全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(1): 24-30(2011)
收稿日期: 2010-02-17; 修回日期: 2010-11-08
基金项目: 国家质检总局植物病原检测基金资助(2005IK066)
通讯作者: 邵秀玲,高级农艺师,主要从事植物检疫学研究; E-mail: ciqshao@yahoo. com. cn。
利用 TaqMan探针实时荧光 PCR方法
检测香石竹细菌性萎蔫病菌
邵秀玲1*, 甘琴华1, 厉 艳1, 赵文军2, 吴兴海1, 粟智平3
( 1山东出入境检验检疫局, 青岛 266002; 2中国检验检疫科学研究院, 北京 100029; 3烟台出入境检验检疫局, 烟台 264000)
摘要: 根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组 16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变
特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的 TaqMan实时荧光 PCR检测方法。 除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他
7 种病原细菌菌株进行了荧光 PCR检测。 结果表明,只有香石竹细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他病原细菌均没有荧光产
生。 与常规 PCR相比,实时荧光 PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为 0. 4 pg / μL的 DNA,且能直接用于苗木等
样品的检测,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。
关键词: 香石竹细菌性萎蔫病菌; TaqMan探针; 实时荧光 PCR; 检测
Detection of Burkholderia caryophylli by TaqMan real-time fluorescent PCR 　 SHAO
Xiu-ling1, GAN Qin-hua1, LI Yan1, ZHAO Wen-jun2, WU Xing-hai1, SU Zhi-ping3 　 ( 1Shandong Entry-
Exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao 266002,China; 2China Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100029,
China; 3Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yantai 264000,China)
Abstract: TaqMan real-time PCR was developed to detect Burkholderia caryophylli. A pair of primers and a
probe specific for B. caryophylli were designed according to its intergenic spacer region of 16S-23S ribosomal
RNA. Among seven tested pathogenic bacteria, only B. caryophylli was detected. The results showed that a
limit of 0. 4 pg / μL of B. caryophylli DNA was detected, more specific and sensitive than routine PCR. The
method can also apply to the detection of B. caryophylli in inoculated samples and it is useful for rapid diagno-
sis and quarantine purposes.
Key words: Burkholderia caryophylli; TaqMan probe; real-time fluorescent PCR; detection
中图分类号: S432. 42; S435. 111. 49　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2011)01-0024-07
　 　 香石竹细菌性萎蔫病菌[Burkholderia caryo-
phylli (Burkholder 1942) Yabuuchi,et al. 1993]是
各国限制入境的有害生物之一,也是我国进境植物
检疫病原细菌之一。 香石竹细菌性萎蔫病菌的寄
主范围较广,主要危害麝香石竹(Dianthus caryo-
phyllus)、美国石竹 (D. barbatus)、中华 (波状)
补血草(Limonium sinuatum)、满天星 (Gypsophila
paniculata)、红掌(Anthuriurm andraeanrunh Lind)
等[1]。 香石竹细菌性萎蔫病菌危害严重,植株根
部感染后造成根部腐烂,甚至倒伏,芽上产生不连
续的褐色斑点,1 ~ 2 个月后即可整株死亡[2]。 随
着大量观赏植物的引进及种植,该病害在我国吉
林、云南、台湾已有发生。 2002 年云南西双版纳发
现红掌细菌性叶疫病,从中分离出病原细菌 4 种,
其中包括香石竹细菌性萎蔫病菌。 该病害发展迅
