叶斑病菌致病相关
基因的克隆与功能分析,对于揭示该病菌致病机制
具有现实意义。
促分裂原活化蛋白激酶 (Mitogen activated
protein kinases,MAPKs)是生物体内重要的信号传
递因子之一,其调控着多种生命过程[2,3],也包括
对病原真菌致病性的调控[4 ~ 6]。 本研究中的 Clm1
基因(C. lunata mitogen鄄activated protein kinase 1,
简称 Clm1 基因)属于细胞壁完整性相关途径中的
一个 MAPK 基因。 该基因除与细胞壁完整性有
摇
摇 5 期 摇 摇 王嘉渊,等:玉米弯孢叶斑病菌 Clm1 基因的克隆及其功能验证
关,还与植物病原真菌的分生孢子形成、附着胞的
侵入有关,如稻瘟病菌[7]中的 Mps1 基因(Clm1 同
源基因)与附着胞穿透性密切相关,缺失该基因的
突变株表现为分生孢子形成减少,繁殖力下降;在
黄瓜炭疽病菌[8]和麦角病菌[9]中,其同源基因的
功能和稻瘟病菌中的类似。 目前关于该基因在玉
米弯孢叶斑病菌致病性中的作用尚未见报道。 因
此,本研究主要通过反向遗传学的方法来对其在弯
孢叶斑病菌致病性中的作用加以证明。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
1. 1. 1摇 试剂和仪器摇 Taq DNA 聚合酶,各种限制
性内切酶及 PrimeScriptTM RT Reagent Kit(TaKa鄄
Ra);KOD鄄Plus鄄(TOYOBO);潮霉素(Merck);蜗
牛酶(上海前尘生物有限公司);溶壁酶(广东省微
生物所 ); TrizolTM Reagent 试剂 ( Invitrogen );
Southern blot 试剂盒 ( GE Healthcare ); Gelbond
film(Lonza);Mastercycler pro 梯度 PCR 仪 (Ep鄄
pendorf);显微镜 DM2500 ( Leica ); UV鄄1600PC
Spectrophotometer (Mapada ); 透射电子显微镜
JEM鄄1230(JEOL)。
1. 1. 2摇 菌株及培养条件 摇 强致病性 CX鄄3(野生
型)在马铃薯鄄葡萄糖鄄琼脂糖培养基(PDA)上,于
28益黑暗条件下固体培养;液体培养采用马铃薯鄄
葡萄糖培养基(PD),大肠杆菌菌株 DH5琢 作为感
受态细菌;根癌农杆菌 AgL1 用于农杆菌介导的转
化。 以上菌株均保存于上海交通大学分子植物病
理实验室。
1. 1. 3摇 引物及测序 摇 引物由生工生物工程(上
海)有限公司合成, 测序由 Invitrogen 英潍捷基
(上海)贸易有限公司完成。
1. 2摇 方法
1. 2. 1 摇 核酸提取 摇 基因组 DNA 的提取采用
CTAB法[10],总 RNA的提取依据 Trizol reagent中
的操作手册进行。
1. 2. 2摇 玉米弯孢叶斑病菌 Clm1 基因克隆及分析
比对 NCBI上与弯孢菌亲缘关系较近的 5 种致病
真菌基因的同源序列,设计引物 Cohmps 7:5忆鄄
GGCGTAGCCATCAAGAAGGTC鄄3忆和 mps 6:5忆鄄
ATCTGGTTGAGCTGGTCGACGTA鄄3忆,扩增得到
Clm1 基因内部的一段 DNA序列。 在此基础上,参
考 Ochman 等[11]的 Inverse PCR 方法获得该片段
的上下游序列,并通过 RACE 技术确定该基因 3忆
末端完整转录序列。 通过 NCBI的 BLAST程序进
行序列相似性比对。 采用Mega 4. 1 软件构建蛋白
序列进化树。
1. 2. 3摇 构建敲除载体摇 分别扩增拟敲除基因的上
下游片段,经 DNA 序列分析,依次构建至已去除
潮霉素 B 抗性基因的 pCAMBIA1300 载体中。 上
游片段的酶切位点为 EcoR玉和 Xba玉,下游片段
的酶切位点为 Xba玉和 Hind 芋。 从 pV2 载体中分
离出潮霉素 B 抗性基因表达元件,克隆至含有上
下游敲除片段 pCAMBIA1300 的 Xba玉位点,得到
Clm1 基因的敲除载体。 上游敲除片段的扩增引物
Cohmps49: 5忆鄄GAAGATAGAAGAGCCTCCGCTT鄄
3忆,与 Cohmps29:5忆鄄TCTAGAACTGACAGCTGCT鄄
GCTGCGA鄄3忆 ;下游敲除片段的扩增引物 Co鄄
