全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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#
"&*"%*"
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$
#"+,",
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-
+.//0+#"""*&"!$+!"#$+"&+"%
收稿日期$
!"#&*##*#)
&修改稿收到日期$
!"#$*"#*!,
基金项目$国家自然科学基金 "
%")"!,%
#
作者简介$周升恩"
#))"(
#!男!在读硕士研究生!主要从事植物代谢基因工程研究
1*23.4
$
5678/690
:
90)"
!
#,%+;72
"
通信作者$陈丽梅!教授!博士生导师!主要从事植物代谢途径基因工程研究
1*23.4
$
;6904.29.<2
!
#!,+;7=0
转
1!0
!
1!2
基因天竺葵甲醛
代谢途径与吸收能力研究
周升恩!肖素勤!韩
!
双!轩秀霞!孙
!
振!李昆志!陈丽梅"
"昆明理工大学 生命科学与技术学院生物工程技术研究中心!昆明
,$"$""
#
摘
!
要$以天竺葵"
!"#$%
&
()*+/
>
+?=90/632
#为材料!通过在天竺葵的叶绿体中过量表达来自甲基营养型酵母同
化甲醛"
@A@B
#途径的关键基因二羟基丙酮激酶基因"
,-.
#和二羟基丙酮合酶基因"
,-/
#!获得具有
CDE
%
CDF
@A@B
同化途径的转基因天竺葵!利用#%
A*GHI
技术对液体
@
#%
A@B
胁迫下野生型和转基因天竺葵
@
#%
A@B
代
谢产物进行了比较分析!并测定了气体
@A@B
胁迫下野生型和转基因天竺葵的生理生化指标结果显示$"
#
#
!
2274
(
J
(#液体
@
#%
A@B
胁迫下!过表达
,-.
%
,-/
基因增强了卡尔文循环在转基因天竺葵
@
#%
A@B
代谢中的
作用!使糖类物质生成量增加约
!+K$
倍!同时改变了天竺葵中原有
@A@B
代谢途径"
!
#
&K
"
:
(
J
(#的气体
@A@B
胁迫下!转基因天竺葵叶片中
@
!
B
!
)丙二醛和蛋白羧基的含量显著小于野生型"
%
#在环境污染气体
@A@B
的胁迫下!转基因天竺葵叶片的
@A@B
吸收效率和气孔传导率显著高于野生型研究表明!过表达
,-.
%
,-/
基因能够有效地提高天竺葵净化环境中污染气体
@A@B
的能力
关键词$
,-.
%
,-/
基因&转基因天竺葵&
@A@B
代谢&生理特性
中图分类号$
LK)
文献标志码$
D
$%&(")#*+&,-
.
/0!1(/"2
3
%5
3
*#&
.
"6
7"28)!%,
.
!%#09%20#:8;0&2"!:*%!1!0
%
1!29%0%/
M@BNE690
:
*
90
!
OPDBE80
Q
.0
!
@DGE6830
:
!
ONDGO.8R.3
!
ENGM690
!
JPF8056.
!
A@1GJ.29.
"
"
?3;84S
T
7UJ.U9E;.90;930VW.7S9;60747
:T
!
F802.0
:
N0.X9=/.S
T
7UE;.90;930VY9;60747
:T
!
F802.0
:
,$"$""
!
A6.03
#
1(/&2*&
$
Y6.//S8V
T
7X9=9R
>
=9//9VV.6
T
V=7R
T
3;9S709/
T
0S63/9
"
,-.
#
30VV.6
T
V=7R
T
3;9S709<.03/9
"
,-/
#
:
909/
!
Z6.;63=9SZ7<9
T:
909/U7=U7=234V96
T
V9
"
@A@B
#
3//.2.43S.70.029S6
T
47S=7
>
6.;
T
93/S/
!
.0;647=7
>
43/S/7U
:
9=30.82S77[S3.0S=30/
:
90.;
:
9=30.82Z.S6CDE
%
CDF@A@B3//.2.43S.70
>
3S6Z3
T
!
Y6929S3[74.S9/7UZ.4VS
T>
930VS=30/
:
90.;
:
9=30.8280V9=4.
Q
8.V@
#%
A@B/S=9//Z9=9;72
>
3=3S.X94
T
303*
4
T
59V[
T
#%
A*GHI
!
30VS69
>
6
T
/.747
:
.;3430V[.7;692.;34.0V9R9/7UZ.4VS
T>
930VS=30/
:
90.;
:
9=30.8280*
V9=&K
"
:
(
J
(#
:
3/978/@A@B/S=9//Z9=9293/8=9V+Y69=9/84S//67Z9VS63S
$"
#
#
N0V9=!2274
(
J
(#
4.
Q
8.V@
#%
A@B/S=9//
!
7X9=9R
>
=9//.707U,-.
