全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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,
*-../*#"""($"!)*!"#$*"#*"""#
收稿日期$
!"#%(##("$
&修改稿收到日期$
!"#%(#!(#0
基金项目$国家自然科学基金"
%"+"#1!
#&教育部博士点基金"
!"#!"""0##""#0
#
作者简介$阿依江哈拜克"
#10&
#!硕士!实验员!主要从事植物学方面的研究(
2(34-5
$
4
6,
4/
)
78
!
#!*973
"
通信作者$韩玉珍!博士!教授!博士生导师!主要从事植物发育分子生物学方面的研究(
2(34-5
$
:4/
6
;<:=/
!
94;*=>;*9/
拟南芥
$%%&%$(
亚家族蛋白
%$)
的
亚细胞定位及
123)
的组织表达
阿依江!哈拜克#"!"杨
!
敏#"%"韩玉珍#"
"
#
中国农业大学 生物学院 植物生理生化国家重点实验室!北京
#""#1%
&
!
新疆医科大学 药学院!乌鲁木齐
0%""##
&
%
河南科技
大学 农学院!河南洛阳
$+#""%
#
摘
!
要$以拟南芥"
!"#$%&
(
)%)*+#,%#-#
#为材料!运用
?@(AB?
技术扩增得到了富含亮氨酸的类受体蛋白激酶
"
C??(?CD.
#亚家族基因
./0
!构建了
./0
与绿色荧光蛋白基因"
123
#融合表达载体并转化拟南芥!用激光共
聚焦扫描显微镜观察转基因植物细胞表明$
?CD
蛋白定位于细胞膜上&将
?CD(EFA
在原生质体中进行瞬时表
达!进一步证实了
?CD
蛋白定位于细胞膜上(构建了
./0
启动子"
!"%G
H
#融合
145
报告基因的载体并转
化拟南芥!对转基因植株进行组织化学染色分析表明$
./0
在拟南芥的幼苗*根*花*角果等组织中都有表达!花
中表达量较高!尤其是在雄蕊中特异高表达!而在茎*莲座叶和干种子中几乎没有表达(
?@(AB?
分析结果与
EIJ
组织化学染色的结果一致(研究推测!
?CD
可能在花器官生长发育或相关生理过程的信号转导中发挥作用(
关键词$拟南芥&
C??(?CD.
&亚细胞定位&启动子&组织表达
中图分类号$
K+01
文献标志码$
L
*+,-./+/01$"-0/#203#"4"5%$)
!
061"3.#4"5$%%&%$*+,507#/
8
04!9#((+.:;
<
1.((#"46033.14"53=.123)#4!($4-.&
5
6-6
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#
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#
"
"
#JT4T=D=
6
C4G7U4T7U
6
7VA54/TA:
6
.-757
W6
4/>R-79:=3-.TU
6
!
B75=
W
=7VR-757
W
-945J9-=/9=.
!
B:-/4L
W
U-9;5T;U45I/-X=U.-T
6
!
R=-(
,
-/
W
#""#1%
!
B:-/4
&
!A:4U349
6
B75=
W
=7VY-/O-4/
W
S=>-945I/-X=U.-T
6
!
IU;3
Z
-0%""##
!
B:-/4
&
%B75=
W
=7VL
W
U-9;5T;U=
!
Q=/4/
I/-X=U.-T
6
7VJ9-=/9=4/>@=9:/757
W6
!
C;7
6
4/
W
!
Q=/4/$+#""%
!
B:-/4
#
>,(310-3
$
@:=V;55=/
W
T:97>-/
W
.=
Z
;=/9=[-T:7;TT:=@LL.T7
H
97>7/7VC??(?CD.
W
=/=
"
./0
#
7V!"6
#$%&
(
)%)*+#,%#-#[4.957/=>G
6
?@(AB?4/>V;.=>[-T:
W
U==/V5;7U=.9=/T
H
U7T=-/
"
123
#
W
=/=T797/(
.TU;9T4
H
54/T=H
U=..-7/X=9T7U*@:=.T4G5=!"#$%&
(
)%)TU4/.V7U34/T.[=U=7G.=UX=>;.-/
W
97/V794554.=U
.94//-/
W
3-9U7.97
H
=*@:=U=.;5T-/>-94T=>T:4T?CD(EFAV;.-7/
H
U7T=-/[4.57945-<=>-/T:=
H
54.343=3(
GU4/=.*B7/.-.T=/T5794T-7/[4.7GT4-/=>G
6
T:==H
=U-3=/T7V?CD(EFATU4/.-=/T=H
U=..-7/-/5-X-/
W
!"#$%&
(
)%)
H
U7T7
H
54.T.*@7X-.;45-<=T:=T=3
H
7U454/>.
