全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(4): 345鄄351(2011)
收稿日期: 2010鄄04鄄09; 修回日期: 2011鄄03鄄12
基金项目: 教育部博士点基金 (20095302110003)
通讯作者: 黄 琼,教授,主要从事植物病害方面的研究; E鄄mail: huangqiong88hs@yahoo. com. cn
陈海如,教授,主要从事植物病理学研究; E鄄mail: hrchen44@yahoo. cn
第一作者: 余 磊(1981 - ),男,河南商丘人,博士,主要从事植物病原真菌分子生物学研究, E鄄mail: yulei0425@163. com。
石榴枯萎病菌的遗传多样性研究
余 磊1,2, 邹 琳1, 陈小龙1, 高玲玲1, 黄 琼1*, 陈海如1*
( 1云南农业大学植保学院, 昆明 650201; 2昆明学院农学院, 昆明 650214)
摘要: 利用随机扩增多态性 DNA(RAPD)和小卫星标记(DAMD)技术分析中国石榴枯萎病菌 (Ceratocystis fimbriata)的
遗传多样性,并对来自印度、巴西、美国、新西兰、巴布新几内亚等多种寄主的 C. fimbriata 样品进行扩增,结果显示:所有
C. fimbriata在遗传相似系数 0. 70 (RAPD)和 0. 60(DAMD)时均被分为 4 个相似的组群,其中中国石榴枯萎病菌间及其与
芋头黑腐病菌(中国)具有一致的同源性(similarity index:1. 00),而其它不同寄主来源的分离菌显示出一定的多态性。 来
自印度的石榴枯萎病菌与来自中国的有明显差异(RAPD,DAMD遗传相似系数分别为 0. 83 和 0. 71),中国芋头寄主分离
菌与巴西芋头分离菌间也存在一定差异。 相对于来自印度石榴 C. fimbriata来说,来自中国石榴与巴西芋头的分离菌有更
近的系统发育关系。 所有来自甘薯寄主的 C. fimbriata 聚类为一个单独的分支。 这表明供试的所有中国石榴菌株间及与
中国芋头菌株间均具有一样的基因型,与印度同寄主(石榴)的 C. fimbriata基因型存在明显差异。
关键词: 石榴枯萎病;甘薯长喙壳;RAPD;小卫星标记
Genetic diversity analysis of Ceratocystis fimbriata strains isolated from China摇 YU
Lei1,2, ZOU Lin1, CHEN Xiao鄄long1, GAO Ling鄄ling1, HUANG Qiong1, CHEN Hai鄄ru1 摇 ( 1College of Plant
Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China; 2College of Agronomy, Kunming University, Kunming,
650214, China)
Abstract: To test the genetic diversity of Chinese population of Ceratocystis fimbriata, 69 samples of diffe鄄
rent isolates were analyzed by RAPD and direct amplification of minisatellite鄄region DNA (DAMD) PCR
techniques, and compared with a number of Ceratocystis fimbriata isolates from various hosts growing in
different regions of India, Brazil, USA, New Zealand and Papua New Guinea. Molecular analysis based on
RAPD and DAMD data using UPGMA implicated that the isolates could be classed into four main clusters.
The C. fimbriata population from pomegranate in China had a high level of homology ( similarity index:
1郾 00), and were divided into the same cluster with taro isolates from China. The isolates from other hosts
showed certain diversity. The pomegranate isolates from India were differed genetically with these from China.
The isolates from taro of Brazil were phylogenetically closer to these from pomegranate and taro of China but
far from those from pomegranate of India. All sweet potato isolates had similar fingerprint and formed a single
lineage. The populations from pomegranate and taro of China had the same genotype.