hmps51: 5忆鄄TCTAGACTCAAGCCTGGTAACCTGCTT鄄
3忆,与 Cohmps52:5忆鄄AAGCTTTGGTTCTGTGCTG鄄
CATATGTACT鄄3忆。
1. 2. 4摇 Southern blot和 RT鄄PCR摇 Southern blot参
照 Southern blot试剂盒工作手册进行。 以 Xho 玉
酶切待测菌株的基因组 DNA。 探针 probe1 的引
物 Cohmps32:5忆鄄CTGGACCATATCTTCTGCCCA鄄
3忆 , 与 Cohmps66: 5忆鄄TTGGCCGAGTGGATG鄄
TACTTGA鄄3忆 ;探针 probe2 的引物 Cohmps67:5忆鄄
TGAGATCAAGCTGCTCCAACACT鄄3忆,与 Cohmps 68:
5忆鄄AGCGATTGGAACGATATCTTCT鄄3忆。 RT鄄PCR 依
据反转录试剂盒工作手册进行。 内参根据弯孢菌
的 GAPDH 基因(GenBank:X58718. 1)来设计引
物:gapdh1F:5忆鄄CCGTAAACGACCCCTTCATC鄄3忆,
与 gapdh1R:5忆鄄GCCACCACGCCAGTCCTTAG鄄3忆。
Clm1 基因的引物: Cohmps74: 5忆鄄ACACTTCA鄄
GAGGACATCGCAACA鄄3忆,与 Cohmps75:5忆鄄CAG鄄
CAGCTCGGCAAGAATACA鄄3忆。
1. 2. 5摇 玉米弯孢叶斑病菌的转化摇 采用农杆菌介
导的转化方法[12]。 将转化所得拟敲除突变株进行
单胞分离,继代后,再用含潮霉素的培养基验证。
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摇
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1. 2. 6摇 产孢性状与附着胞形成的观察摇 将待测菌
株在 28 益 90 mm的 PDA平板上培养 7 d后,每皿
加入 10 mL无菌水收集孢子,统计其产量,每个菌
株至少观察 3 皿。 在显微镜下随机取 5 个视野内
的孢子(孢子总数逸500)进行形态检测。 收集在
PDA平板上培养 7 d的待测菌株的分生孢子,配置
成 1 伊104个 / mL的孢子悬液,在 Gelbond film的疏
水表面滴加 20 滋L /滴上述孢子悬液,每个处理设 3
个重复,分别在 1、3、4 和 5 h 进行附着胞形成的显
微观察,每个菌株至少设 3 次重复。
1. 2. 7摇 生长速度测定摇 将待测菌株在 PDA 平板
上培养 7 d 后,取直径为 4 mm 菌片接种于新的
PDA平板和含有 1 mol / L 甘露醇的 PDA 平板中
央。 记录在 28益和 24益黑暗条件下 2 个菌株在不
同培养基上的菌落生长直径。 试验至少重复 3 次。
1. 2. 8摇 细胞壁完整性检测摇 参考 Huang 等[13]置
备稗弯孢菌原生质体方法,略有修改。 将 PDA 上
培养 7 d的病菌孢子用无菌水洗下,过滤去除菌丝
碎片,并调整至 1 伊 107个 / mL 孢子悬浮溶液。 取
该液 1 mL加到 100 mL PD 培养基中,经 28益180
rpm / min培养 18 h 后收集幼龄菌丝,菌丝用渗透
压稳定溶液冲洗 2 次。 取 0. 1 g菌丝加 1. 5 mL混
和酶液(1%溶壁酶和 1%蜗牛酶)轻轻混匀,30益
条件下对待测菌株分别进行酶解,并在 1、2 和 3 h
这 3 个时间点观测原生质体的形成数量。 整个试
验至少重复 3 次。 稳定溶液为 0. 7 mol / L KCl,经
0. 2 mol / L 磷酸氢二钠鄄柠檬酸调 pH 至 5. 8,用
0郾 22 滋m微孔滤膜过滤除菌。 酶液用稳定溶液配
置而成。
1. 2. 9 摇 透射电镜显微观察 摇 取直径为 4 mm 在
PDA上培养 7 d 的菌片等量接种于 PD 培养基中
进行培养,28益180 rpm / min 培养 48 h 后收集菌
丝,并用无菌水冲洗数次,立即放入 2. 5%戊二醛
固定液中 4益固定过夜,用 0. 1 mol / L 磷酸缓冲液
(pH 7. 0)漂洗样品 3 次,在 1%锇酸中再固定 1 ~ 2
h,重复用 0. 1 mol / L磷酸缓冲液(pH 7. 0)漂洗样
品 3 次,梯度浓度乙醇对样品进行脱水,并用丙酮