H
4T-45=H
U=..-7/
H
4TT=U/../0-/
H
54/TT-..;=
!
4
!"%G
HH
U737T=UVU4
W
3=/T7V./0[4.V;.=>[-T:T:=145
W
=/=T7
W
=/=U4T=TU4/.
W
=/-9
H
54/T.*EIJ49(
T-X-T
6
[4.>=T=9T=>-/.==>5-/
W
.
!
U77T.4/>V57[=U.
!
=.
H
=9-45
6
-/4/T:=U
!
G;T:4U>5
6
>=T=9T=>-/.T=3.
!
U7.=TT=
5=4X=.4/>>U
6
.==>.*B7/.-.T=/TU=.;5T[4.7GT4-/=>G
6
?@(AB?4/45
6
.-.*]X=U45
!
T:=.=>4T4-3
H
5-=>T:4T
?CD3-
W
:T-/X75X=-/T:=.-
W
/45-/
WH
4T:[4
6
7VV57[=U7U
W
4/.>=X=57
H
3=/T7UU=54T=>
H
U79=..=.*
.
8
?"1!(
$
!"#$%&
(
)%)
&
C??(?CD.
&
.;G9=5;54U57945-<4T-7/
&
H
U737T=U
&
T-..;==H
U=..-7/
!!
感知外界信号并将这些信号进行传递对所有的
生物都是极其重要的!而感知和传递信号的最基本
的机制之一是通过细胞表面的具有蛋白激酶活性的
受体来完成的+#,(在动物中!受体酪氨酸激酶
"
?@D.
#是存在于细胞表面的调节各种信号传递的
一个大家族(在植物中!也存在一个结构与其相似
的大家族$类受体蛋白激酶 "
?CD.
#(根据胞外结
构域的不同!
?CD.
可分为
J(
结构域"
J(>734-/
#型*
类表皮生长因子"
=
H
->=U345
W
U7[T:V49T7U5-8=
#型*
类肿瘤坏死因子受体"
T;37U/=9U7.-.V49T7UU=9=
H
(
T7U5-8=
#型和富含亮氨酸重复序列"
5=;9-/=(U-9:U=(
H
=4T
!
C??
#型(目前!在植物中鉴定的类受体蛋白
激酶大多数属于
C??
型+#(!,(
在动物中!对含有
C??
的受体激酶研究较多而
且比较深入!它们主要在神经细胞发育*器官发育*
甲状腺和性腺的生长等过程中发挥作用+%(0,(而在
植物中!
?CD.
最早是在
#11"
年由
4^58=U
和
_:4/
W
在玉米中发现的+1,(该发现是深入研究
?CD.
的里程碑(自此之后!越来越多的
?CD.
在
拟南芥及其它物种中发现(据统计!在拟南芥中有
超过
$""
个基因编码
?CD.
+
#"
,
!其中数量最多的是
C??(?CD.
!多达
!!%
个(通过前人的研究发现!在
所有植物中!
C??(?CD.
都含有细胞质激酶功能
域!并且都具有
.=U
%
T:U
蛋白激酶活性(这些研究
表明
C??(?CD.
在植物的生长发育过程中发挥着
极其广泛的作用(
本研究中对
C??(?CD.
亚家族成员
./0
基
因进行了初步的分析!包括
./0
基因的克隆*
H
?CD(EFA
融合蛋白的亚细胞定位*
./0
基因
启动子融合
145
的组织定位等!这些结果为深入研
究其在拟南芥发育过程中的作用打下了坚实的
基础(
#
!
材料和方法
@*@
!
材
!
料
拟南芥 "
!"#$%&
(
)%)*+#,%#-#
#为
B75;3G-4
"
B75("
#生态型!是中国农业大学植物生理生化国家
重点实验室保存材料!并由本实验室自行繁种(大
肠杆菌"
7)8+9"%8+%#8,%
#$
Q`)
"
*
@]A#"
!根癌农杆
菌"
!
:
"$#*9"%;<*;<9
=
#8%9-)
#
Ea%#"#
为本实验
室保 存(
H
S`#1(@
购 自
@4D4?4
公 司(
H
J;(
H
=U#%""(EFA
和
H
BLSRNL#%1#
载体为本实验室
保存(
@*A
!
方
!
