全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#""")$"!*
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-
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收稿日期$
!"#$)"*)!"
&修改稿收到日期$
!"#$)"1)"*
基金项目$国家自然科学基金"
%#""!$
#
作者简介$王
!
玮"
#&1%(
#!女!在读博士研究生!主要从事植物激素信号转导研究
2)34.5
$
67.640
8
"&
!
59:+7;:+<0
"
通信作者$侯岁稳!博士!教授!博士生导师!主要从事植物分子细胞生物学研究
2)34.5
$
=>:/6
!
59:+7;:+<0
拟南芥蛋白磷酸酶
$%&&
的
原核表达和多克隆抗体纯化
王
!
玮!管利萍!张
!
静!陈
!
亮!李
!
猛!侯岁稳"
"兰州大学 细胞活动与逆境适应教育部重点实验室!生命科学学院!兰州
%""""
#
摘
!
要$以拟南芥野生型
?>5)"
为材料!对其
@
型蛋白磷酸酶"
ABCC
#家族进行序列分析!对家族成员之一的
ABCC$
进行原核表达及多克隆抗体的制备和纯化结果显示$"
#
#该研究构建出原核表达载体
D
2EF)$A)%)
ABCC$
和
D
2A)!14)EGC)H#*"
并转入大肠杆菌
IJ!#
"
K2%
#中"
!
#经
@CAE
诱导!表达出分子量约为
,!LK
的
EMA)ABCC$
和分子量约为
%$LK
的
N./)EGC)H#*"
可溶性重组蛋白"
%
#纯化的重组蛋白
EMA)ABCC$
作为抗原
免疫新西兰兔后!获得了效价大于
#O$"""""
的多克隆抗体血清"
$
#抗体血清经连接了
N./)EGC)H#*"
蛋白的
溴化氢活化的树脂纯化!得到特异性较高的
40P.)ABCC$
多克隆抗体研究认为!该研究纯化出了特异的
ABCC$
蛋白多克隆抗体
关键词$拟南芥&蛋白磷酸酶&
ABCC$
&多克隆抗体&抗体纯化
中图分类号$
Q1&
文献标志码$
R
&(")*(
+
",#-./
0
(122#"3*3!&"4
+
-4"3*453,#6"!#12&7(#8#-*,#"3
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3-3
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8
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D
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7>07
D
Z>P7.0
D
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D
=4P4/7
"
ABCC
#
[43.5
X
+A=7ABCC$
!
4373Y7Z>[ABCC[43.5
X
!
64/
D
Z>L4Z
X
)
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D
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D
Z7
D
4Z740;
D
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X
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#
#
A=7
D
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L4Z
X
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D
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D
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D
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D
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"
K2%
#
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#
A=7/>5:Y57EMA)ABCC$
D
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EGC)H#*"
D
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D
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X
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#
A=7Z7<>3Y.040P
D
Z>P7.0EMA)ABCC$
64/
D
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!
40;P=70:/7;4/P=740P.
8
70P>.33:07P=7Z4YY.P/+A=7
D
Z7
D
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D
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X
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$
#
A=7/7Z:364/
D
:Z.[.7;Y
X
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Z>/7
!
6=.<=64/5.0L7;6.P=N./)EGC)H#*"
D
Z>P7.0
!
P>>YP4.040P.)ABCC$
D
>5
X
<5>04540P.Y>;.7/6.P=
8
Z74P
/
D
7<.[.<.P
X
+B:Z/P:;.7//:
88
7/P7;P=4PP=7/
D
7<.[.D
>5
X
<5>04540P.Y>;.7/=4\7Y770
D
:Z.[.7;+
:1
+
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D
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D
=4P4/7
&
ABCC$
&
D
>5
X
<5>04540P.Y>;.7/
&
40P.Y>;
XD
:Z.[.<4P.>0
!!