处理 20 min,之后分别用(1颐 1 和 3颐 1)体积的包埋
剂 spurr与丙酮处理样品,最后用纯包埋剂处理样
品过夜。 样品切片(70 ~ 90 nm)经柠檬酸铅溶液
和醋酸双氧铀 50%乙醇饱和溶液各染色 15 min,
进行透射电镜观察。
1. 2. 10摇 细胞壁降解酶活测定摇 取 PDA平板上培
养 7 d 的菌片(4 mm /个),等量接种于液体培养
基[14],25益培养 7 d,每天 120 rpm / min 振荡 1 h。
过滤去除菌丝,4益12 000 rpm / min离心 20 min,取
上清液作为待测酶液。 利用 DNS法在分光光度计
540 nm 处测定反应混合物的吸光值,根据酶反应
所释放的还原糖计算内切 茁鄄1,4鄄葡聚糖酶(Cx)、
多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果胶甲基半乳糖醛酸酶
(PMG)活性。 反应混合物为 0. 5 mL 酶液,1. 5
mL底物(分别为:0. 5%羧甲基纤维素钠,0郾 5%果
胶和 0. 5% 多聚半乳糖醛酸,用 0. 05 mol / L pH
5郾 0 的柠檬酸缓冲液配置),测定内切 茁鄄1,4鄄葡聚
糖酶活性需在 50益反应 40 min,测定其他 2 种酶
则需在该温度下反应 30 min。 反应到时后立即加
入 DNS 1. 5 mL 终止反应。 以上这 3 种酶的酶活
单位为 50益下每小时催化底物生成 1 滋mol 葡萄
糖或半乳糖醛酸所需酶量。
1. 2. 11摇 致病性检测摇 PDA 平板上培养了 7 d 的
待测菌株菌片(直径 4 mm)备用,对照为相同尺寸
的空白 PDA 片。 收集在 PDA 平板上培养了 7 d
的待测菌株的分生孢子,并用 0. 02% Tween20 和
2%蔗糖水溶液准备 1 伊 105个 / mL 的孢子悬液,对
照为含有 0. 02% Tween20 和 2%蔗糖的水溶液。
改良 Fries3 号培养滤液[15]中接种培养了 7 d 的待
测菌株的 PDA 菌片以及空白的 PDA 片(直径 4
mm),每个处理接种 3 片。 28益120 rpm / min 培养
15 d后,过滤灭菌收集滤液,对照为含空白 PDA片
的培养滤液。 选取 2 周龄的玉米自交系黄早四
(沈阳农业大学植物保护学院惠赠)离体叶片,置
于 40 mol / L 6鄄BA保湿培养皿中,分别接种上述待
测样品,液体接种 10 滋L /接种点。 采取有伤和无
伤接种方法,有伤口接种时,事先用金刚砂纸轻磨
玉米叶片,造成表面伤口,或是用解剖刀划出与叶
脉垂直的条纹形伤口。 在 28益避光培养 2 ~ 3 d进
行检查。 每次处理 3 张叶片,试验至少重复处理
3 次。
2摇 结果
2. 1摇 Clm1 基因的克隆及鉴定
利用引物 mps6 和 Cohmps7 克隆到 CX鄄3 基因
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摇
摇 5 期 摇 摇 王嘉渊,等:玉米弯孢叶斑病菌 Clm1 基因的克隆及其功能验证
组中一段长为 0. 833 kb 的 DNA,经 BLAST 分析
表明其和玉米小斑病菌的 ChMps1 基因高度同源。
以此序列设计引物,采用 Inverse PCR的方法,通过
2 次 Inverse PCR,拼接得到全长约 5. 3 kb 的序列。
BLAST分析表明该序列包含 Clm1 基因。 同时,采
用 RACE技术确定了 Clm1 基因 3忆末端的转录完
整序列。 最终获得的 Clm1 基因全长为 1. 609 kb,
其包含 6 个内含子,cDNA全长 1. 251 kb,编码 416
个氨基酸,该序列已经登录 NCBI,为 HQ851366。
Clm1 的蛋白序列与 Alternaria brassicicola、A. al鄄
ternata 和 Cochliobolus heterostrophus 等的 MAPK
蛋白序列约有 99%的同源率。 利用 Mega 4. 1 软
件对数种真菌的 MAPK 蛋白序列进行聚类分析,
结果也显示 Clm1 基因编码的蛋白属于细胞壁完
整性相关途径中的一个 MAP kinase基因(图 1)。
2. 2摇 同源重组获得吟clm1 敲除突变株
为了分析 Clm1 基因在玉米弯孢叶斑病菌中
所发挥的生理功能,通过同源重组的方法构建了