法
@*A*@
!
植物培养
!
拟南芥种子点播在适当的
SJ
固体培养基上!
$b
处理
%>
后!放入光照培养箱中
培养(
)
#
+>
后!将幼苗移至小盆土壤中生长(土
壤用营养土和蛭石按
#c#
比例混匀而成(拟南芥
培养条件为长日照条件$
#:
光照%
0:
黑暗&温度
#1b
#
!!b
&相对湿度$
)"d
#
+"d
(
@BABA
!
%$)
的亚细胞定位
!
以
#
周龄的拟南芥
幼苗为材料!提取总
?PL
!具体方法参照文献+
##
,!
并稍作修改(用
@4D4?4
的
/`4.=
除去
?PL
中的
P`L
!并反转为
9` PL
的第一条链进行
AB?
扩增
./0
"
L@!E!+%"
#(扩增上游引物为
U58(
W
V
H
(F
"
)e(L@@BBBEEEL@EEBE@BLL@@@BL@EE(
E@(%e
!下划线为
5#<
$
酶切位点#!下游引物为
U58(
W
V
H
(?
"
)e(LEELB@LE@LEE@E@ELB@E(
L@BE@EE@E(%e
!去掉终止密码子
@LL
!下划线
为
5
(
9
$
酶切位点#(
将克隆的片段连接到
H
J;
H
=U#%""(EFA
载体
上!花序浸染法转化野生型拟南芥+#!,!筛选获得稳
定表达纯合体植株用于观察分析(质粒转化拟南芥
原生质体瞬时表达融合蛋白!观察
?CD
定位!原
生质体的分离和转化方法参照文献+
#%
,(
@BABC
!
123)
的表达研究
!
以拟南芥基因组
P`L
为模板!克隆
./0
基因启动子区域"
L@E
上游
!"%G
H
一段
P`L
片段#!上游引物
U58(
H
U7(F
"
)e(
B@EBLEELBL@LLLELE@B@BBL@@@BLB(
LL(%e
!下划线为
>#$
酶切位点#!下游引物
U58(
H
U7(?
"
)e(EEL@BB@@ELLEELLLE@ELE(
ELE@EB@@(%e
!下划线为
3)*
$
酶切位点#(
将克隆的片段
H
BLSRNL#%1#
连接!花序浸染
法转化野生型拟南芥!筛选纯合体用于
EIJ
活性
组织化学染色(分别取
#
周龄的幼苗!

周龄植株
的莲座叶*花*角果和根!以及干种子!加入染色液至
完全没过样品!
%+b
温箱孵育
0
#
#!:
!用脱色液进
行过夜脱色!并更换一次脱色液至叶绿素完全脱净!
之后显微镜下照相(
@BABD
!
%9&6E%
分析
!
分别取拟南芥干种子*
#
周
龄小苗*

周龄植株的根*茎*莲座叶和花提取
?PL
!反转成
9` PL
并以此为模板进行
?@(AB?
反应(以
!8*%-0
"
L@#E$1!$"
#为内参基因!上游引
物
LB@(F
"
)e(EE@EL@EE@E@E@B@(%e
#!下游引
物
LB@(?
"
)e(LB@ELEBLBLL@E@@LB(%e
#!
AB?
扩增程序为$
1$b
预变性
)3-/
!
1$b
变性
%".
!
)$
b
退火
%".
!
+!b
延伸
)".
!
)
个循环!最后
+!b
!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
延伸
#"3-/
(扩增
./0
基因的上游引物
?CD(F
"
)e(BL@BL@BEEE@L@EEELEE@E(%e
#!下 游
引物
?CD(?
"
)e(BE@EE@EEBE@BB@@EL@@(
%e
#(
AB?
扩增程序为$
1$b
预变性
)3-/
!
1$b
变
性
%".
!
"b
退火
%".
!
+!b
延伸
#3-/)".
!
%"
个
循环!最后
+!b
延伸
#"3-/
(通过观察目的基因
和内参基因扩增产物条带的荧光亮度来检测基因的
表达水平(
@*A*F
!
转基因植株的筛选及获得
!
根据载体抗性!
配制含有潮霉素质量浓度为
!)
%
W
%
3C
的
SJ
筛选
培养基(将收获的转基因
@
#
代种子消毒后!播种
在筛选培养基上!
$b
冰箱放置
%>
后!转移到光照
培养箱中培养(
+
#
#">
后选取在筛选培养基上能
正常生长的
@
#
代阳性植株!移入土壤中继续培养
至收获
@
!