%
,-/
:
909/90630;9VS69=7497UA34X.0;
T
;49V8=.0
:
S69@
#%
A@B29S3[74./2.0S=30/
:
90.;
:
9=30.82
!
S69=9[
T
S69
T
.94V7U/8
:
3=/.0;=93/9V3
>>
=7R.23S94
T
!+K$*U74V
!
30V/.284S30978/4
T
;630
:
9VS697=.
:
.034@A@B29S3[74.;
>
3S6Z3
T
/7U
:
9=30.82+
"
!
#
N0V9=&K
"
:
(
J
(#
:
3/978/@A@B/S=9//
!
S69;70S90S/7U@
!
B
!
!
23470V.34V96
T
V930V
>
=7S9.0;3=[70
T
4.0S=30/
:
90.;
:
9=30.82
493X9/Z9=928;649//S630S67/97UZ.4VS
T>
9+
"
%
#
N0V9=90X.=70290S*
>
748S9V
:
3/978/@A@B/S=9//
!
S69
3[/7=
>
S.X9;3
>
3;.S
T
7U@A@B30V/S723S3;70V8;S30;9.0S=30/
:
90.;
:
9=30.82493X9/=923.09V/.
:
0.U.;30S4
T
6.
:
69=S630S67/97UZ.4VS
T>
9+Y69/9=9/84S//8
::
9/SS63S7X9=9R
>
=9//.707U,-.
%
,-/
:
909/;309UU9;*
S.X94
T
.2
>
=7X9S693[.4.S
T
7U
:
9=30.82S7
>
8=.U
T
S6990X.=70290S34*
>
748S9V
:
3/978/@A@B+
<%
.
-"2!/
$
,-.
%
,-/
:
909/
&
S=30/
:
90.;
:
9=30.82
&
@A@B29S3[74./2
&
>
6
T
/.747
:
.;34;63=3;S9=./S.;/
!!
甲醛"
@A@B
#污染以其来源广)污染重)治理
难而成为一个重要的环境问题在众多治理
@A@B
污染的方法中!生物净化法以其简单自然)
经济)科学以及持久有效等优点受到广泛关注对
生物净化法的机理研究发现微生物和植物都能吸收
和代谢
@A@B
+
#*$
,
虽然植物能够吸收并代谢
@A@B
!但环境中极低浓度的气体
@A@B
就会对
植物产生胁迫!导致叶片气孔传导率下降!无法快速
有效吸收
@A@B
供植物代谢+,,在植物体中过量
表达
@A@B
同化途径的相关酶能够提高植物吸收
和代谢
@A@B
的能力+*#",甲基型营养酵母的木
酮糖单磷酸途径"
O8H#能够同化
@A@B
!在该途
径中同化
@A@B
的关键酶是二羟基丙酮激酶
"
CDE
#和二羟基丙酮合酶"
CDF
#!在
CDE
作用下!
$*
磷酸木酮糖"
O8$#可以固定
@A@B
!生成三磷酸
甘油醛"
]D#和二羟丙酮"
C@D
#!
C@D
对细胞有
毒!但可以通过
CDF
的作用形成无毒的磷酸二羟
基丙酮 "
C@D#
+
##
,
该
@A@B
固定途径中的
O8$)
]D和
C@D是植物卡尔文循环途径中的
关键中间代谢产物因此!如果在植物叶绿体中过
量表达来自于甲基型营养酵母中的
,-.
%
,-/
基
因!也许可以在植物叶绿体中构建一条光合
@A@B
图
#
!
在植物叶绿体中过表达
,-.
%
,-/
基因安装光合
@A@B
同化途径策略
O8$\+$*
磷酸木酮糖&
C@D+
二羟基丙酮&
C@D\+
磷酸二羟丙酮&
I8W\+
核酮糖
*#
!
$*
二磷酸&
]D\+%*
磷酸甘油醛&
?W\+
果糖
*#
!
,*
二磷酸&
1&\+
赤鲜糖
*&*
磷酸&
EW\+
景天庚酮糖
*#
!
*
二磷酸&
E\+
景天庚糖酮糖
**
磷酸&
]48;+
葡萄糖&
?=8;+
果糖
?.
:
+#
!
C.3
:
=327U/S=3S9
:T
U7=.0/S343S.707U3
>
67S7/
T
0S69S.;@A@B*3//.2.43S.70
>
3S6Z3
T
[
T
7X9=*
9R
>
=9//.70.0
:
,-.
%
,-/
:
909/.0;647=7
>
43/S/7U
>
430S
O8$\+O
T
4847/9*$*
>
67/
>
63S9
&
C@D+C.6
T
V=7R
T
3;9S709
&
C@D\+C.6
T
V=7R
T
3;9S709
>
67/
>
63S9
&
I8W\+I.[847/9#
!
$*
[./
>
67/
>
63S9
&
]D\+]4
T
;9=34V96
T
V9%*
>
67/
>
63S9
!