Clm1 基因敲除突变株(吟clm1),采用农杆菌转化
野生型 CX鄄3 菌株的方式,以潮霉素 B抗性基因交
换 Clm1 基因的 ORF 区域(图 2鄄A)。 通过对潮霉
素抗性的筛选,结合 PCR验证,初步确认敲除转化
子。 最后经 Southern blot(图 2鄄B)和 RT鄄PCR(图
2鄄C)验证,发现 5 个敲除转化子,分别为吟clm1鄄1、
吟clm1鄄2、吟clm1鄄3、 吟clm1鄄5 和吟clm1鄄6。 选择
吟clm1鄄3 和吟clm1鄄6,进一步通过 RT鄄PCR 验证,
发现这 2 个敲除突变株中的 Clm1 基因的表达受
到抑制,而野生型 CX鄄3 中的 Clm1 基因正常表达,
再一次表明吟clm1鄄3 和吟clm1鄄6 为 Clm1 基因敲
除突变株。
Fig. 1摇 Phylogenetic comparison of Clm1 (HQ851366) protein with other fungal MAP
kinases based on amino acid sequence alignments
The GenBank accession numbers are Saccharomyces cerevisiae Hog1 ( L06279), Slt2 (X59262), Kss1 (M26398 ), Fus3
(M31132), Magnaporthe grisea Mps1 (AF020316 ), Pmk1 (U70134 ), Osm1 (AF184980 ), Cochliobolus heterostrophus
ChMps1 (EF014908), Chk1(AF178977), BmHog1(AB208438), Mycosphaerella graminicola MgSlt2(DQ062121), Colleto鄄
trichum lagenarium Maf1(AY064246), Fusarium graminearum Mgv1(AF492766), Botryotinia fuckeliana Bmp3(DQ986330),
Claviceps purpurea Cpmk2(AJ320496), Alternaria brassicicola Amk2(AY705975) and A. alternate AaSlt2 (GQ414510) . The
phylogram was constructed with the Mega4. 1 program. Clm1 is marked by 银.
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Fig. 2摇 Construction and confirmation of the C. lunata Clm1 disruption
A: Cloning strategy. Clm1 and hygromycin phosphotransferase (hph) gene are indicated by thick arrows. The restriction sites are
as follows: E, EcoR玉; X, Xba玉; H, Hind芋. B: Southern blotting. WT (wild鄄type strain CX鄄3), Ect (Ectopic transfor鄄
mant), 吟clm1鄄1, 吟clm1鄄2,吟clm1鄄3, 吟clm1鄄5 and 吟clm1鄄6 (Clm1 disruption) were digested with Xho玉. The first probe is
a 0. 845 kb PCR fragment amplified with primer Cohmps32 and Cohmps66, and the second one is a 0. 881 kb DNA fragment
obtained by primer Cohmps67 and Cohmps68 (Fig. 2鄄A) . C: RT鄄PCR. Total RNA was extracted from wild type, 吟clm1鄄3 and
吟clm1鄄6. GAPDH gene fragment was used as a loading control.