Key words: pomegranate wilt, Ceratocystis fimbriata, RAPD, minisatellite markers
中图分类号: S436. 63摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)04鄄0345鄄07
摇 摇 石榴枯萎病(pomegranate wilt)是我国近几年
新发现的一种果树毁灭性病害,由甘薯长喙壳菌
(Ceratocystis fimbriata Ellis & Halsted)引起,2003
年发现于云南省红河州地区[1]。 调查发现,2003
摇
植物病理学报 41 卷
年病株率为 11. 2% ,2004 年因该病造成的经济损
失达 1400 万元以上[2]。 挂果植株发病时,全株叶
片萎蔫,整株枯死,造成大面积绝收,被当地果农称
为石榴的“癌症冶 [3]。 该病害已严重威胁当地石榴
果树产业的可持续发展。
目前关于中国石榴枯萎病菌遗传多样性,及与
世界上其它不同地理来源和不同寄主来源 C. fim鄄
briata间的差异研究尚未见报道。 为此,我们利用
随机扩增多态性 DNA( random amplified polymor鄄
phic DNA, RAPD)和小卫星标记(direct amplifica鄄
tion of minisatellite鄄region DNA, DAMD)技术对来
自我国云南及印度、巴西、美国、新西兰、巴布新几
内亚等多种寄主的 C. fimbriata 的遗传多样性和
居群结构进行了研究,研究结果为有效制定病害防
治和检疫措施,减少这些病菌传入新地区提供了依
据。
1摇 材料和方法
1. 1摇 供试菌株
采用单孢分离法,从云南各地石榴园中的石榴
枯萎病发病植株上分离得到 49 株病菌,芋头黑腐
病菌株(7 株),甘薯黑斑病菌(5 株)。 印度石榴枯
萎病菌株(2 株),巴西芋头黑腐病菌株(3 株),美
国、新西兰、巴布新几内亚甘薯黑斑病菌株(各 1
株)由美国爱荷华州立大学 T. Harrington 教授提
供。 供试的 69 个菌株的编号、寄主及来源见表 1。
1. 2摇 DNA提取与检测
基因组 DNA 的提取和纯化参照 Raeder 等的
方法[4]进行,并置于 -20益冰箱中保存待用。
1. 3摇 小卫星标记 (minisatellite markers)
小卫星标记扩增参照 Santini 等方法[5]进行。
引 物 为 M13 ( 5 爷 鄄GAGGGTGGCGGTTCT鄄3 爷,
TaKaRa)。 PCR 扩增反应体系 25 滋L,包括:10
mM Tris鄄HCl ( pH 8. 3 ), 50 mM KCl, 2. 5 mM
MgCl2,0郾 2 mM dNTPs,200 mM 引物 M13,2. 5 U
Taq polymerase,20 ng 基因组 DNA。 PCR (Gene
Amp 9700, ABI, USA)反应程序为:93益预变性
3 min;93益变性 1 min,55益退火 1 min,72益延伸
1 min,45 个循环;72益延伸 10 min,4益保存。 PCR
产物检测:PCR 扩增产物经 1. 5%的琼脂糖胶电
泳,0郾 5 滋g / ml 溴化乙锭染色液中染色 20 min,在
UPV 襅紫外光凝胶成像系统上观察,并拍照。
1. 4摇 RAPD引物的筛选及扩增
供试引物为 Operon 公司合成的 10 碱基寡核
苷酸单链随机引物,共 40 个。 首先用 10 个模板
DNA对 40 个随机引物进行筛选,从中选出带型清
晰、重复性好、具多态性的 8 个引物对供试菌株进
行 RAPD分析(表 2)。
RAPD标记扩增参照 Marin 等方法[6]进行。
PCR 反应体系为 25 滋L, 包括: 3 mM MgCl2,
0. 2 mM dNTPs,0. 8 滋M 引物,1 伊 PCR buffer,1U
Taq Polymerase,25 ng DNA模板。 PCR(GeneAmp
9700, ABI, USA)反应程序为:95益预变性 5 min;
94益变性 1. 5 min, 36益 退火 1min, 72益 延伸
2 min,30 个循环;72益延伸 5 min,4益保存。 PCR
产物检测:PCR扩增产物经 1. 5%的琼脂糖凝胶电
泳,0. 5 滋g / mL溴化乙锭染色液中染色 20 min,在
UPV 襅紫外光凝胶成像系统上显像,并拍照。 每
一引物重复试验 3 次,每次反应均设不加模板的空
白对照。 RAPD 随机引物、dNTP、Taq DNA 聚合
酶、琼脂糖(Biowest)、100 bp DNA Ladder 等均购
自大连 TaKaRa公司。
1. 5摇 扩增产物分析
将重复性好,谱带清晰的 DNA 标记出现记为
“1冶,无条带为“0冶。 遗传相似系数( genetic simi鄄
larity, GS)按公式 GS =2NXY / (NX +NY)进行计
算。 其中 NX和 NY分别为品种(系)X 和 Y 的扩
增片段数,NXY 为该两品种(系)间共有片段数。
遗传距离(genetic distance, GD)按公式 GD = 1 -
GS 计算。 将遗传距离指数输入计算机,利用
MEGA2. 1 软件的 UPGMA(unweighted pair group
method with arithmetic mean)法构建聚类分析图,
并进行相关分析[7,8]。
2摇 结果与分析
2. 1摇 小卫星的图谱及聚类分析
以 M13 为引物的扩增条带范围为 310 bp 到
3 000 bp。 总共 10 个条带被识别,其中的 6 条表现
出多态性(图 1)。 M13 的条带在中国石榴和中国
芋头分离菌中是相同的。 然而,在中国石榴与印度
石榴、中国芋头与巴西芋头分离菌中发现了多态性
(图 1,图 2)。 从扩增出的 DAMD 图谱发现,所有
参试的中国石榴菌株与中国芋头菌株有高度一致
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摇
摇 4 期 摇 摇 余 磊,等:石榴枯萎病菌的遗传多样性研究
的谱带(泳道:1 ~ 14, 17 ~ 22),其遗传背景具有一
致的相似性;不同来源分离菌谱带之间存在不同程
度的差异,反应了不同来源 C. fimbriata 分离系居
群间存在遗传多样性。
Table 1摇 Isolates of Ceratocystis fimbriata used in the study
Isolate Source Host Isolate Source Host