蛋白磷酸酶"
D
Z>P7.0
D
=>/
D
=4P4/7
#是蛋白质磷 酸化%去磷酸化修饰调节过程中的关键酶!通过将目
的蛋白去磷酸化修饰!改变蛋白的构象!进而改变了
目的蛋白质的生物学活性(#)和蛋白稳定性(!)等功
能蛋白磷酸酶在细胞的生长发育*信号转导*有丝
分裂*细胞凋亡*蛋白合成*新陈代谢*细胞骨架组装
以及膜受体和离子通道的调控等生理生化过程中发
挥重要调控作用(%)$)由于磷酸化%去磷酸化修饰能
够快速*精确地传递信号!因此在激素信号转导通路
中!磷酸化%去磷酸化修饰发挥着重要的调控作用
研究表明!植物中多个激素信号转导通路都需要蛋
白磷酸酶的调控
在生长素信号通路中!可逆磷酸化%去磷酸化作
用调节了生长素运输(*),)蛋白激酶
C@K
"
C@HB@K
#和
蛋白磷酸酶
CC!R
拮抗调节
C@H!
"
C@H)GB_F2K!
#
蛋白磷酸化来影响
C@H!
蛋白在质膜上的分布!调
控生长素极性运输!从而调节植物生长发育和组织
器官形成
C@H!
蛋白磷酸化程度较高时!主要定位
在细胞质膜顶部&而其磷酸化水平较低时!主要分布
在细胞质膜基部
C@K
功能获得突变体与
CC!R
功
能缺失突变体都导致
C@H!
过度磷酸化!改变了
C@H!
在质膜上的极性分布!使大部分
C@H!
从细胞
质膜基部向顶部转移!生长素向细胞顶部运输!突变
体根尖分生组织细胞停止生长!根长变短
在脱落酸信号通路中!蛋白磷酸酶
CC!?
是关
键的负调节因子!拟南芥中有
#,
个
CC!?
基因受脱
落酸诱导表达!其中至少有
*
个成员对脱落酸信号
转导途径具有负调控功能()1)编码
CC!?
的
!
个
基因
!/0#
和
!/0!
氨基酸序列具有较高一致性!
缺失突变体
#$%#
和
#$%!
在种子萌发上对脱落酸超
敏感!证明
RI@#
和
RI@!
是脱落酸信号通路的负调
控因子
CC!?
成员中另外
%
个成员!
CC!?R
"
RIR)
N` C2_M2HM@A@a2E2_F@HRA@BH%2H?BK2MR
C_BA2@HCNBMCNRARM2 !?
#*
NRI#
"
N` C2_)
M2HM@A@a2ABRIR#
#和
NRI!
!它们在脱落酸信号
通路中也起负调控作用(&)#")此外!
F75<=7Z
等(##)确
认了
C` J!
"
C` _RIR?A@H_2M@MARH?2#
%
C` _#)
J@W2
#
)RIR)CC!?
复合物的晶体结构!提出
CC!?
能够作为共受体促进
RIR
与
C` _#
%
C` J
的结合!
因此
CC!?
%
C` J
才是
RIR
的真正受体
在油菜素内酯信号通路中!激酶
I@H!
"
I_RM)
M@HBMA2_B@K@HM2HM@A@a2!
#是负调控因子
功能获得型突变体
$%1!
中突变蛋白
Y.0!
能够持续
将转录因子
IU_#
"
I_RMM@HRUBJ2)_2M@MARHA#
#
和
I2M#
"
I_@#)2AN` J)F2ANRH2MTJCNBHRA2
MTCC_2MMB_#
#磷酸化使其进入泛素化降解途径!
抑制油菜素内酯应答基因的表达!关闭油菜素内酯
信号通路!引起植株矮化(#!)#$)蛋白磷酸酶
IMT#
"
$"%#MTCC_2MMB_#
#是与
I@H!
作用相反的正调
控因子!可以使
IU_#
和
I2M#
去磷酸化激活其功
能!启动油菜素内酯应答基因的表达!过表达
IMT#
能够部分恢复
$%1!
突变体矮化的表型(#*)#,)
在赤霉素通路中!磷酸化%去磷酸化修饰的研究
目前正不断取得突破性进展在拟南芥中!付向东
等(#)发现
8
4.
蛋白"保守的
K2JJR
结构域缺失
#
个氨基酸的
ER@
突变蛋白#以磷酸化形式存在因
为碱性磷酸酶"
?@C
#处理后会改变
8
4.