?W\+?=8;S7/9*#
!
,*[./
>
67/
>
63S9
&
1&\+1=
T
S6=7/9*&*
>
67/
>
63S9
!
EW\+E9V769
>
S847/9*#
!
*[./
>
67/
>
63S9
!
E\+E9V769
>
S847/9*
*
>
67/
>
63S9
&
]48;+]48;7/9
&
?=8;+?=8;S7/9
同化途径"图
#
#为此!
O.37
等+#!,在模式植物烟草
的叶绿体中过量表达
,-.
%
,-/
基因!结果表明该
途径能够在烟草的叶绿体中发挥作用!并提高了转
基因烟草吸收和同化
@A@B
的能力
天竺葵以其娇艳的花色)多变的花瓣和较长的
花期而逐渐成为室内装饰及露天花坛使用的主要材
料之一它能够通过组织培养快速繁殖!常被用作
转基因操作的材料本研究以天竺葵为材料!在野
生型天竺葵的叶绿体中过量表达
,-.
和
,-/
基
因!利用#%
A*GHI
技术对液体
@
#%
A@B
胁迫下野
生型和转基因天竺葵叶片
@
#%
A@B
代谢产物进行
比较分析!并通过测定气体
@A@B
胁迫下野生型
和转基因天竺葵的生理生化指标!分析其对天竺葵
@A@B
抗性)
@A@B
吸收效率以及气孔传导率的
影响!为利用
,-.
%
,-/
基因开发转基因观赏植物
治理气体
@A@B
污染的技术提供理论依据
#
!
材料和方法
=+=
!
天竺葵的转化和培养
无菌野生型天竺葵在
HE
培养基"
>
@$+
#上
培养天竺葵的转化参照
E70
:
等+#",的方法进行
含 有
>
F2*%$E*\=[;E*
"
Y*,-/*\IBJC*\=[;E*
"
Y*,-.
+
#!
,表达载体的农杆菌+
-
&
%0$12"%)*+2*3
+"
4
$1)"(5A$KA#
"
>
H\)"
#,培养于含有
#""
"
:
(
2J
(#
E
>
9
液体
JW
培养基中天竺葵的转化采用
农杆菌介导的叶柄共培养方法+#%,在含有
$"
"
:
(
2J
(#卡那霉素"
F2
#的
HE
"含有
#^
蔗糖!
6
%
7
#培
养基上筛选转基因天竺葵小苗
为了得到天竺葵的无菌苗!抗性芽首先在含有
$"
"
:
(
2J
(#
F30
的
HE
培养基上筛选!然后转移
到含有
%^
蔗糖的
HE
培养基!并且在
!$_#""
"
274
(
2
(!
(
/
(#恒定光照下培养将筛选到的具
有
F2
抗性的天竺葵小苗转移到含有
%^
蔗糖的
HE
培养基上继续培养!获得无菌转基因天竺葵幼
苗此外!获得的具有
F2
抗性且生根的天竺葵小
苗转移到含有
#
%
!
珍珠岩和
#
%
!
有机土的花盆中培
养!获得土壤栽培的转基因天竺葵植株
=>?
!
基因组
+5@
和
A%/&%20()"&
分析
用
AYDW
法+#&,从野生型和
Y
#
代转基因株系
叶片中提取基因组
CGD
作为模板分别用
,-.
的上下游引物"
,-.*?
$
*`ADYYDYAYD]DADY*
]DD]YYAADA*%`
%
,-.*I
$
*`YDDDY]DYYYY*
]DYADY]YYYY]]*%`
#和
,-/
的上下游"
,-/*
?
$
*`AY]DD]]DDD]AYY]DYAYA*%`
%
,-/*I
$
&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
$`*AYDADDAYY]]YYYAD]DYYY]*%`
#进行
\AI
扩增!检测
,-.
和
,-/
基因在转基因株系基因组
的整合情况
用
\430SY7S34\=7S9.01RS=3;S.70<.S
"
E.
:
23
#提取
野生型和转基因株系新鲜叶片组织的总蛋白取
#$
"
:
总蛋白通过
ECE*\D]1
"浓度为
#!^
#分离后转移
至
\aC?*膜上分别以假丝酵母"
8$(9)9$0)9)()
E!
#和毕赤酵母"
!)1:)$
;
$52%)5]E##$
#制备的粗蛋
白"
$
"
:
#为阳性对照"
\AF
#!随后用
8<0)9)()E!
和
!<
;
$52%)5]E##$
的
CDE
和
CDF
蛋白的鼠抗+#!,作
一抗孵育过夜!再用辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗
室温孵育
!6
!洗膜后加入
#2JJ82.074
%
10630;9=
/748S.70
和
#2JAJ\9=7R.V9/748S.70
"
\P1IA1
#!混
匀!浸润整个
\aC?
膜!在凝胶成像系统上用
A692.*
V79OIE
"
WPB*IDC
#观测结果
=>B
!
