全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 42(1): 105-109(2012)
收稿日期: 2010-08-30; 修回日期: 2011-09-20
基金项目: 浙江省科技计划项目 (2010C32063 );浙江省重点创新团队自主设计项目 (2011R09027-03 );杭州市科技计划项目
(20101032B27、20110232B04);大学生科技创新活动项目(2010R409025)
通讯作者: 俞晓平,博士,教授,主要从事生物农药研究; Tel:0571-86836006, E-mail:yxp@cjlu. edu. cn。
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췍研究简报
拮抗链霉菌 B28 的分类鉴定及其生防作用研究
申屠旭萍1, 于 冰1, 边亚琳1, 胡 靓1, 马 正1, 童朝明2, 俞晓平1*
( 1 浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,中国计量学院生命科学学院, 杭州 310018;
2 杭州市农业科学研究院, 杭州 310024)
Biocontrol effect and taxonomy of antagonistic Streptomyces strain B28 SHENTU
Xu-ping1, YU Bing1, BIAN Ya-lin1, HU Jing1, MA Zheng1, TONG Chao-ming2, YU Xiao-ping1 ( 1China
Jiliang University, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection and Quarantine, College of Life Sciences,
Hangzhou 310018, China; 2Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310024, China)
Abstract: An antagonistic Streptomyces strain B28, isolated from the soil collected in Tianmu mountain of
Zhejiang Province, was identified as Streptomyces diastatochromogenes by morphological , physiological &bi-
ochemical characteristics and 16S rDNA sequence alignment. Antagonistic study indicated that its secondary
metabolite toyocamycin had an antifungal activity on the mycelial growth of seven species of plant pathogenic
fungi. The results showed that toyocamycin possessed marked inhibitory activity against Rhizoctonia solani and
the EC50 value was 0. 58 μg / mL. The effective of toyocamycin against Botrytis cinerea and Fusarium oxyspo-
rum f. sp. cucumerinum was much higher than that against Colletotrichum gloeosporioides, the EC50 value of
toyocamycin in inhibiting B. cinerea, F. oxysporum and C. gloeosporioides were 13. 65 μg / mL, 12. 33 μg /
mL, and 30. 15 μg / mL respectively.
Key words: Streptomyces strain B28; toyocamycin; taxonomy; antifungal activity
文章编号: 0412-0914(2012)01-0105-05
目前植物真菌病害的防治仍以化学药剂为主。
化学农药虽然具有毒力强、见效快等特点,但长期
大量使用化学农药带来了环境污染、农药残留和病
原菌的抗药性等诸多问题。 因此,研制高效、低毒、
和对环境安全的生物农药已迫在眉睫。 放线菌是
一类有着广泛实际用途的微生物资源,具有农用活
性的放线菌是生物农药研制的重要出发菌株。 世
界上约有 70%的抗生素是由放线菌代谢产生的,
这些放线菌主要来源于土壤。
本项目组从浙江临安天目山采集的土壤中分
离筛选得到一株放线菌,根据其形态培养特征、生
理生化特性以及 16S rDNA序列分析,初步鉴定为
淀粉酶产色链霉菌( Streptomyces diastatochromo-
genes)。 该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委
员会普通微生物中心保藏,保藏登记号为 CGMCC
No. 2060。 经进一步提取分离研究表明,该放线菌
发酵液中的主要有效成分为丰加霉素 (另文发
表)。 本文对该放线菌的分类进行了研究,并首次
报道了该菌株代谢产物丰加霉素对 7 种植物病原
真菌的抑制作用。
植物病理学报 42 卷
1 材料和方法
1. 1 供试菌种
链霉菌 B28:由浙江省生物计量及检验检疫技
术重点实验室从浙江天目山土壤中分离筛选获得,
该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通
微生物中心保藏,保藏登记号为 CGMCC No.
2060。
供试植物病原真菌:黄瓜枯萎病菌(Fusarium
oxysporum f. sp. cucumerinum)、西瓜枯萎病菌(F.