蛋白的电泳
迁移率!而变性的
?@C
处理不会产生这种效果另
外!
CC#
或者
CC!R
磷酸酶抑制剂能够抑制
K2J)
JR
蛋白的降解!并且
_EJ!
中
,
个保守的丝氨酸%
苏氨酸位点突变成模拟持续磷酸化状态的天冬氨
酸%谷氨酸后!能够抵抗
ER
介导的降解!说明丝苏
氨酸去磷酸化是
K2JJR
蛋白降解所必须的(#1)#&)
本实验室通过
2FM
诱变拟南芥!筛选到一个
@
型蛋
白磷酸酶突变体
2
((
$)#
!并通过蛋白质相互作用*
酶活检测和双突变等分子生物学和遗传学实验在拟
南芥中首次证明磷酸酶
ABCC$
能够去磷酸化
K2JJR
蛋白(!")
为进一步完善磷酸酶
ABCC$
在拟南芥中的生物
学功能!研究
ABCC$
在对
ER
信号转导通路中的作
用!需制备
ABCC$
多克隆抗体在拟南芥中!该磷酸
酶家族有
&
个成员!分别命名为
ABCC#)&
"
A` C2
BH2C_BA2@HCNBMCNRARM2#)&
#
(
!#
)
!这些蛋白
质序列高度保守!仅部分序列存在特异性!暗示这些
蛋白磷酸酶是依赖特异性序列来识别不同底物!发挥
互不相同的生物学功能因此!如何制备特异性
ABCC$
多克隆抗体是本研究重点本研究将
3455$
全长和特异部分序列"
3455$
基因的
H
端
#*"Y
D
!后文简称
6#*"
#分别构建到带有
EMA
标签
和
N./
标签的载体中!转化大肠杆菌!诱导重组蛋白
表达!以
EMA)ABCC$
作为抗原制备
ABCC$
多克
隆抗体!用特异序列肽段纯化方法纯化
ABCC$
蛋
白抗体!为后续功能研究奠定基础
#
!
材料和方法
<+<
!
植物材料
本实验采用的野生型拟南芥 "
!"#$%&
(
)%)
2,#.%#1#
#
?>5:3Y.4
"
?>5)"
#订购于
RZ4Y.;>
D
/./I.>)
5>
8
.<45_7/>:Z<7?70P7Z
"
RI_?
#
1%&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
<+=
!
方
!
法
<+=+<
!
表达载体构建
!
针对
D
E2b)$A)%
载体!设
计
EMA)ABCC$)G
和
EMA)ABCC$)_
引物"上游引
物含
*+_
"
酶切位点!下游引物含
7#.
"
酶切位
点!表
#
#!以拟南芥
为模板扩增
3455$
基
因全长&针对
D
2A)!14)EGC
载体!设计
N./)H#*")G
和
N./)H#*")_
引物"上游引物含
*+_
"
酶切位
点!下游引物含
7#.
"
酶切位点!表
#
#!以拟南芥
为模板扩增
3455$
基因
H
端特异的
#*"Y
D
序列经琼脂糖凝胶电泳分离!回收目的条带后!连
接到
D
T?3)A
载体上!转化到大肠杆菌
KN*
#
中!
挑取经
C?_
验证含有目的基因条带的单菌落!扩大
培养提取质粒
通过
*+_
"
和
7#.
"
分别双酶切
D
T?3)A)
ABCC$
和
D
T?3)A)H#*"
质粒!连接到
D
E2b)$A)
%
载体和
D
2A)!14)EGC
载体!转化到大肠杆菌
KN*
#
中!挑取经
C?_
验证正确的单菌落测序待
测序正确后将单菌落扩大培养提取目的质粒!转化
*8+.%IJ!#
"
K2%
#表达菌株并
C?_
验证
<+=+=
!
重组蛋白的诱导表达
!
分别挑取含有
D
E2b)$A)%)ABCC$
和
D
2A)!14)EGC)H#*"
质粒的
*8+.%IJ!#
"
K2%
#表达菌株!转接到
#"3JJI
液
体培养基"含
#""3
8
%
J
氨苄青霉素#中!于
%c
恒
温摇床上振荡培养过夜第
!