C
=B
5CD
)
EC
=B
5D
B
标记与=B
5FE$@
分析
@
#%
A@B
和
G3@
#%
AB
%
购于美国
APJ
公司!液
体
@
#%
A@B
和
G3@
#%
AB
%
处理在组培瓶中进行!从
无菌培养的天竺葵植株上分别取叶片
!
:
!用
!
2274
(
J
(#液体
@
#%
A@B
"含
$2274
(
J
(#
F@*
AB
%
!
"+#^ H1E
!
6
%
7
#处理野生型天竺葵"
@
#%
A@B
%
bY
#和转基因天竺葵植株
\EF$
"
@
#%
A@B
%
\EF$
#叶片
&6
!用
$2274
(
J
(#
G3@
#%
AB
%
"含
$
2274
(
J
(#
F@AB
%
!
"+#^ H1E
#溶液处理野生型
天竺 葵 "
G3@
#%
AB
%
bY
#叶 片
&6
!以 未 经 过
@
#%
A@B
处理的野生型天竺葵叶片为对照"
AF
#
在整个处理期!于
!$_
的组培室中!
&6
光照下摇
床振荡"
#""=
(
2.0
(#
#培养!处理结束后!分别用预
冷无菌蒸馏水冲洗叶片
&
#
$
次!去除叶片表面残留
的
@
#%
A@B
和
G3@
#%
AB
%
!无菌吸水纸吸干叶片表
面残留水分!液氮速冻!置于
(K"_
冰箱备用
#%
A*GHI
分析如下$取
(K"_
冰箱中冻存的
叶片!在液氮中研磨!加
%2J#""2274
(
J
(#磷酸
钾缓冲液"
F\W
!
>
@+&
#抽提可溶性代谢产物!经
沸水浴加热处理
%2.0
使酶失活!
&_
下
#!"""
:
离心
!"2.0
上清液经真空冷冻干燥后!用
"+$2J
的
F\W
缓冲液溶解!
&_
下
#!"""
:
离心
%2.0
!取
上清装入核磁管!并加入适量甲酰胺做内参和
$^
!
@
!
B
"
7
%
7
#
#%
A*GHI
分析在布鲁克核磁共振仪
"
CIO$""*H@5
#上进行!使用相关参数如下$宽带
质子去耦!
$*2/
"
)"c
#脉冲!谱宽
%$)&@5
!采样时
间
"+$/
!延滞时间
#+!/
!样品温度保持在
!$_
!每
个样品采集
%!"""
个数据点!扫描
#!""
次!处理数
据时线宽为
&@5

@
#%
A@B
标记样品中化学位移
时参照甲酰胺碳原子共振峰"
#,,+,,
>>
2
#
GHI
谱中共振峰通过和已知化合物#%
A*GHI
谱进行比
较鉴定在计算不同样品中各代谢物的相对含量时
目标共振峰以甲酰胺为内参进行积分
=+G
!
测定项目和方法
=>G>=
!
天竺葵对
C5CD
抗性分析
!
将野生型和转
基因植株
\EF$
幼苗置于含有
HE
固体培养基的培
养瓶内!
$_#""
"
274
(
2
(!
(
/
(#持续光照培养
!
周后!在其中加入一个去盖的
$""
"
J
的离心管!吸
取
%"
"
J%^
的
@A@B
溶液至该离心管中由于
@A@B
极易挥发!
@A@B
气体很快充满密闭空间!
使整个瓶中的
@A@B
浓度达到
&K
"
:
(
J
(#
!继续
培养
#$V
后观察天竺葵的生长状态并采集图片
=>G>?
!
丙二醛"
$H1
#)
C
?
D
?
和蛋白羧基"
+5
#含量
测定
!
将野生型和转基因植株
\EF$
幼苗置于含有
HE
固体培养基的密封盒"
%"2J
#内
!$_ #""
"
274
(
2
(!
(
/
(#持续光照培养
%
#
&
周生根后!在
其中加入一个去盖的
$""
"
J
离心管!吸取
%"
"
J
%^ @A@B
溶液!使
@A@B
浓度达到
&K
"
:
(
J
(#
!处理
!&6
后收集叶片!液氮速冻!置于
(K"_
冰箱备用参照
]8=94
等+#$,的方法测定
HCD
和
\A
含量参照
]3
T
等+#,,的方法测定
@
!
B
!
含量
=>G>B
!
气体
C5CD
胁迫下天竺葵
C5CD
吸收效率
和气孔传导率的测定
!
将温室条件下盆栽培养的生
长良好)株龄和长势一致的的野生型和转基因植株
放入一个三面由压缩板材"
$)d&"d&K;2
#组成)一
面有玻璃门的柜子里进行
!&6@A@B
胁迫处理!