2. 3摇 Clm1 对分生孢子产生、附着胞形成以及菌
丝生长的影响
野生型菌株和敲除突变株在 PDA平板上培养
7 d 后,用 10 mL 无菌水收集分生孢子,得到的孢
子数分别为(1. 083 依 0. 10) 伊 107个 / mL 和(5. 633
依0. 20) 伊106个 / mL,表明敲除突变株的产孢量明
显下降。 同时发现突变株分生孢子的色泽和外形
都有所改变。 野生型菌株中的分生孢子(图 3鄄A
中箭头 2)多为深褐色,孢子呈典型的膝状弯曲,鲜
有出现图 3鄄A中箭头 1 所指的分生孢子,该类形状
和色泽的孢子在野生型菌株中所占比例分别为
(8. 06 依 0. 34)%和(1. 79 依 0. 08)% ,而敲除突变
株产生的分生孢子(图 3鄄B中箭头 4)色泽变浅,其
数量在突变株产生的孢子中所占比例为(24. 05 依
0郾 69)% ,图 3鄄B中箭头 3 所指形状的孢子数量在
突变株中占(11. 21 依 0. 99)% ,但是 2 种菌株都能
产生外形相似的附着胞(图 3鄄C、D)。
在菌丝生长速度方面,28益和 24益条件下,敲
除突变株在 PDA上的生长速度均分别快于野生型
菌株(图 3鄄E、F)。 在 28益温度不变的情况下,含
有 1 mol / L 甘露醇的培养基上突变株生长速度仍
旧快于野生型菌株(图 3鄄G)。
2. 4摇 Clm1 对病菌菌丝细胞壁完整性和细胞壁降
解酶活性的影响
为了确定 Clm1 对病菌细胞壁形成的影响,分
析了 CX鄄3 与吟clm1 对于细胞壁降解酶的敏感性
差异。 结果显示在测试的时间段中,吟clm1 对混
合酶液的敏感性均高于 CX鄄3,两者之间原生质体
的释放数量差值在 1 h时约达 1 倍左右(表 1),随
后差值减小。
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摇
摇 5 期 摇 摇 王嘉渊,等:玉米弯孢叶斑病菌 Clm1 基因的克隆及其功能验证
Fig. 3摇 Developmental and growth characteristics of wide type (WT)
and Clm1 disruption mutant (mt)
A, B: Conidial morphological appearance of WT and mt. Bar = 5 滋m. C, D: Appressorium formation of WT and mt. Bar =
10 滋m. The arrows show different shapes and colors of conidia. E: Strains were cultured on PDA at 28益. F: Strains were
cultured on PDA at 24益. G: Strains were cultured on PDA amended 1 mol / L mannitol at 28益. Capital letters were stand for
significant differences at P =0. 01 level.
Table 1摇 Comparison of wild type strain CX鄄3
and Clm1 disruption mutant in sen鄄
sitivity to CWDEs
Strain
Protoplasts( 伊106 / mL)
1 h 2 h 3 h
Wide type 0. 48 依0. 10 2. 30 依0. 09 5. 02 依0. 08
吟clm1 0. 98 依0. 10 2. 70 依0. 09 5. 35 依0. 09
The mean and error were calculated from at least three
independent experiments. Test of data was done using
SSR. CWDEs: Cell Wall Lysing Enzymes. The
following table is same.
摇 摇 透射电镜(图 4)表明:CX鄄3 含有内外两层
细胞壁结构,其外层细胞壁厚约 ( 0 . 7 ~ 0 . 9 )
滋m,而内层厚约 0 . 3 滋m,外层较内层细胞壁厚
约 2 . 5 ~ 3 倍左右。 而吟clm1 的最外层细胞壁
已基本缺失,其内层细胞壁厚约 0 . 2 滋m,比
CX鄄3 的薄,与细胞膜结合的边缘已明显模糊
化。
在细胞壁降解酶活性测定方面,野生型菌
株纤维素酶 Cx 活性比敲除突变株的略高,两者
的果胶酶 PG 和 PMG 活性无明显差异(表 2) 。
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摇
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Fig. 4摇 TEM of C. lunata hyphae of wide type (WT) and Clm1 disruption mutant (mt)
Table 2摇 Comparison of wild type strain CX鄄3