天!按
#O#"""
的比
例将菌液转接到
*J
新鲜配制的
AI
液体培养基!
%c
培养至
BK
,""
约
"+1
左右"取样!作为诱导前样
品#!加入终浓度
#33>5
%
J
的
@CAE
!
%c
培养
,
=
!离心收获菌体"取样!作为诱导后样品#将含有
EMA)ABCC$
的菌体用磷酸盐缓冲液"
#dCIM
!
D
N
+$
#重悬!将含有
N./)EGC)H#*"
的菌体用
AZ./
缓
冲液"
!"33>5
%
JAZ./)N?5
!
"+*3>5
%
JH4?5
!
D
N
1+"
#重悬!超声破碎"超声
%/
*间隔
#"/
*总时间
#"
3.0
#超声结束后!
$c
*
#""""Z
%
3.0
离心获得上
清聚丙烯酰胺凝胶电泳"
MKM)CRE2
#分析重组蛋
白的诱导表达
表
<
!
本实验所用引物
A4Y57#
!
R5
D
Z.37Z/:/7;.0P=.//P:;
X
引物名称
CZ.37Z0437
序列"
*e)%e
#
M7
]
:70<7
"
*e)%e
#
EMA)ABCC$)G *e)?EERRAA??RAEE?ER?ER?ER?ER?ER?E?REE)%e
EMA)ABCC$)_ *e)R?E?EA?ER?A?RRE?AEAREAR?RERE?AEAAAE)%e
N./)H#*")G *e)?EERRAA?RAEE?ER?ER?ER?ER?ER?E?REE)%e
N./)H#*")_ *e)R?E?EA?ER?A?RRE?AEAREAR?RERE?AEAAAE)%e
!!
注$下划线序列为酶切位点
H>P7
$
209
X
37<:PP.0
8
/.P7/4Z7:0;7Z5.07;+
<+=+>
!
蛋白纯化
!
将含有
EMA)ABCC$
或
N./)
EGC)H#*"
重组蛋白的菌体裂解上清液分别流经平
衡好的
E5:P4P=.>07M7
D
=4Z>/7$I
或
H.M7
D
=4Z>)
/7
AF
,G4/PG5>6
树脂用
,
倍柱体积的
CIM
或
AZ./
缓冲液"含
!"33>5
%
J
咪唑#洗涤后!分别加入
含
#"33>5
%
J
还原型谷胱甘肽的
CIM
缓冲液或含
!*"33>5
%
J
咪唑的
AZ./
缓冲液洗脱!收集流出液
MKM)CRE2
分析目的蛋白纯化结果
<+=+
!
多克隆抗体制备
!
在兔子耳缘静脉处取血
#3J
!
%c
放置
#=
!
$c
放置
$=
后!
$c
*
%"""
Z
%
3.0
离心
#"3.0
!收集析出的血清作为阴性对照
初次免疫取
EMA)ABCC$
蛋白
#3
8
与
#3J
的弗
氏完全佐剂混合!涡旋均匀至完全乳化!皮下多点注
射共
#3J
抗原之后每隔
#";
加强免疫
#
次!每
次加强免疫取
#3
8
的
EMA)ABCC$
蛋白与
#3J
弗氏不完全佐剂完全乳化
%
次加强免疫后第

天!在兔子耳缘静脉处取血!制备血清!用于后续
2J@MR
检测多克隆抗体效价当抗体效价达到
#O#"""""
以上后!颈动脉取血获得血清
!
.ABC5
检测抗体效价
!
以
EMA)ABCC$
蛋
白作为抗原!包被液"
"+"*3>5
%
J
碳酸盐缓冲液!
D
N&+,
#稀释至
#"
$
8
%
$
J
!
&,
孔酶标板每孔加
#""
$
J
!
$c
静置过夜洗涤液"含
"+"*fA6770)!"
的
CIM
#洗
%
次加 封 闭 液 "含
#f IMR
!
"+#f
A6770)!"