代种子(继续筛选!在筛选培养基上绿
苗
c
黄苗的比例接近
%c#
的株系即为单拷贝插入
的株系!选择一定数量的该株系移入土中继续培养
至收获
@
%
代种子(取一定量干燥的
@
%
代种子继
续筛选得到单拷贝插入的纯合株系!可用于进一步
的观察和分析(
!
!
结果和分析
AB@
!
<
*+
<
.1&%$)&GH6
质粒的构建及转化
以拟南芥基因组
9` PL
为模板!去掉终止密码
子
@LL
!扩增
./0
基因片段!测序正确后与
H
J;(
H
=U#%""(EFA
载体连接!构建了以
%)J
启动子驱动
的
./09` PL
与
123
融合的质粒!命名为
H
J;(
H
=U(?CD(EFA
(扩增结果及质粒双酶切鉴定结果
"图
#
#显示$我们克隆得到了
./0
基因!该基因片
段长为
#1+$G
H
"图
#
!
L
#&
H
J;
H
=U(?CD(EFA
质粒
酶切结果有
!
条带!其中分子量大的为载体
H
J;(
H
=U#%""(EFA
!分子量小的为
./0
片段"图
#
!
R
#!
说明该质粒为阳性质粒(将此质粒转入野生型拟南
芥中!共获得了
#"
株独立的稳定表达且有荧光信号
的转基因植株(
ABA
!
%$)
的亚细胞定位
取
>
龄转基因纯合体幼苗
#"
株!用激光共聚
焦显微镜观察根细胞中融合蛋白的分布情况(结果
表明!在根尖细胞的细胞膜上检测到清晰的
EFA
信
号"图版
$
!
L
#
F
#!说明
?CD
定位在细胞膜上(
为了验证这一结果!将
H
J;
H
=U(?CD(EFA
质粒转
化到拟南芥原生质体中进行表达!
#:
光照培养
后!用激光共聚焦显微镜观察
EFA
的定位情况!结
果表明!在原生质体细胞膜上检测到清晰的
EFA
信
号"图版
$
!
E
#
C
#!这一结果与稳定植株根尖细胞
的定位一致!进一步证实了
?CD
确实定位在细胞
膜上(
ABC
!
123)
基因的组织定位分析
ABCB@
!
<
%$)&E>IJK>@CL@
的构建
!
以拟南芥
基因组
P`L
为模板!扩增
./0
基因
L@E
上游
!"%G
H
一段
P`L
片段!得到了预期的启动子片
段!测序正确后连接到
H
BLSRNL#%1#
载体上!构
建了
H
?CD(BLSRNL#%1#
质粒!扩增结果及质粒
双酶切结果表明$我们获得
./0
的启动子!片段
大小为
!"%G
H
"图
!
!
L
#&
H
?CD(BLSRNL#%1#
质粒酶切结果有
!
条带!其中分子量大的为载体
H
BLSRNL#%1#
!分子量小的为
./0
启动子片段
"图
!
!
R
#!说明该质粒为阳性质粒(
构建好的质粒转入拟南芥中!筛选阳性苗!共获
得独立的转基因株系
!"
株!选取其中
#"
株纯合体
株系进行
EIJ
染色观察(结果表明$
./0
在
#
周
龄幼苗的子叶"图版
$
!
S
#!

周龄苗的花"图版
$
!
图
#
!
./0
片段的克隆及
H
J;
H
=U(?CD(EFA
质粒的鉴定
S*`C!"""
&
L*./0
片段的克隆&
R*
H
J;
H
=U(?CD(EFA
质粒的双酶切鉴定
F-
W
*#
!
B57/-/
W
7V./0VU4
W
3=/T4/>->=/T-V-94T-7/7VT:=
H
J;
H
=U(?CD(EFA
H
54.3->
S*`C!"""
&
L*L3
H
5-V-94T-7/7V./0VU4
W
3=/T
&
R*N>=/T-V-94T-7/7V
H
J;
H
=U(?CD(EFA
H
54.3->G
6
U=.TU-9T-7/=/>7/;95=4.=>-
W
=.T-7/
%
#
期
!!!!
阿依江哈拜克!等$拟南芥
C??(?CD.
亚家族蛋白
?CD
的亚细胞定位及
./0
的组织表达
图
!
!H
?CD(BLSRNL#%1#
质粒的构建及鉴定
L*./0
启动子片段的克隆$
S*`C!"""