CIR1 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR36 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR2 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR37 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR3 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR38 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR4 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR39 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR5 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR40 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR6 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR41 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR7 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR42 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR8 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR43 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR9 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR44 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR10 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR45 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR11 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR46 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR12 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR47 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR13 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR48 MS, Yunnan, China Punica granatum
CIR14 MS, Yunnan, China Punica granatum CIR49 MS,Yunnan, China Punica granatum
CIR15 MS, Yunnan, China Punica granatum C12131 SF, Karnataka, India Punica granatum
CIR16 MS, Yunnan, China Punica granatum C12132 SF, Karnataka, India Punica granatum
CIR17 MS, Yunnan, China Punica granatum YP1 KM,Yunnan, China Colocasia esculenta
CIR18 MS, Yunnan, China Punica granatum YP2 KM,Yunnan, China Colocasia esculenta
CIR19 MS, Yunnan, China Punica granatum YP3 KM,Yunnan, China Colocasia esculenta
CIR20 MS, Yunnan, China Punica granatum YP4 KM,Yunnan, China Colocasia esculenta
CIR21 MS, Yunnan, China Punica granatum YP5 KM,Yunnan, China Colocasia esculenta
CIR22 MS, Yunnan, China Punica granatum YP6 KM,Yunnan, China Colocasia esculenta
CIR23 MS, Yunnan, China Punica granatum YP7 KM,Yunnan, China Colocasia esculenta
CIR24 MS, Yunnan, China Punica granatum C1905 Sorocaba, Brazil Colocasia esculenta
CIR25 MS, Yunnan, China Punica granatum C1910 Ubatuba, Brazil Colocasia esculenta
CIR26 MS, Yunnan, China Punica granatum C1913 Tapirai, Brazil Colocasia esculenta
CIR27 MS, Yunnan, China Punica granatum SP1 KM, Yunnan, China Ipomoeabatatas
CIR28 MS, Yunnan, China Punica granatum SP2 KM, Yunnan, China Ipomoeabatatas
CIR29 MS, Yunnan, China Punica granatum SP3 KM, Yunnan, China Ipomoeabatatas
CIR30 MS, Yunnan, China Punica granatum SP4 SQ,Henan, China Ipomoeabatatas
CIR31 MS, Yunnan, China Punica granatum SP5 SQ, Henan, China Ipomoeabatatas
CIR32 MS, Yunnan, China Punica granatum C1416 NC, USA Ipomoeabatatas
CIR33 MS, Yunnan, China Punica granatum C1473 New Zealand Ipomoeabatatas
CIR34 MS, Yunnan, China Punica granatum C1932 Papua New Guinea Ipomoeabatatas
CIR35 MS, Yunnan, China Punica granatum
MS:Honghe region;KM:Kunming city;SQ:Shangqiu city.