的
CIM
#
""
$
J
!
%c
放置
#=
洗涤液
洗涤
%
次后!加
#""
$
J
倍比稀释的血清!
%c
温育
#=
洗涤液洗涤
%
次后!加
#""
$
J#O*"""
稀释
的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗!
%c
放置
#
=
!洗涤液洗
*
次!蒸馏水洗
!
次加
#""
$
J
新鲜配
制的底物溶液"
"+#3>5
%
J
磷酸钠盐缓冲液!
D
N
,+"
!
#"3J
&
AHI#"
$
J
&
N
!
B
!
#*
$
J
#!室温暗处至
溶液明显变色"
*
%
%"3.0
#!加
*"
$
J
终止液"
!
3>5
%
JN
!
MB
$
#!用酶标仪测定
$*"03
吸光值
<+=+D
!
抗体纯化
!
将纯化的
N./)EGC)H#*"
用偶
联缓冲液"含
"+*3>5
%
JH4?5
的
"+#3>5
%
JH4N)
?B
%
!
D
N1+%
#
$c
透析!待用称
"+*
8
溴化氢活化
的树脂"
?HIZ)4D
=4Z>/7$I
#用
$3J
浓
度
#33>5
%
JN?5
悬浮
!
次"每次
#*3.0
#将透析
后的
!"3
8
N./)EGC)H#*"
重组蛋白加入到树脂
中!颠倒混匀
#=
后用偶联缓冲液洗涤洗涤之后!
加入封闭液"
"+#3>5
%
JAZ./)?5
!
D
N1+"
#!封闭
!
=
再用
D
N$+"
并且含
"+*3>5
%
JH4?5
的
"+#
3>5
%
J
醋酸!和
D
N1+"
并且含
"+*3>5
%
JH4?5
的
"+# 3>5
%
J AZ./)?5
!两种溶液交替洗
%
次用
&%&#
#"
期
!!!!!!!!!!
王
!
玮!等$拟南芥蛋白磷酸酶
ABCC$
的原核表达和多克隆抗体纯化
CIMA
"含
"+"*f A6770)!"
的
CIM
缓冲液#重新平
衡好树脂后加入免疫后的血清室温轻摇杂交
$"
3.0
!洗涤缓冲液洗涤树脂以去除杂蛋白最后!加
入洗脱液"
+#3>5
%
J
柠檬酸!
D
N!+"
#洗脱
#3.0
!
并且用
#3>5
%
JAZ./)?5
"
D
N1+"
#中和被洗脱下的
抗体!分装抗体于
(1"c
保存
<+=+E
!
多克隆抗体特异性检测
!
利用
!dMKM)
CRE2
上样缓冲液提取拟南芥
?>5)"
总蛋白!经
MKM)CRE2
电泳分离*转膜后!用
S7/P7Z0Y5>PP.0
8
封闭液"含
*f
脱脂奶粉的
AIMA
#封闭
#=
!加入按
#O#"""
比例稀释于
AIMA
中的多克隆抗体血清!
室温杂交
%=
!洗涤后加入按
#O*"""
比例稀释于
AIMA
中的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗!室
温杂交
#=
!化学发光底物法显色!
b
光片成像
!
!
结果与分析
=+<
!
拟南芥
!
型蛋白磷酸酶家族多重序列比对
拟南芥基因组中
@
型蛋白磷酸酶家族共有
&
个
成员!通过蛋白质同源序列比对发现!它们的蛋白质
一级结构高度相似!且蛋白质分子量也几乎没有差
别"
%,LK
左右#!仅
H
末端区域有特异的氨基酸序
列"图
#
#为提高制备的多克隆抗体的特异性!本
研究计划采取用
ABCC$
连接
EMA
标签蛋白重组
表达纯化!作为抗原制备抗体&用
ABCC$H
末端
*"
个氨基酸序列"图
#
方框内#与
N./
标签重组表达纯
化!纯化
ABCC$
抗体的方案
图
#
!
拟南芥
"
型蛋白磷酸酶"
ABCC
#家族成员多重序列比对
方框内为
"
型蛋白磷酸酶家族的特异性
H
末端序列
G.