分别于
K
$
""
)
#%
$
""
)
#K
$
""
和次日
K
$
""
用便携式甲
醛检测仪"
\\H&"" @Ya
!英国#测定柜子内的
@A@B
浓度!以未放入植株的空柜为对照"
AF
#
#!
同时用光合作用测量系统"
AP*%&"
!美国#测定叶片
的气孔传导率!以相同光照和温湿度条件的柜外野
生型植株为对照"
AF
!
#
=+I
!
数据的统计分析
所有生理生化指标分析均进行
%
次重复用
H.;=7/7US1R;94!""%
软件进行数据处理和作图!用
C\E+"$
软件进行方差分析和多重比较"
C80;30
法#&用
?
检验差异的显著性
!
!
结果与分析
?+=
!
转基因天竺葵的鉴定
为了检测具有
F2
抗性的天竺葵植株基因组中
是否含有目的基因!以野生型和筛选出的转基因株
系"
\EF#
)
\EF&
和
\EF$
#基因组为模板进行
\AI
$
&
期
!!!!!!!!!!
周升恩!等$转
,-.
%
,-/
基因天竺葵甲醛代谢途径与吸收能力研究
分析!结果表明!转基因株系 "
\EF#
)
\EF&
和
\EF$
#可以扩增出与阳性对照"
,-.
%
,-/;CGD
编码区#相同的目的条带"约
"+$<[
#!而野生型则
没有扩增出任何条带"图
!
!
D
)
W
#!说明
,-.
和
,-/
基因均已插入到转基因株系的基因组中
为检测目的基因在转基因株系中的表达水平!
b9/S9=0[47S
分析结果表明!
%
株
\AI
阳性植株和
阳性对照"
\AF
#中都能检测到非常强的
+&的
CDE
和
,,+的
CDF
信号条带!而野生型中没
有检测到相应的信号条带"图
!
!
A
)
C
#这
%
个转基
因株系中
\EF$
中目的基因的表达水平最高!
\EF&
次之!最弱的是
\EF#
以上结果说明
,-.
%
,-/
基因在这
%
个转基因株系中能正常表达!因此可以
将这
%
个转基因株系进行继代用于后续实验
?>?
!
转基因天竺葵的
C
=B
5CD
代谢产物分析
为了考察过表达
,-.
和
,-/
基因所形成的
@A@B
同化途径是否在转基因天竺葵中引导
@A@B
代谢流进入卡尔文循环!以及其发挥作用时
是否改变天竺葵原有
@A@B
代谢途径!#%
A*GHI
分 析 比 较 了
@
#%
A@B
%
bY
)
@
#%
A@B
%
\EF$
及
G3@
#%
AB
%
bY
处理叶片的代谢谱!并以未经任何
处理的野生型天竺葵抽提物作为对照"
AF
#检测叶
片的背景#%
A*GHI
信号水平!通过积分的方法计算
代谢产物的相对含量由于过量表达
,-.
%
,-/
基因所形成的
@A@B
同化途径与卡尔文循环偶
联!
@
#%
A@B
%
\EF$
和
G3@
#%
AB
%
bY
处理叶片的
代谢谱应该相似实验结果表明"图
%
#!
@
#%
A@B
%
\EF$
与
G3@
#%
AB
%
bY
代谢产物相对含量的变化
趋势相似此外!对+
N*
#%
A
,
]48;
"葡萄糖#和+
N*
#%
A
,
?=8;
"果糖#相对含量分析结果显示"图
%
!
D
#!与
AF
相比!
@
#%
A@B
%
bY
处理叶片中+
N*
#%
A
,
]48;
和+
N*
#%
A
,
?=8;
相对含量都下降了!以+
N*
#%
A
,
]48;
下降最为明显"
!
#
"+"$
#!下降为
AF
的
$^
!可见
野生型天竺葵叶片通过消耗内源性
]48;
和
?=8;
来
响应
@A@B
胁迫而
@
#%
A@B
%
\EF$
处理叶片中
+
N*
#%
A
,
]48;
和+
N*
#%
A
,
?=8;
的相对含量分别增加
为
@
#%
A@B
%
bY
处理的
#+K,
和
#!+#)
倍!说明过
表达
,-.
和
,-/
基因成功将
@
#%
A@B
的#%
A
代
谢流引入卡尔文循环!使得糖类物质的生成量为
@
#%
A@B
%
bY
处理的
!+K$
倍
进一步对
@
#%
A@B
代谢重要产物分析结果显
示!与
AF
相比!
@
#%
A@B
%
bY
处理叶片中+
N*
#%
A
,
A.S
"柠檬酸#相对含量与
AF
没有显著性差异"
!
$
"+"$
!图
%
!
W
#但是
@
#%
A@B
%
\EF$
处理叶片中
+
N*
#%
A
,
A.S
的相对含量比
@
#%
A@B
%
bY
处理和
AF
呈显著性地降低"
!
#
"+"$
!图
%
!