速,植株死亡率达 80%以上,一些重病区发病率高
达 100 % ,对红掌种植造成严重的威胁[3]。 准确
快速的检测技术是确保进出口农产品安全的有效
　
　 1 期 　 邵秀玲,等:利用 TaqMan探针实时荧光 PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌
手段,但是,目前我国尚未有香石竹细菌性萎蔫病
菌检测方法的报道,本研究建立了该病菌快速、灵
敏的检测方法。
随着分子生物学技术的发展,国内外已有应用
实时荧光 PCR 方法检测植物病原细菌的报
道[4 ~ 8],该方法在普通 PCR 的基础上引入特异性
荧光探针,对实验过程采用实时监控,从而加快检
测速度,提高检测的灵敏度和准确度。 应用实时荧
光 PCR法检测香石竹细菌性萎蔫病菌具有现实
意义。
1　 材料与方法
1. 1　 供试材料
菌株来源:1)美国典型微生物菌种保藏中心
(American Type Culture Collection,ATCC);2)中
国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Cul-
ture Collection of China,ACCC);3)中国普通微生
物菌种保藏管理中心(China General Microbiologi-
cal Culture Center,CGMCC);4)自行分离(表 1)。
其中 10506、10521、B-2 与 11441 亲缘关系近,系同
一个属不同的种。 所有菌株均在 -20℃下保存。
1. 2　 培养基及试剂
NA营养琼脂:牛肉浸膏 1. 0 g,酵母膏 2. 0 g,
蛋白胨 5. 0 g,NaCl 5. 0 g,琼脂 17. 0 g,蒸馏水
1 000 mL,调整 pH至 7. 4,121℃湿热灭菌 15 ~ 20
min。 523 培养基:蔗糖 10. 0 g,蛋白胨 8. 0 g,酵母
膏 4. 0 g,K2HPO4 2. 0 g,MgSO4·7H2O 0. 3 g,琼
脂 16. 0 g,调整 pH至 7. 0 ~ 7. 1,121℃湿热灭菌 15
~ 20 min。 PCR 试剂 2X PCR MasterMix,细菌基
因组 DNA提取试剂盒由天根生物公司提供。
1. 3　 仪器
荧光定量 PCR 仪 ABI PRISM 7900, Scan
Speed高速小型离心机。
1. 4　 细菌基因组 DNA的提取及检测
参考试剂盒方法进行。 用 Eppendoff 紫外分
光光度计测定 DNA的浓度和纯度。
1. 5　 实时荧光 PCR(real-time PCR)检测体系的
建立及优化
1. 5. 1 　 特异性引物及 TaqMan 探针设计 　 根据
GenBank公布的香石竹细菌性萎蔫病菌 16S-23S
rRNA的保守序列(GenBank 序列号:D87084. 1),
应用软件 Primer Express在 632 ~ 699 bp 间设计香
石竹细菌性萎蔫病菌特异性引物和探针。 其中引
物 FP:5′-CGGCACAAATGCGAGAACT-3′,RP:5′-
GACCCTATAACGAGAGCGTCTCTCT-3′, 预 期
PCR 产物为 68 bp。 特异探针: 5′-AACCTG-
TAGCGCAAGCGGCTCG-3′,采用化学合成标记方
法, 5′ 端 标 记 荧 光 染 料 为 Carboxyfluorescein
(FAM),3′端标记淬灭荧光染料为 Tetramethy-car-
bo-xyrhodamine(TAMRA)。 引物和探针合成分别
由英骏生物公司和大连宝生物有限公司完成。
1. 5. 2　 Real-time PCR 反应　 反应体系为 25 μL:
其中 2X PCR MasterMix 12. 5 μL、引物(10 μmol / L)
各 1 μL、探针 (10 μmol / L) 1 μL、模板 1 μL、
ddH2O 8. 5 μL。 PCR 反应的参数为:94℃ 3 min;
94℃ 15 s,62℃ 30 s,72℃ 30 s,30 ~ 40 个循环;最
后 72℃延伸 5 min。
Table 1　 Tested isolates and sources in the study
Strain Accession number Code
Burkholderia caryophylli ATCC 11441 11441
B. cepacia ACCC 10506 10506
B. pickettii ACCC 10521 10521
Burkholderia sp. Isolated B-2
Clavibacter michiganensis subsp. insidisus CGMCC1. 1908 X1
C. michiganensis subsp. michiganensis CGMCC1. 1909 X2
C. fangii CGMCC1. 2000 X3
Curtobacterium flaccumfaciens pv. beticola CGMCC1. 2354 X4
52
　
植物病理学报 41 卷
　 　 将样品在 ABI PRISM 7900 上扩增,反应结束
后,打开分析软件,仪器自动给出每个样品的 Ct
值。 记录 Ct值,分析检测结果。
1. 5. 3　 标准曲线制备　 将测定好浓度的香石竹细
菌性萎蔫病菌基因组 DNA作为标准品,进行 10 倍
梯度稀释,共设置 5 个梯度,每个梯度 3 个重复,利
用实时荧光 PCR反应体系进行检测。 以 DNA浓度
的对数值为横坐标,Ct值为纵坐标,建立标准曲线。
1. 5. 4　 引物及探针对香石竹细菌性萎蔫病菌的特
异性检验　 利用引物 FP 和 RP 及探针,以表 1 中
“10506”等 7 种供试菌株作为阴性对照菌株,并用