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摇
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Table 2摇 Sequence of the primers and num鄄
ber of polymorphic fragments ob鄄
tained by RAPD analysis
Primer Sequence (5忆 to 3忆) No. polymorphic fragments
OPK鄄08 GAACACTGGG 9
OPK鄄12 TGGCCCTCAC 17
OPK鄄13 GGTTGTACCC 12
OPD鄄20 GGTCTACACC 14
OPA03 AGTCAGCCAC 10
OPA09 GGGTAACGCC 11
OPA13 CAGCACCCAC 13
B10 CTGCCTGGGAC 10
摇 摇 UPGMA法构建的分子系统树显示(图 3),不
同来源菌株的相似系数范围在 0. 60 ~ 1. 00 之间,
供试的 69 个菌株可以聚为 4 个簇群。 体现了种内
的亲缘关系差异程度,但所有参试菌株具有较高的
相似性。 聚类分组显示,中国石榴和中国芋头寄主
的菌株被划分在一个宗谱内(1. 00);以相似性系
数 0. 60 为阈值,不同寄主(印度石榴、巴西芋头及
中国、美国、新西兰和巴布新几内亚的甘薯)来源
的菌株独自各成一组。 相对于来自印度石榴
C. fimbriata来说,来自中国石榴和巴西芋头的病
菌有更近的系统发育关系。 来自中国、美国、新西
兰和巴布新几内亚的甘薯寄主 C. fimbriata 在
0郾 60 的相似系数单独聚为一组(泳道:26 ~ 31),表
现出高度的一致性,与 Santini 等[5]的研究结果
一致。
2. 2摇 RAPD图谱及聚类分析
在优化的扩增体系下,所筛选的 8 个引物对
69 个样品均有较好的扩增效果。 扩增产物 (DNA
片段)经电泳,可分离出清晰明亮的谱带,不同分
离株 RAPD扩增产物有 3 ~ 18 条带,扩增条带范围
为 230 bp到 4 100 bp,其中主条带 2 ~ 7 条,次带丰
富,各菌株间既有相同条带又有差异条带。 图 2 显
示了引物 OPK鄄12 对其中部分 31 个菌株的扩增情
况。 从扩增出的的 RAPD 图谱发现,供试中国石
榴菌株与中国芋头菌株间有高度一致的谱带 (泳
道:1 ~ 14, 17 ~ 22),其遗传背景具有一致的相
似性。
由 UPGMA法构建的分子系统树显示(图 4):
不同来源菌株之间则在 0. 70 ~ 1. 00 遗传相似系数
范围聚类,将供试菌株同样聚为 4 个簇群。 聚类分
组显示,中国石榴和中国芋头寄主的菌株被划分在
一个宗谱内(1. 00);以相似性系数 0. 70 为阈值,
不同寄主(印度石榴、巴西芋头及中国、美国、新西
兰和巴布新几内亚的甘薯)来源的菌株独自各成
一组。 与 DAMD分析结果类似,相对于来自印度
石榴C . fimbriata来说 ,中国石榴C . fimbriata与
Fig. 1摇 Amplification products generated from 31 of Ceratocystis fimbriata
isolates obtained with primers M13
The isolates include ( left to right) fourteen isolates of Punica granatum ( L1鄄14:CIR1, CIR7, CIR11, CIR15, CIR18, CIR20,
CIR26, CIR29, CIR31, CIR37, CIR42, CIR46, CIR48, CIR49), two isolates of P. granatum from India ( L15鄄16:C12131,
C12132), six isolates of Colocasia esculenta from China ( L17鄄22:YP1, YP2, YP4, YP5, YP6, YP7), three isolates of
C. esculenta from Brazil (L23鄄25:C1905, C1910, C1913), three isolates of Ipomoea batatas from China (L26鄄28:SP1, SP3,
SP5), and isolates of I. batatas from Papua New Guinea (L29:C1932), isolates of I. batatas from USA (L30:C1416), iso鄄
lates of I. batatas from New Zealand (L31:C1473), and the control reaction without template DNA ( lane 32), Lane M is a 100
bp DNA ladder.
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摇
摇 4 期 摇 摇 余 磊,等:石榴枯萎病菌的遗传多样性研究
Fig. 2摇 RAPD fingerprints of 31 Ceratocystis fimbriata isolates obtained with primers OPK鄄12
The isolates are ( left to right) the same as those in Fig. 1.
Fig. 3摇 Dendrogram based on the similarity index matrix calculated from
the analysis of DAMD fragments obtained with M13 primer
Only the selected isolates from China are included.
Fig. 4摇 Dendrogram based on the similarity index matrix calculated from RAPD analysis
Only the selected isolates from China are included.