8
+#
!
F:5P.
D
5745.
8
0370P>[P=7373Y7Z/>[P
XD
7>07
D
Z>P7.0
D
=>/
D
=4P4/7
"
ABCC
#
[43.5
X
.0!"#$%&
(
)%)
I>^ .0;.<4P7/P=7/
D
7<.[.]
:70<7>[P
XD
7>07
D
Z>P7.0
D
=>/
D
=4P4/7[43.5
X
"$&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
=+=
!
表达载体构建
以拟南芥
?>5)"
野生型总
_HR
反转录产物
为模板!
C?_
扩增
&,,Y
D
的
3455$
基因全
长和
#*"Y
D
的
6#*"
序列!经琼脂糖凝胶电泳分
析!扩增片段条带大小与理论大小一致"图
!
#
将胶回收后的
3455$
和
6#*"
序列克隆到
D
T?3)A
载体上!提取质粒!利用限制性内切酶
*+_
"
和
7#.
"
双酶切!琼脂糖电泳分离双酶切产
物!胶回收
3455$
和
6#*"
序列"图
%
#&将双酶切
后的
3455$
和
6#*"
序列分别克隆到
D
E2b)$A)%
和
D
2A)!14)EGC
载体上!测序验证提取测序验证
正确的质粒转化
*8+.%IJ!#
"
K2%
#感受态细胞!挑
取单克隆进行
C?_
验证"图
$
#结果表明本研究
成功构建出用于原核表达的
D
E2b)$A)%)ABCC$
和
D
2A)!14)EGC)H#*"
质粒!并转入大肠杆菌原核表
达工程菌中
=+>
!
重组蛋白的诱导表达及可溶性分析
3455$
基因开放阅读框由
&,,
个碱基组成!
编码
%!#
个氨基酸!理论蛋白质分子量约为
%,LK
&
EMA
标签理论分子量约为
!,LK
!因此
EMA)
ABCC$
重组蛋白的理论分子量约为
,!LK

6#*"
含有
#*"
个碱基编码
*"
个氨基酸!理论蛋白质分子
量约为
*+*LK
!
EGC
蛋白理论分子量约为
!LK
&
图
!
!
3455$
与
6#*"
基因扩增
G.
8
+!
!
E70743
D
5.[.<4P.>0>[3455$40;6#*"
F+KHR34ZL7Z
&
#83455$
&
!86#*"
图
%
!D
T?3)A
载体
*+_
"
和
7#.
"
双酶切结果
G.
8
+%
!
K>:Y57;.
8
7/P.>0>[
D
T?3)A\7

Z/
6.P=*+_
"
40;7#.
"
F+KHR34ZL7Z
&
#+
D
T?3)A)ABCC$
&
!+
D
T?3)A)H#*"
N./
标签蛋白分子量较小!约为
#LK
!因此
N./)
EGC)H#*"
重组蛋白的理论分子量约为
%$LK
由
于
EMA
和
EGC
蛋白都是可溶性蛋白!可提高整个
重组蛋白的可溶性!因此本实验室采取较高
@CAE
浓度"
#33>5
%
J
#*
%c
*短时间"
%=
#的诱导条件获
得目的蛋白经过
@CAE
诱导后的菌体超声波破
碎!分别收集上清液和沉淀物!将上清液进行
MKM)
CRE2
电泳检测结果表明!经
@CAE
诱导后!可溶
性蛋白样品中理论分子量处均可见显著表达的重组
蛋白
EMA)ABCC$
和
N./)EGC)H#*"
"图
*
#!说明本
研究采用的诱导方案成功地诱导表达出可溶的重组
蛋白
图
$
!
菌落
C?_
结果
F+KHR34ZL7Z
&
#+
含有
D
E2b)$A)%)ABCC$
质粒的
IJ!#
&
!+
含有
D
2A)!14)EGC)H#*"
质粒的
IJ!#
G.
8
+$
!
_7/:5P/>[<>5>0
X
C?_
F+KHR34ZL7Z
&
#+IJ!#6.P=
D
E2b)$A)%)ABCC$
&
!+IJ!#6.P=
D
2A)!14)EGC)H#*"
图
*
!