W
#+
#*
#%
A
,
]4
T
"甘氨酸#的变化趋势与+
N*
#%
A
,
A.S
相似!说明
过表达
,-.
%
,-/
基因削弱了转基因天竺葵通过
@
#%
A@B
代谢合成+
N*
#%
A
,
A.S
和+
#*
#%
A
,
]4
T
的途
径相反!在
@
#%
A@B
%
\EF$
处理叶片中产生了
+
!*
#%
A
,
]4
T
!+
!*
#%
A
,
H34
"苹果酸#)+
%*
#%
A
,
E9=
"丝氨
酸#)+
!*
#%
A
,
]48
"谷氨酸#)+
%*
#%
A
,
D/
>
"天冬氨酸#
以及+
%*
#%
A
,
\D
"丙氨酸#等有机酸"图
%
!
A
#!而在
@
#%
A@B
%
bY
处理叶片和
AF
中大多没有检测到
这些有机酸!说明转基因天竺葵中通过
@
#%
A@B
代
谢产生这些有机酸的途径得到增强
?>B
!
气体
C5CD
胁迫下转基因天竺葵的抗性和抗
氧化能力分析
环境中
@A@B
污染主要以气体形式存在为
了考察过表达
,-.
%
,-/
基因对天竺葵气体
@A@B
抗性的影响!用
&K
"
:
(
J
(#气体
@A@B
处
理野生型和转基因植株
\EF$
的无菌苗
#$V
!结果
表明转基因植株的生长状态比野生型的好!叶片白
化现象较轻"图
&
#!这表明过表达
,-.
%
,-/
增强
了转基因植株对气体
@A@B
的抗性
@
!
B
!
)
HCD
和
\A
是细胞氧化损伤的产物!在
图
!
!
,-.
和
,-/
基因在转基因株系中整合与表达的分析
D
)
W
表示基因组
\AI
检测
,-.
"
D
#和
,-/
"
W
#基因在转基因株系中的整合情况&
A
)
C
表示
b9/S9=0[47S
分析
,-.
"
A
#和
,-/
"
C
#基因在转基因株系中的表达情况&
bY+
野生型&
\EF#
)
\EF&
)
\EF$+
不同转基因株系&
\AF+
阳性对照
?.
:
+!
!
D034
T
/./7US69.0S9
:
=3S.7030V9R
>
=9//.707U,-.30V,-/
:
909/.0S=30/
:
90.;4.09/
]9072.;\AI3034
T
/./S7V9S9;SS69.0S9
:
=3S.707U,-.
"
D
#
30V,-/
"
W
#
:
909/.0S=30/
:
90.;4.09/
&
b9/S9=0[47S3034
T
/./S7V9S9;SS699R
>
=9//.707U,-.
"
A
#
30V,-/
"
C
#
:
909/.0S=30/
:
90.;
4.09/
&
bY+b.4VS
T>
9
&
\EF#
!
\EF&
!
\EF$+C.UU9=90SS=30/
:
90.;4.09/
&
\AF+\7/.S.X9;70S=74
,
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
%
!
#%
A*GHI
分析野生型和转基因植株
@
#%
A@B
和
G3@
#%
AB
%
代谢产物
AF+
野生型&
@
#%
A@B
%
bY+!2274
(
J
(#液体
@
#%
A@B
处理野生型&
G3@
#%
AB
%
%
bY+$2274
(
J
(#液体
G3@
#%
AB
%
处理野生型&
@
#%
A@B
%
\EF$+!2274
(
J
(#液体
@
#%
A@B
处理转基因植株
\EF$
&不同字母表示在
"+"$
水平有显著性差异&下同
?.
:
+%
!
#%
A*GHI3034
T
/./7U@
#%
A@B30VG3@
#%
AB
%
29S3[74.S9/.0Z.4VS
T>
930VS=30/
:
90.;
>
430S
AF+b.4VS
T>
9
&
@
#%
A@B
%
bY+b.4VS
T>
9S=93S9VZ.S6!2274
(
J
(#
4.
Q
8.V@
#%
A@B
&
G3@
#%
AB
%
%
bY+b.4VS
T>
9S=93S9VZ.S6$2274
(
J
(#
4.
Q
8.VG3@
#%
AB
%
&
@
#%
A@B
%
\EF$+Y=30/
:
90.;
>
430S\EF$S=93S9VZ.S6!2274
(
J
(#
4.
Q
8.V@
#%
A@B
&
C.UU9=90S49SS9=/.0V.;3S9/.
:
0.U.;30SV.UU9=90;93SS69"+"$49X94+Y69/3293/[947Z
图
&
!
气体
@A@B
胁迫下野生型和
转基因植株的生长状态
bY+
野生型&
\EF$+
转基因植株
?.
:
+&
!