oxysporum f. sp. niveum)、菜豆炭疽病菌(Colleto-
trichum lindemuthianum)、葡萄炭疽病菌(C. am-
pelinum)、柑橘炭疽病菌(C. gloeosporioides)、水
稻纹枯病菌 (Rhizoctonia solani)和番茄灰霉病菌
(Botrytis cinerea)。 上述病原菌由浙江省生物计
量及检验检疫技术重点实验室保藏。
1. 2 培养基
链霉菌 B28 培养基主要为固体培养基和液体
发酵培养基,其中固体培养基:马铃薯、葡萄糖、琼
脂分别为 200、 20 和 18 g·L -1;液体发酵培养基:
黄豆 饼 粉、 玉 米 粉、 麸 皮、 CaCO3、 NH4NO3、
(NH4) 2SO4 和 MgSO4 分别为 2. 0、1. 5、1. 0、0. 5、
0. 3、0. 5 和 1. 0 g·L -1。
1. 3 链霉菌菌株 B28 的鉴定
1. 3. 1 形态及培养特性的观察 采用《链霉菌鉴
定手册》 [1]上推荐的培养基,将链霉菌 B28 于 28℃
培养 7 ~ 15 d,记录气生菌丝、基内菌丝的生长状况
和可溶性色素的颜色。 利用光学显微镜观察菌丝
和孢子丝形态并进行鉴定。
1. 3. 2 生理生化特性的观察 对该菌株进行明胶
液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、纤维素的利用、
H2S的产生、黑色素形成、硝酸盐还原以及碳源利
用等几方面的测定,按《链霉菌鉴定手册》 [1]进行。
1. 3. 3 16 S rDNA 的序列分析 16S rDNA 的序
列分析:以在 PDA 平板 28℃培养 3 d 的 B28 菌落
为模板,采用 16S 扩增通用引物 F:5′-AGAGTTT-
GATCCTGGCTCAG-3′ 和 R: 5′-AAGGAG GT-
GATCCAGCCGCA-3′,在 20 μL 体系中进行 PCR
扩增,扩增条件为:94℃ 预变性 3 min;94℃ 1 min,
56℃ 1 min ,72℃ 1 min 30 s,共 35 个循环;最后
72℃ 延伸 10 min[2]。 将所获得的 1. 4 kb 的 PCR
产物用 Gel Extraction Kit 回收后由上海英骏生物
技术有限公司测序,将测序结果用 BLAST 程序在
GenBank中进行序列比对分析,并选取相似性较高
的菌株,用 Mega4. 0 软件中的 neighbor-joining 方
法构建系统发育树,1 000 次随机抽样,以自引导
值(Bootstrap) 评估系统发育树的置信度。
1. 4 链霉菌 B28 的液体发酵
液体发酵采用摇瓶法。 在 300 mL 三角瓶中装
60 mL 液体发酵培养基, 用接种环接种少许孢子,
于 28℃,180 r·min -1振荡培养5 d。 发酵液于5 000
r·min -1离心,上清液直接用于活性成分的分离。
1. 5 丰加霉素的提取分离和检测
发酵获得的上清液,正丁醇萃取 2 遍,合并萃
取层,真空浓缩得浸膏,经大孔树脂和 ODS反相层
析柱分离得丰加霉素。 丰加霉素浓度的测定采用
高效液相色谱法检测: SHIMADZU C18 色谱柱
(150 mm ×4. 6 mm,5 μm);光电二极管检测器;甲
醇为流动相 A,水为流动相 B,梯度洗脱;流速 1. 0
mL· min -1;检测波长 279 nm;柱温 30℃。
1. 6 抑菌活性测定方法
将不同浓度的丰加霉素溶液加入到定量灭菌
后冷却至 50℃的 PDA 培养基中,充分混匀,制成
含丰加霉素终浓度分别为 60、30、15、7. 5、3. 75、
1． 875、 0. 937 5、0. 468 8、0. 234 4 和 0. 117 2 μg /
mL的平板,在每个平板表面中央放置直径 4 mm
的供试菌菌饼,带菌丝的一面贴在培养基表面,置
28℃培养箱培养,以无菌水处理作为对照,每处理
3 次重复。 培养 72 ~ 96 h后,采用十字交叉法测定
供试菌菌落直径,以下列公式计算抑制率:
菌丝生长抑制率 =对照菌落直径 -处理菌落直径对照菌落直径 -4
×100%
最后根据不同质量浓度的菌丝生长抑制率计
算毒力,得出毒力回归方程以及相关系数 r 和
EC50值。
2 结果与分析
2. 1 链霉菌 B28 的形态特征和培养特征
链霉菌 B28 在所选用的 8 种培养基上均能较
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1 期 申屠旭萍,等:拮抗链霉菌 B28 的分类鉴定及其生防作用研究
好地生长,在各种培养基上的培养特征见表 1。 显
微形态表明该菌株孢子丝直、钩状、松散螺旋形;孢
子长圆、椭圆或卵圆形。 该菌株形态特征及培养特
征和《链霉菌鉴定手册》所描述的淀粉酶产色链霉
菌(S. diastatochromogenes)的特征相符。
2. 2 链霉菌 B28 的生理生化特征
对链霉菌 B28 利用蔗糖、果糖、甘油等 30 多
种碳源的情况以及其他生理生化特性进行了测试,
结果见表 2。 该菌株不能利用水杨素、棉子糖、蔗
糖等碳源,可利用淀粉、D-葡萄糖、果糖、麦芽糖、
木糖、糊精等碳源。 生理生化特性测定表明,链霉
菌 B28 能使明胶液化、牛奶凝固,发生硝酸盐还原
反应,但不产生黑色素等。 这些特性也与报道的
S. diastatochromogenes特征基本一致[3]。
Table 1 Cultural characteristics of Streptomyces strain B28 on different media
Medium Aerial mycelium Substrate mycelium Soluble pigment
Czapek’s medium Gray white Slight yellow None
Glucose asparagine medium None Slight chocolate None
Glycerin asparagine medium None Chocolate None
Abio-starch medium Slight gray Cinnamon None
ISP-2 medium Gray Slight brown None
Oatmeal medium Slight gray Slight yellow None
Gause’s synthetic medium Slight gray Cinnamon None
Santon’s medium Gray Cinnamon None
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of Streptomyces strain B28
Tested item Result Tested item Result Tested item Result
Utilization of
carbon source
Utilization of carbon
source (continued)
Utilization of carbon
source (continued)
Inositol + Ribose + Xylose +
Mannitol + Glycerol + Lactose -
Salicin - Sodium Gluconate + Melezitose +
Raffinose - Galactose + Arabinose -
Inulin + Mannitose + Dextrine +
Starch + Sodium citrate + Erythritol +
Sorbitol + Sodium Succinate + Tyrosinase -
Sucrose - Sodium malate + Amylase +
D-Glucose + Cellubiose - H2S production -
Melibiose - Sodium propionate - Milk peptonization +
Fructose + Sodium acetate + Cellulose -
Fucose - Sodium tartrate - Gelatin liquefaction +
Maltose + Sodium Iodohippurate - Nitrate reduction +
Note: + for positive; - for negative.