ddH2O作为无模板空白对照(No template control,
NTC),进行实时荧光 PCR 检测,验证实时荧光
PCR法检测香石竹细菌性萎蔫病菌的特异性,其
中菌株 11441 设 3 次重复。
1. 5. 5　 香石竹细菌性萎蔫病菌阳性样品的实时荧
光 PCR检测　 阳性样品为接种香石竹细菌性萎蔫
病菌后出现发病症状的香石竹叶片,阳性样品基因
组 DNA 的提取参考 SAAS-SCIQ-CBSR 植物基因
组 DNA提取试剂盒方法进行。
2　 结果与分析
2. 1　 标准曲线的建立
利用香石竹细菌性萎蔫病菌 real-time PCR 反
应体系对 5 个 10 倍梯度稀释的标准品进行检测,
建立 DNA浓度与 Ct 值对应关系的标准曲线(图
1)。 试验结果显示,所制作的标准曲线在 DNA 浓
度为 4 ng / μL ~ 0. 4 pg / μL 之间有较好的线性关
系,相关系数为 0. 991 798 8,斜率约为 -3. 042 633,
截距为 16. 449 715,得出 DNA浓度的对数值与 Ct
值的线性方程为:y = - 3. 042 633x + 16. 449 715。
每个稀释浓度设置 3 个重复,以使所建立的标准
曲线真实、准确、可靠。 在对样品进行检测时,根
据其 Ct值和标准曲线方程就可获得该样品 DNA
浓度。
2. 2　 香石竹细菌性萎蔫病菌的实时荧光 PCR 检
测的特异性
利用引物 FP 和 RP 及探针,对 8 种供试菌株
进行实时荧光 PCR 检测,其中 11441 标准菌株设
置 3 次重复,设置的 7 种阴性对照菌株,只有香石
竹细菌性萎蔫病菌有强的荧光信号增加,曲线呈平
滑 S型,Ct值为 18. 349 37,表现为阳性扩增,而其
他细菌菌株及水对照均没有荧光信号均匀增加的
S型曲线,表现为阴性(图 2)。 说明探针对香石竹
细菌性萎蔫病菌有很强的特异性,可以把香石竹细
菌性萎蔫病菌与其他细菌菌株分开。
　 　 电泳观察实时荧光 PCR 扩增产物(图 3),菌
株 B-2 在 68 bp 位置也有扩增条带,而其他 6 种细
菌对照菌株有非特异性扩增或其他特异性扩增条
Fig. 1　 Standard curve for TaqMan PCR amplification of 11441
62
　
　 1 期 　 邵秀玲,等:利用 TaqMan探针实时荧光 PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌
Fig. 2　 Specificity of TaqMan probe RT-PCR
Amplification curves of 8 bacteria with specific primers and probe. 1-3: 3 replicas of 11441;
4: 10506, 5: 10521; 6: B-2; 7: X1; 8: X2; 9: X3; 10: X4 ; 11: No template control.
Fig. 3 　 Amplification products of 8 bacteria
by TaqMan RT-PCR
TaqMan RT-PCR was performed by amplifying DNA of 8
bacteria with specific primers. M: 600 bp DNA ladder; 1:
11441; 2: 10506; 3: 10521; 4: B-2; 5: X1; 6: X2; 7:
X3; 8: X4; 9: No template control. The results are represen-
tative of 3 independent experiments.
带,水对照无扩增条带,说明探针对香石竹细菌性
萎蔫病菌有很强的特异性,尽管加入的引物能把非
特异性模板扩增出来,但若探针不能与模板特异性
地完全结合,在实时荧光 PCR 仪上也不会有强的
荧光信号增加。
2. 3　 香石竹细菌性萎蔫病菌的实时荧光 PCR 检
测的灵敏度
将已测定浓度的香石竹细菌性萎蔫病菌 DNA
连续稀释成 0. 4 ng / μL、0. 04 ng / μL、4 pg / μL、0. 4
pg / μL、0. 04 pg / μL,分别加入到含有引物和探针
的反应体系中,在退火温度 62℃条件下扩增,每个
浓度设置 3 个重复。
　 　 结果表明(图 4),在 DNA浓度高于 0. 4 pg / μL
时,扩增曲线为明显的 S 型曲线,此时 Ct 值为 16
~ 27 之间,实时荧光 PCR 仍可检测到香石竹细菌
性萎蔫病菌,其稀释限点应为 0. 4 pg / μL,对应的
Ct值为 26. 962 103。 根据标准曲线函数计算得
出,此时的模板浓度为 0. 351 pg / μL,与实际的稀
释点模板浓度相差不大,标准曲线函数可以准确的
表示出模板浓度与 Ct 值间的关系。 模板浓度与
△Rn有一定的线性关系,在一定的浓度范围内,模
72
　
植物病理学报 41 卷
Fig. 4　 Sensitivity of detecting 11441 template with TaqMan RT-PCR
Amplification of the 3 replicas of DNA samples extracted with the kit, diluted at the concentration of
0. 4 ng / μL (1-3), 0. 04 ng / μL (4-6), 4 pg / μL (7-9), 0. 4 pg / μL (10-12) and 0. 04 pg / μL (13-15),
and amplified with the TaqMan probe; 16: No template control.