Y69
:
=7ZS6/S3S897UZ.4VS
T>
930V
S=30/
:
90.;
>
430S80V9=
:
3/978/@A@B/S=9//
bY+b.4VS
T>
9
&
\EF$+Y=30/
:
90.;
>
430S
植物受到环境胁迫时其含量会明显增加可作为氧
化胁迫的指标!反映植物抗氧化能力的强弱对野
生型和转基因植株
\EF$
叶片中
@
!
B
!
含量的分析
结果显示!在
&K
"
:
(
J
(#气体
@A@B
胁迫下!野生
型和转基因植株叶片中
@
!
B
!
含量明显升高"图
$
#!说明气体
@A@B
对天竺葵叶片产生氧化胁迫!
但是转基因植株叶片中
@
!
B
!
含量升高的幅度小于
野生型!说明过表达
,-.
%
,-/
基因可以缓解气体
图
$
!
气体
@A@B
胁迫下野生型和转基因植株
叶片
@
!
B
!
)
HCD
和
\A
含量变化
"6
%
bY+
野生型&
"6
%
\EF$+
转基因植株&
!&6
%
bY+&K
"
:
(
J
(#
气体
@A@B
处理
!&6
的野生型&
!&6
%
\EF$+&K
"
:
(
J
(#
气体
@A@B
处理
!&6
的转基因植株
\EF$
?.
:
+$
!
A630
:
9/7US69@
!
B
!
!
HCD30V\A
;70S90S/.0S69493X9/7UZ.4VS
T>
930VS=30/
:
90.;
>
430S80V9=
:
3/978/@A@B/S=9//
"6
%
bY+b.4VS
T>
9
&
"6
%
\EF$+Y=30/
:
90.;
>
430S
&
!&6
%
bY+b.4V
S
T>
9S=93S9VZ.S6&K
"
:
(
J
(#
:
3/978/@A@BU7=!&6
&
!&6
%
\EF$
&
Y=30/
:
90.;
>
430SS=93S9VZ.S6
&K
"
:
(
J
(#
:
3/978/@A@BU7=!&6
@A@B
胁迫下天竺葵叶片受到的氧化胁迫
&K
"
:
(
J
(#气体
@A@B
胁迫还引起野生型和转基因天竺

&
期
!!!!!!!!!!
周升恩!等$转
,-.
%
,-/
基因天竺葵甲醛代谢途径与吸收能力研究
图
,
!
野生型和转基因株系
@A@B
吸收能力"
D
#和气孔传导率"
W
#分析
D+
野生型和转基因株系吸收柜内气体
@A@B
能力分析&
W+
柜外处理野生型以及柜内处理野生型和转基因
株系气孔传导率分析&
AF
#
+
空柜&
AF
!
+
柜外处理野生型!
bY+
野生型&
\EF#
)
\EF&
)
\EF$+
不同转基因株系
?.
:
+,
!
D034
T
/./7US69@A@B*8
>
S3<9;3
>
3;.S
T
"
D
#
30V/S723S34;70V8;S30;9/7UZ.4VS
T>
930VS=30/
:
90.;4.09/
"
W
#
D+D034
T
/./7US69@A@B*8
>
S3<9;3
>
3;.S
T
7UZ.4VS
T>
930VS=30/
:
90.;4.09/.0;3[.09
&
W+D034
T
/./7US69
/S723S34;70V8;S30;97UZ.4VS
T>
978S*;3[.09S30VZ.4VS
T>
930VS=30/
:
90.;4.09/.0;3[.09S
&
AF
#
+12
>
S
T
;3[.09S
&
AF
!
+b.4VS
T>
9
>
43;9V78S*;3[.09S
&
bY+b.4VS
T>
9
&
\EF#
!
\EF&
!
\EF$+C.UU9=90SS=30/
:
90.;4.09/
葵叶片中
HCD
和
\A
"图
$
#含量的显著升高!说明
气体
@A@B
胁迫引起天竺葵叶片中膜脂和蛋白质
的过氧化!但是
HCD
和
\A
的含量在转基因植株
叶片中上升的幅度比野生型小!说明过表达
,-.
%
,-/
基因减轻了气体
@A@B
胁迫下转基因植株
叶片中膜脂和蛋白质的过氧化作用
?>G
!
转基因天竺葵吸收环境污染气体
C5CD
能力
的分析
压缩板在家具家装中的使用非常广泛!压缩板
中使用的树脂脲醛!是室内排放
@A@B
的最大来
源用压缩板材做成的柜子内有一定浓度的
@A@B
污染为了考察过表达
,-.
%
,-/
基因天
竺葵吸收家具中释放的气体
@A@B
的能力!对野
生型和转基因植株吸收家具中释放的气体
@A@B
的能力进行了检测结果发现!柜内的
@A@B
浓
度从
K
$
""
至
#K
$
""
处理期间!空柜内
@A@B
浓度
"
AF
#
#先随温度上升而升高!到晚上温度下降时回
落至接近早上的水平"图
,
!