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摇
植物病理学报 41 卷
来自巴西芋头的 C. fimbriata 有更近的系统发育
关系。 而且来自中国、美国、新西兰和巴布新几内
亚的甘薯寄主分离菌在 0. 70 的相似系数单独聚为
一组(泳道:26 ~ 31),仅在 0. 95 相似系数内 C1416
表现出少许差异,同样也表现出高度的一致性,这
个结果(甘薯寄主分离菌)和以往研究的结果一
致[5]。
3摇 结论及讨论
甘薯长喙壳菌(C. fimbriata)是一种分布广
泛、危害多种木本和草本植物的病原体。 1890 年
最初在甘薯上发现,作为属的模式种被描述[9],属
子囊菌亚门(Aseomycotina),核菌纲 (Pyrenomyce鄄
tes),球壳目 (Sphariales),长喙壳科 (Ceratocysti鄄
aeeae)。 全世界已报道的主要寄主包括甘薯、可
可、咖啡、橡胶、芒果、桉树、杨树、刺桐、山胡桃、枫
树、山胡桃树、石榴、刺槐、柑橘类、李属植物等木本
植物,以及木薯、芋头、山扁豆、菽麻等多种草本植
物[6,10 ~ 14]。 C. fimbriata种内差异在形态上不容易
区分,一般是基于寄主范围和通过生理学特性进行
区分鉴定。 DAMD和 RAPD技术在检测同种真菌
的多样性中已经有很多应用[5 ~ 6,15 ~ 21]。 本研究中
来自中国石榴寄主和中国芋头寄主的供试分离菌,
使用 M13 或 RAPD 作为分子标记,均得到一个单
一的指纹图谱。 通过和印度石榴枯萎病菌的比较
我们发现,它们在基因同源性上也存在明显差异,
来自巴西芋头寄主的分离菌与中国石榴菌株和芋
头菌株也存在一定不同之处。 UPGMA 法构建的
分子系统树显示:相对于来自印度石榴分离菌来
说,来自中国石榴与巴西芋头的 C. fimbriata 间有
更近的系统发育关系。 来自甘薯寄主的分离菌聚
类为一个单独的分支 (图 3, 4)。
C. fimbriata 侵染石榴果树(Punica granatum
Linn. )引起石榴枯萎病最初在印度被报道[22],
2003 年,又在中国云南发现该病害[5]。 通过致病
性试验和 ITS分析结果显示:来自印度石榴枯萎病
菌对云南省发病区健康石榴苗没有任何致病性,并
且中国云南石榴菌株和印度石榴菌株在 ITS 序列
发育关系上存在明显差异(结果尚未发表)。 San鄄
tini等[5]应用 RAPD和 DAMD 标记技术研究了意
大利悬铃木属 (Platanus spp. )上的 C. fimbriata
f. sp. platani种群的基因多样性,同时还分析了来
自世界上不同地方(法国、美国、加拿大、瑞士、巴
布亚新几内亚)的多种寄主 (悬铃木属 Platanus
spp, 欧洲山杨 Populus tremuloides, 甘薯 Ipomoea
batatas, 李属 Prunus sp. )的甘薯长喙壳菌样品。
结果显示,来自于意大利和法国的菌株均具有高度
一致的同源性,来自于杨树,李属和甘薯等不同寄
主的甘薯长喙壳菌分别分到了不同的进化分支中,
得到了与 Witthuhn 等[23]类似的结果。 并认为意
大利悬铃木属病原菌 C. fimbriata f. sp. platani 起
源于国外。 同样 Barnes[24],Steimel[25]利用微卫星
标记 (microsatellite markers) 研究也表明该病菌
种内的不同的遗传组群与特有的寄主范围有关。
Marin等[6]利用形态致病性、RAPD 标记和核酸分
析等技术对哥伦比亚咖啡寄主的分离菌进行了研
究,并区分出了两种致病能力不同组群。
通过以上分析研究结果显示:供试的中国云南
石榴枯萎病菌群体间具有高度的一致基因同源性,
芋头黑腐病菌与石榴枯萎病菌也具有共同的基因
起源,供试印度石榴菌株与中国石榴菌株在遗传分
化上存在明显不同。 鉴于此研究样品的数量及分
布分析,我们推测中国云南石榴枯萎病菌并非起源
于印度传入,可能存在其它的传入途径。
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