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植物病理学报 42 卷
2. 3 16 S rDNA的序列分析
将 PCR扩增获得的 16S rDNA序列提交 Gen-
Bank(登录号:JN123355),与 GenBank 中相关序
列的 Blast 比对结果表明,该菌株与链霉菌属的淀
粉酶产色链霉菌(S. diastatochromogenes)序列同
源性为 99% 。 用Mega4. 0 软件以相近序列构建系
统进化树 (图 1),可以看出,B28 菌株与与 S. di-
astatochromogenes处于同一分支,且 Bootstrap 检
验值为 100,说明可信度高,两菌株亲缘关系最近。
结合形态学特征,培养特征和生理生化特征分析,
将放线菌 B28 初步确定为淀粉酶产色链霉菌。
2. 4 丰加霉素对植物病原菌的抑制作用
淀粉酶产色链霉菌菌株 B28 代谢产物丰加霉
素抑制不同植物病原真菌菌丝生长活性的测定结
果见表 3。 从表 3 可以看出,丰加霉素对所有 7 种
供试植物病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用,
但对不同的病原真菌表现有所差异;相比较对水稻
纹枯病菌菌丝生长表现出最强的抑制作用,EC50值
为 0. 58 μg / mL。 对番茄灰霉病菌和黄瓜枯萎病菌
也有较强的抑制作用,其 EC50值分别为 13. 65
μg / mL和 12. 33 μg / mL;对柑桔炭疽病菌和葡萄
炭疽病菌的毒力相对较弱,其 EC50值均 > 30 μg /
mL。
3 讨论
研究组从浙江临安天目山采集的土壤中分离
筛选到 1 株具有活性作用的链霉菌菌株 B28,经
提取分离和纯化得到主要活性成分为丰加霉素。
国外有关丰加霉素的研究报道较多,主要集中在
医学方面如肿瘤的抑制。 国内关于丰加霉素的
研究相对较少,Chen等[4]研究了丰加霉素对稻瘟
病菌(Pyricularia oryzae)具有抑制作用。 本文首
次报道了丰加霉素对水稻纹枯病菌、葡萄炭疽病
菌和番茄灰霉病菌等 7 种植物病原真菌的抑制
作用,为丰加霉素的进一步利用奠定了坚实的基
础。 同时本研究借助形态特征、生理生化特征和
16S rDNA测序,鉴定链霉菌 B28 为淀粉酶产色
链霉菌。 Wang[5]研究了生防菌株 S024 对小麦
纹枯病的生防作用,该菌株也被鉴定为淀粉酶产
色链霉菌,但是产生的活性成分还未明确。 本文
的研究工作,对放线菌资源的发掘利用和农作物
病虫害的综合治理具有重要的意义。
Fig. 1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of strain B 28
and related Streptomyces species
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1 期 申屠旭萍,等:拮抗链霉菌 B28 的分类鉴定及其生防作用研究
Table 3 Toxicity of toyocamycin on mycelial growth of pathogenic fungi
Tested fungus Toxicity equation Correlation coefficient EC50 / μg·mL -1
Rhizoctonia solani y =2. 473 2x +5. 585 2 0. 986 7 0. 58
Fusarium oxysporum f. sp.
cucumerinum
y =1. 712 5x +3. 131 7 0. 968 9 12. 33
F. oxysporium f. sp. niveum y =0. 823 6x +4. 015 7 0. 976 3 15. 67
Colletotrichum lindemuthianum y =0. 812 7x +4. 024 0 0. 982 1 15. 88
C. gloeosporioides y =1. 235 8x +3. 171 9 0. 972 4 30. 15
C. ampelinum y =0. 681 5x +3. 861 9 0. 957 2 46. 72
Botrytis cinerea y =1. 810 5x +2. 944 9 0. 968 7 13. 65
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责任编辑:曾晓葳
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