板浓度越高,荧光信号越强。 而常规 PCR 产物作
琼脂糖电泳后只能检测到 DNA 含量为 40 pg / μL
以上的 PCR产物,降低 DNA浓度则只能检测到大
量的引物二聚体,这表明实时荧光 PCR 的检测灵
敏度比常规 PCR检测灵敏度高 100 倍。
2. 4 　 香石竹细菌性萎蔫病菌阳性样品的实时荧
光 PCR检测
用 11441 标准菌株接种 8 ~ 10 叶龄的香石竹
幼苗,观察 4 ~ 6 d,挑取有明显萎蔫、枯萎症状的香
石竹叶片作阳性样品,用 11441 标准菌株作阳性对
照,健康的香石竹叶片作阴性对照,分别提取阳性
样品、阴性样品的植物基因组 DNA,提取 11441 标
准菌株的细菌基因组 DNA,ddH2O作空白对照,进
行实时荧光 PCR检测,验证检测体系的重复性、稳
定性与特异性。
结果表明,阳性样品和阳性对照表现出明显的
荧光信号,阴性样品和空白对照均没有荧光信号
(图 5)。 实时荧光 PCR方法能够对感染病菌的植
物组织直接进行检测,而不需要进行植物病原细菌
的分离纯化,简化了步骤,适合于香石竹细菌性萎
蔫病菌的快速检测鉴定,同时进一步证明了该方法
提供的引物、探针特异性强,重复性、稳定性高。
3　 讨论
常规 PCR技术常因出现污染而影响试验的准
确性和可靠性,不能满足进出口检验检疫要求。
TaqMan探针技术巧妙结合 PCR技术的有效扩增、
核酸杂交的特异性和荧光 PCR技术的快速与敏感
性,完全克服了荧光染料方法的缺点,既灵敏又特
异,不用做熔解曲线分析,并且可以多重检测[9],
结果重复性好,因而受到广泛的重视和应用。
　 　 原核生物核糖体由 16S rRNA、23S rRNA 及
5S rRNA分子构成其骨架,在 GenBank 中许多 rD-
NA序列都包括了这 3 个分子作为一个完整的操
纵子,每个操纵子的基因长度及序列对于不同种属
细菌乃至亚种之间都是特异的,也是高度保守
的[10] 。 rDNA是细菌种系发育的信号大分子,其
序列中存在着保守区和可变区,对可变区序列的分
析可以将亲缘关系较近的分支间细菌进行分类[11]。
82
　
　 1 期 　 邵秀玲,等:利用 TaqMan探针实时荧光 PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌
Fig. 5　 Detection of samples with TaqMan RT-PCR
1: Positive sample; 2: Positive control; 3: Negative control; 4: No template control.
利用 TaqMan 探针技术,结合香石竹细菌性萎蔫病
菌基因组 16S-23S rRNA 保守序列,设计特异性引
物和探针,将该病菌与其他病原细菌区分开来,达
到了检测该病菌的目的,并可用于高通量检测(一
次性完成近百个样品的检测)。 试验结果也证明,
基于 TaqMan 探针技术的检测特异性好,灵敏度
高,当 DNA 浓度为 0. 4 pg / μL 时,仍然能检测到
该病菌,检测灵敏度是常规 PCR 的 100 倍。 已知
一份阳性样品,通过实时荧光 PCR 分析得到 Ct
值,根据标准曲线即能推算出样品的浓度。 Taq-
Man探针实时荧光 PCR方法检测香石竹细菌性萎
蔫病菌,重复性好,稳定性高(图 2),不同的重复试
验得到的扩增曲线基本重合,试验结果完全一致。
香石竹细菌性萎蔫病菌是一种危害严重的细
菌性病害,快速准确的检测方法是病害预警监测与
有效防控的技术保证。 本研究成功地设计并合成
香石竹细菌性萎蔫病菌 TaqMan 实时荧光 PCR 引
物和探针,在国内首次建立了香石竹细菌性萎蔫病
菌的实时荧光 PCR检测体系。 传统的鉴定方法需
要经过病原菌的分离、纯化、扩大培养、致病性试验
等一系列的步骤,检测周期长。 TaqMan 探针技术
用 ABI PRISM 7900 扩增仪检测,无需 PCR后续处
理,大大地简化了检测鉴定步骤,提高了检测速度,
降低了污染[12]。 本研究建立的香石竹细菌性萎蔫
病菌检测、鉴定的 TaqMan 探针实时荧光 PCR 方
法,具有快速、简便且特异、灵敏的特点,尤其适合
于香石竹细菌性萎蔫病疑似或初期症状的早期快
速诊断,为香石竹细菌性萎蔫病早期预警监测、苗
木种子出入境检验检疫、疫区的确定及病害流行学
动态研究奠定了基础。
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责任编辑:于金枝
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