&
R*
H
?CD(BLSRNL#%1#
质粒的双酶切鉴定$
S*`C)"""
F-
W
*!
!
B7/.TU;9T-7/4/>->=/T-V-94T-7/7V
H
?CD(BLSRNL#%1#
H
54.3->
L*L3
H
5-V-94T-7/7V./0
H
U737T=U
$
S*`C!"""
&
R*N>=/T-V-94T-7/7VT:=
H
?CD(BLSRNL#%1#
H
54.3->G
6
U=.TU-9T-7/=/>7/;95=4.=>-
W
=.T-7/
$
S*`C)"""
图
%
!
半定量
?@(AB?
检测
./0
在拟南芥中的表达模式
F-
W
*%
!
2H
U=..-7/
H
4TT=U/7V./0
W
=/=
-/!"#$%&
(
)%)G
6
?@(AB?
A
*
?
#*根"图版
$
!
J
#*角果中都能检测到
EIJ
活性
"图版
$
!
K
#!而且在幼苗和花的雄蕊中表达量最
高(在莲座叶*茎*干种子*花瓣及花柱中几乎检测
不到
EIJ
活性"图版
$
!
P
#
A
#!在未成熟的角果
中!只在角果的顶端和底端有表达"图版
$
!
K
#(
ABCBA
!
%9&6E%
分析
123)
的组织表达
!
为了进
一步证实
./0
基因的表达模式!提取拟南芥的干
种子*
#
周龄苗及

周龄幼苗的莲座叶*茎*花及根
的
?PL
!然后全部反转生成
9` PL
(以这些组织的
9` PL
为模板!利用
./0
的特异性引物
?CD(F
%
?CD(?
进行
AB?
扩增(结果表明!
./0
在上述
被检测的组织中!除茎*莲座叶和干种子中没有表达
外!其余组织中都有表达!而在花中的表达水平略高
于其它组织"图
%
#!呈现出的表达模式与
EIJ
报告
基因的检测结果一致(
%
!
讨
!
论
在拟南芥中有超过
$""
个基因编码
?CD.
+
#"
,
!
其中数量最多的是
C??(?CD.
!多达
!!%
个!虽然
数目众多!但是对其功能有所了解的只有约
%"
个(
它们广泛参与植物细胞抗逆反应*植物形态发生*自
交不亲和等生理生化过程(如拟南芥中的
?/!@6
!A!
基因参与分生组织细胞的增殖及组织形
成+#$,&
>!0#
和
>.B#
共同调节植物类固醇激素
"油菜素内酯#的信号传导+#)(#+,&抗逆性基因
2/5!
能启动拟南芥的防卫反应+#0,&
C!75!
参与花器官
的脱落+#1,等(因此!对
C??(?CD
亚家族相关基因
的研究意义重大(
?CD
是一种未知功能的
C??(?CD
亚家族类
受体蛋白激酶!本研究对
?CD
的亚细胞定位和
./0
的组织表达模式进行了首次详细报道!为进
一步研究该基因的功能提供了线索(
植物体在生长发育过程中不断接受外界环境及
体内细胞间的各种刺激信号!通过一系列信号转导
途径!最终表现出相应的生物学反应(胞外信号只
有首先被受体识别和接受之后!才能转化为胞内信
使!通过胞内信使的传递引起细胞的生理生化反应(
?CD.
家族基因与细胞信号转导有着密切的关系!
而
C??(?CD
基因因其特殊的结构和在细胞中的定
位!在感知信号*传递及控制生长信息等方面的作用
尤为重要(本实验中稳定表达
?CD(EFA
融合蛋
白的转基因植株和瞬时表达
?CD(EFA
的原生质
体的观察结果均表明
?CD
蛋白激酶定位于细胞
膜上!这一结果暗示
?CD
可能参与细胞膜上的信
号接受和转导过程(下一步我们将针对
?CD
的
胞外域及激酶功能域进行详细研究!以探明胞外域
是怎样接收信号并将信号转到胞内!又是怎样发挥
激酶活性实现信号转导的!希望通过深入的生化研
究和分析找到磷酸化的底物或是相关蛋白(
同时!通过对
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基因的组织表达模式的研
究!发现
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基因的表达是具有组织特异性的(
在莲座叶*茎*干种子中几乎没有表达!而在花中的
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活性!而在
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基
因可能参与了拟南芥花器官发育相关过程的信号转
导(下一步研究将从
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基因的突变体着手!重
点关注突变体在花器官发育过程中表型变化!从而
确定该基因的生物学功能(
参考文献!
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