D
#放入天竺葵后柜内
@A@B
浓度在各个测定时间点都下降了当放入
转基因植株
\EF#
)
\EF&
和
\EF$
时!柜 子 内
@A@B
浓度在
#K
$
""
分别下降到野生型的
,%^
)
,)^
和
$K^
"图
,
!
D
#!可见转基因植株比野生型具
有更强的吸收柜内
@A@B
的能力
叶片对气体
@A@B
的吸收主要通过气孔进
行!用光合测量系统测定了野生型和转基因植株叶
片的气孔传导率!结果表明"图
,
!
W
#!
K
$
""
时柜内
野生型和
%
个转基因株系叶片的气孔传导率与柜外
野生型"
AF
!
#差别不大"
!
$
"+"$
#!
#%
$
""
)
#K
$
""
和
次日
K
$
""
测得的转基因株系
\EF#
)
\EF&
和
\EF$
叶片气孔传导率均明显高于野生型!而以
#%
$
""
时
差别最明显!转基因株系
\EF#
)
\EF&
和
\EF$
叶
片的气孔传导率分别是野生型的
!+$
)
!+
和
!+K
倍!说明气体
@A@B
胁迫下!过表达
,-.
%
,-/
基
因使转基因植株叶片的气孔传导率得以恢复
%
!
讨
!
论
E70
:
等+#",和
O.37
等+#!,的研究发现!在植物体
中引入与卡尔文循环相偶联的代谢途径!能够促进
植物通过该途径代谢
@A@B
!生成大量的糖类物
质本研究也发现!在
!2274
(
J
(#液体
@
#%
A@B
处理下!转基因天竺葵糖类质的生成量大约是野生
型的
!+K$
倍!说明过表达
,-.
%
,-/
基因所形成
的
@A@B
同化途径成功将
@A@B
代谢流引入卡
尔文循环但是!目前没有研究报道与卡尔文循环
相偶联的代谢途径的引入是否改变植物原有的
@A@B
代谢途径本研究通过分析了其他重要
@A@B
代谢产物在转基因天竺葵叶片中含量的变
化发现!转基因天竺葵叶片中的+
N*
#%
A
,
A.S
和+
#*
#%
A
,
]4
T
生成量显著低于野生型!并且产生了+
!*
#%
A
,
]4
T
)+
!*
#%
A
,
H34
)+
%*
#%
A
,
E9=
)+
!*
#%
A
,
]48
)+
%*
#%
A
,
D/
>
以及+
%*
#%
A
,
\D
等有机酸研究表明!进入植
物体的
@A@B
首先在
@A@B
脱氢酶"
?DJC@
#催
化
@A@B
下氧化为
@ABB@
!该反应是可逆的!且
不能直接以游离
@A@B
为底物!
@A@B
需要和谷
胱甘肽"
]E@
#结合为加合物
E*
羟甲基谷胱甘肽
"
@H*]E@
#才能被
?DJC@
催化!虽然
?DJC@
对
@H*]E@
的
F2
值很小!但
@H*]E@
的浓度由细
胞内
]E@
控制+#,而
CDE
催化
@A@B
和
$*
磷酸
K
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
木酮糖的反应是不可逆的!
CDE
可以游离
@A@B
为底物!
@A@B
的
F2
值约为
#+&2274
(
J
(#
!反
应不需要任何辅助因子参与就可以启动+#K,由于
CDE
和
?DJC@
催化反应的生化特性不同!使得二
者在同时竞争结合进入细胞中的
@A@B
时!
CDE
催化的反应更有优势!使得过表达
,-.
%
,-/
基因
所形成的
@A@B
同化途径发挥作用!增加了
@
#%
A@B
的#%
A
代谢流进入卡尔文循环的量!从而降低
@
#%
A@B
进入其它代谢途径的量据此推测
+
N*
#%
A
,
A.S
和+
#*
#%
A
,
]4
T
可能是由
?DJC@
催化的
下游代谢途径所产生!而+
!*
#%
A
,
]4
T
)+
!*
#%
A
,
H34
)
+
%*
#%
A
,
E9=
)+
!*
#%
A
,
]48
)+
%*
#%
A
,
D/
>
以及+
%*
#%
A
,
\D
是卡尔文循环的下游途径产生的!至于这两条途径
的下游途径有待进一步的研究
E70
:
等+#",研究表明!在天竺葵叶绿体中过量
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,-.
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基因提高了转基因天竺葵对
@A@B
的抗性和吸收
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次证实了在植物叶绿体中过量表达来自于甲基型营
养酵 母 中 的
,-.
%
,-/
基 因!构 建 一 条 光 合
@A@B
同化途径提高植物吸收和代谢
@A@B
能力
的策略是可行的!这为今后开发转基因观赏植物治
理气体
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基因天竺葵甲醛代谢途径与吸收能力研究