重组蛋白
EMA)ABCC$
和
N./)EGC)H#*"
的可溶性分析
F+
蛋白
34ZL7Z
&
#+
含
D
E2b)$A)%)ABCC$
菌株诱导前可溶性蛋白&
!+
含
D
E2b)$A)%)ABCC$
菌株诱导后可溶性蛋白&
%+
含
D
2A)!14)EGC)H#*"
菌株诱导前可溶性蛋白&
$+
含
D
2A)!14)EGC)H#*"
菌株诱导后可溶性蛋白
G.
8
+*
!
A=7/>5:Y.5.P
X
>[Z7<>3Y.040P
D
Z>P7.0>[
EMA)ABCC$40;N./)EGC)H#*"
F+CZ>P7.034ZL7Z
&
#+A=7/>5:Y57
D
Z>P7.0>[:0).0;:<7;*8+.%
IJ!#6.P=
D
E2b)$A)%)ABCC$
&
!+A=7/>5:Y57
D
Z>P7.0>[.0;:<7;
*8+.%IJ!#6.P=
D
E2b)$A)%)ABCC$
&
%+A=7/>5:Y57
D
Z>P7.0>[
:0).0;:<7;*8+.%IJ!#6.P=
D
2A)!14)EGC)H#*"
&
$+A=7/>5:Y57
D
Z>P7.0>[.0;:<7;*8+.%IJ!#6.P=
D
2A)!14)EGC)H#*"
#$&#
#"
期
!!!!!!!!!!
王
!
玮!等$拟南芥蛋白磷酸酶
ABCC$
的原核表达和多克隆抗体纯化
表
=
!
53,#F$%&&
血清效价检测
A4Y57!
!
M7Z:3P.P7Z4//4
X
>[40P.)ABCC$
项目
@P73
稀释倍数
F:5P.
D
57;.5:P.>0
#d#"
*
!d#"
*
$d#"
*
1d#"
*
#,d#"
*
%!d#"
*
多抗血清
C>5
X
<5>04540P.Y>;.7//7Z:3 #+!% "+&%! "+*!$ "+%1, "+!&1 "+#,$
未稀释的对照
?>0PZ>56.P=>:P;.5:P.>0 "+!"* "+!"* "+!"* "+!"* "+!"* "+!"*
比值
_4P.> ,+!# $+** !+*, #+11 #+$* "+1"
=+
!
重组蛋白的纯化
利用
EMA
标签蛋白能够与谷胱甘肽特异性结
合!以及
N./
标签能够与金属
H.
离子螯合的原理!
本研究将菌体经超声波破碎裂解的上清液分别流经
E5:P4P=.>07M7
D
=4Z>/7$I
树脂和
H.M7
D
=4Z>/7
AF
,
G4/PG5>6
树脂!并收集最终洗脱液
MKM)CRE2
电泳检测洗脱液中蛋白质纯度!结果表明!在两种重
组蛋白的理论分子量处都有明显条带!说明本研究
纯化出
EMA)ABCC$
和
N./)EGC)H#*"
两种重组蛋
白!可作为抗原进行下一步多克隆抗体制备"图
,
#
=+@
!
多克隆抗体制备和效价检测
取纯化的
EMA)ABCC$
蛋白与佐剂混合*乳化
后免疫新西兰白兔!从第
%
次加强免疫后!从兔子的
耳缘静脉取血!制备血清!然后将该血清倍比稀释
利用
2J@MR
方法!以免疫后的多抗血清
R$*"
与免
疫前的对照血清
R
$*"
比值大于
!
时的血清稀释倍数
作为抗体血清的效价结果如表
!
所示!本研究制
备的抗体效价大于
#O$"""""

=+D
!
抗体纯化与特异性检测
为提高制备的多克隆抗体对目的蛋白识别的特
异性!本研究将
N./)EGC)H#*"
结合到溴化氢活化
的树脂上!通过亲和吸附的原理特异性纯化识别
H
末端
*"
个氨基酸的多克隆抗体为检测纯化出的
抗体是否能够特异性识别
ABCC$
蛋白!本研究提
取 了拟南芥野生型
?>5)"
的总蛋白!进行
S7/P7Z0
图
,
!