and Clm1 disruption mutant in acti鄄
vity of CWDEs
Strain Cx(U / mL) PG(U / mL) PMG(U / mL)
Wild type 1. 72 依0. 10 15. 27 依0. 07 38. 06 依0. 11
吟clm1 1. 44 依0. 03 15. 20 依0. 19 38. 03 依0. 15
2. 5摇 Clm1 与致病性的关系
将敲除突变株和强致病株 CX鄄3(野生型)分
别以孢子悬浮液和菌片分别接种有伤口和无伤口
玉米离体叶片。 结果显示:叶片无论有无伤口,敲
除突变株所造成的病斑面积明显小于 CX鄄3 所致
的病斑(图 5鄄A、B、C、D),尤其在孢子悬浮液处理
有伤口叶片时,野生型菌株引起的叶片组织坏死程
度更为严重(图 5鄄D)。 由此可见,Clm1 基因的敲
除明显削弱了玉米弯孢叶斑病菌侵染离体叶片的
能力。 利用 2 种菌株的培养滤液处理离体叶片所
致病斑的差异有类似的规律(图 5鄄E、F)。
3摇 讨论
本研究证明 Clm1 基因参与调控了弯孢菌胞
壁完整性、产孢数量、孢子形态、色素形成和生长速
度等性状,同时与调控病菌侵染寄主离体叶片能力
密切相关。
Clm1 基因敲除后,弯孢病菌分生孢子多数变
为长椭圆形,可能与该基因缺失后导致孢子细胞壁
合成装配受阻所致有关。 敲除突变株孢子色泽变
浅则反映了其致病性下降。 据报道,弯孢菌黑色素
亦是该菌的重要致病因子[16],前期工作也发现黑
色素和弯孢菌致病性分化有关[17]。 玉米小斑病菌
的同源基因 ChMps1 也已证明与黑色素形成有
关[18,19]。
光学显微镜观察发现:敲除突变株和野生型菌
株均能正常产生附着胞,外观无明显差异,但是两
菌株在致病性上差异明显,这与稻瘟病菌 Mps1 基
因在该方面的报道结果类似[7]。 弯孢菌 Clm1 基
因敲除突变株和野生型菌株是否在附着胞内部结
构上存在差异还需进一步研究。
弯孢菌 Clm1 基因敲除突变株在 PDA 培养基
上的生长速度较野生菌株快,这与其他真菌的报道
有所不同,如稻瘟病菌 mps1鄄1吟缺失突变株生长
速度与野生型菌株相比没有很大变化[7],而禾谷
镰孢菌 mgv1 突变株则表现为生长速度显著减
缓[20]。 这可能与不同研究的测定方法不同有关,
当然也可能与 PDA上的测定条件和病原菌侵染活
植株时的生长条件不同有关。 本研究发现该基因
的敲除突变株致病性明显减弱,说明菌丝细胞壁完
整性与病菌致病性相关,当然不排除与该基因调控
的其它类致病相关因子间接相关,如黑色素、毒素
和细胞壁降解酶等。 Clm1 缺失突变株在高渗培养
基上生长的情况与玉米小斑病菌和灰霉病菌结果
相似[18,21],表明与野生型相比,高渗透压可促进
Clm1 缺失突变株的生长,据 Igbaria[18]等推测可能
是高渗压降低了 Clm1 的活化作用。
Clm1 基因缺失影响纤维素酶产生,目前尚未
有报道显示该类 MAPK 基因与纤维素酶产生相
关,前期工作中已发现另一个 MAPK 基因 Clk1 也
能影响纤维素酶和果胶酶的产生[22],在玉米小斑
病菌中与Clk1同源的Chk1基因也显示参与调控
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摇
摇 5 期 摇 摇 王嘉渊,等:玉米弯孢叶斑病菌 Clm1 基因的克隆及其功能验证
Fig.5摇 The pathogenicity of wide type (WT) and Clm1 disruption mutant (mt) on maize leaves
The leaves from A and B was inoculated by mycelial plugs. The plants in C and D were inoculated by conidial suspension. The
segments in B, D, E and F were wounded, and the others were unwounded. E and F showed that the wounded maize leaves were
inoculated by suspension of modified Fries3 cultures. From left to right, the inoculated strains were followed
by wild type, Clm1 disruption mutant and treatments control (CK) .
了 2 种纤维素酶基因的表达[23]。 纤维素酶已证明
是弯孢菌重要的致病因子[24]。
综上所述,Clm1 基因参与调控弯孢叶斑病菌
细胞壁结构完整性、分生孢子形成,纤维素酶活性
等性状,尽管这些因子均与致病性有关,但尚不明
确 Clm1 基因在弯孢菌中通过何种途径发挥上述
作用,需要进一步在基因互作水平或转录组水平上
明确该基因在致病因子调控网络中的作用。
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