重组蛋白
EMA)ABCC$
和
N./)EGC)H#*"
的纯化
G.
8
+,
!
A=7
D
:Z.[.<4P.>0>[Z7<>3Y.040P
D
Z>P7.0
>[EMA)ABCC$40;N./)EGC)H#*"
F+CZ>P7.034ZL7Z
&
#+EMA)ABCC$
&
!+N./)EGC)H#*"
图

!
S7/P7Z0Y5>PP.0
8
检测多克隆抗体的特异性
G.
8
+
!
M
D
7<.[.
8
0.P.>0>[
D
>5
X
<5>045
40P.Y>;.7/:/.0
8
S7/P7Z0Y5>PP.0
8
Y5>PP.0
8
分析结果表明!在
ABCC$
蛋白理论分子
量
%,LK
处检测到边界清晰*单一*无干扰的条带
"图

#!说明纯化的多克隆抗体与目的蛋白的识别
具有较高特异性!抗体血清可以用于后续实验
%
!
讨
!
论
多克隆抗体的制备!通常在得到效价较高的*特
异性检测合格的多抗血清后就已经结束(!!)!%)!但本
研究的困难在于!拟南芥中
@
型蛋白磷酸酶家族
&
个成员蛋白质序列非常保守!并且免疫血清中除了
含有
ABCC$
多克隆抗体!还含有兔子所有的免疫
球蛋白因此!为进一步提高制备的多克隆抗体的
特异性!本研究计划原核表达出带有
N./
标签的
ABCC$H
末端特异氨基酸序列的重组蛋白
N./)
H#*"
!用以纯化特异识别
ABCC$
的多克隆抗体
但是
H
端末端
*"
个氨基酸加上
N./
标签后重组蛋
白的理论分子量较小!不足
#"LK
!在
MKM)CRE2
电泳分析时比较困难!所以本研究在重组蛋白中引
入
EGC
蛋白该方法的创新之处在于除了提高重
组蛋白的分子量!
MKM)CRE2
电泳分析时容易检测
外&更重要的是重组蛋白发绿色荧光!在和溴化氢活
化的树脂进行偶联时!可直观的显示重组蛋白与树
脂是否结合成功!有助于评估重组蛋白与树脂结合
质量
检测抗体特异性方法通常是用
S7/P7Z0Y5>P)
P.0
8
检测拟南芥目的基因缺失突变体是否有杂带!
如果特异性较好!在缺失突变体样品中目的分子量
处应该无条带但是目前在拟南芥种子库"
!"#$%9
&
(
)%)I.>5>
8
.<45_7/>:Z<7?70P7Z
#中没有
3455$
!$&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
基因缺失突变体!仅有
A)KHR
插入到终止密码子
后的插入突变体研究表明!该突变体没有完全缺
失
3455$
基因的表达!仅仅使其表达量降低!利用
本研究制备的
ABCC$
抗体
S7/P7Z0Y5>PP.0
8
检测
发现!该突变体中蛋白质丰度低于野生型!与基因表
达水平变化趋势一致(!")结果证明了本研究制备
并纯化的
ABCC$
抗体具有极佳识别特异性
已有的研究表明!蛋白磷酸酶在生长素(*),)*脱
落酸()1)和油菜素内酯(#*)#,)等多种植物激素信号转
导通路中发挥着重要的调控作用但是蛋白磷酸酶
参与赤霉素信号转导通路的研究尚未深入本实验
室首次报道了在拟南芥中磷酸酶
ABCC$
通过将
K2JJR
蛋白去磷酸化正调节了
ER
信号转导过
程这是经典的
ER
信号转导过程中一种新的调节
方式本研究制备并纯化的
ABCC$
多克隆抗体!
为
ABCC$
的功能研究提供了有力的支持!将有助
于进一步揭示蛋白磷酸酶在赤霉素信号转导通路的
调控机制!对
ER
信号转导途径的研究有着极其重
要的意义和影响
参考文献!
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