全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$*"$*#1
基金项目$国家自然科学基金项目"
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#
作者简介$阎
!
侃"
#&1)(
#!男!在读博士研究生!主要从事植物分子遗传学的研究
2*34.5
$
64
778
9.
:
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!
#%+=>3
"
通信作者$李雪虎!博士!副研究员!主要从事药用植物天然产物分析研究
2*34.5
$
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!
#%+=>3
碳离子辐照对菘蓝药性品质和
分子水平的诱变效应
阎
!
侃#!李雪虎!"
"
#
兰州大学 生命科学学院!兰州
,%""""
&
!
中国科学院 近代物理研究所!兰州
,%""""
#
摘
!
要$以野生菘蓝种子为材料!以不同剂量的碳离子"#!
A
B
#进行辐照处理"辐照剂量分别为
%"C
8
(
"C
8
(
&"C
8
(
#!"C
8
#!分析#!
A
B辐照对菘蓝种子萌发(幼苗生长(主要药用成分含量及其基因和蛋白质多态性变化的影响!为菘
蓝品质育种(分子生物学研究和重离子辐照诱变的应用提供依据结果显示$"
#
#
#!
A
B辐照处理后菘蓝的成苗率和
根鲜重均随辐照剂量增加而逐步显著降低!其中
%"C
8
处理对菘蓝生长抑制程度最小!但处理后菘蓝根中的主要药
效成分
)
"
%D
#喹唑酮和靛玉红的含量增加幅度最大且最高!分别为野生型的
!+!
倍和
!+%
倍"
!
#
EFGH
分子标记
分析表明!菘蓝基因组的变异度随着辐照强度的增强而增大!其中
%"C
8
处理的突变体与野生型相比有
%%+$&I
的
多态性变异"
%
#
EJE*HGC2
考马斯亮蓝染色和磷酸化染色分析表明!菘蓝的总蛋白和磷酸化蛋白表达水平均随
辐照剂量变化出现了不同程度的改变!但并不与辐照强度呈正相关!说明植物在防御重离子辐照伤害时存在补偿
机制研究发现!
%"C
8
的#!
A
B辐照是菘蓝诱变的最佳剂量!能够显著提高其有效成分的含量!为优质菘蓝诱变育
种奠定了基础
关键词$菘蓝&碳离子辐照&
EFGH
&
H<>*K
染色&补偿机制
中图分类号$
K&),+&
文献标志码$
G
$%
&
()"*+,-".$".$,,!#)#"."./")0.(
1
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2"30(43,506037,#)#"."*12$#-2-/.-
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A6.04
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8
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8
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EFGH4045
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EJE*
HGC2
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8
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6
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EFGH
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7
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8
3;=640./3
!!
菘蓝"
!"#$%"%&%
(
)$%*#
#系十字花科两年生草
本植物!根叶分别是中国大宗使用的传统中药材板
蓝根和大青叶!它们具有较好的治疗流行性感冒)#*(
咽喉肿痛)!*和抗癌症)%*的功效化学分析发现!菘
蓝中的主要药用成分为
)
"
%D
#喹唑酮和靛玉红
等)*
)
"
%D
#喹唑酮对流感病毒和柯萨奇病毒的活
性有较强的抑制作用)$*靛玉红有较强的抗癌作
用!可有效抑制人类乳腺癌细胞
VA]*,
的生长)*
野生菘蓝中
)
"
%D
#喹唑酮和靛玉红的含量极少!工
业化提取要求高!代价大随着菘蓝在制药行业中
的使用量越来越大!如何培育有效药用成分含量高
的新品种成为一个重要科学问题
重离子辐照是一种新型的诱发突变源!具有高
传能线密度和独特的电离峰),*碳离子辐照作为重
离子辐照的一种!具有突变谱广!突变性状容易稳
定!正向突变率高等独特的优势)1*近些年来!在利
用重离子辐照育种或筛选突变体的过程中!获得了
大量其他诱变方式难以获得的表型!并在生产和科
研中得到成功运用!比如碳离子辐照菊属植物使之
颜色发生改变并生成了舌状花的形状)&*&碳离子辐
照拟南芥"
,-#.%)
/
"%"$0#1%#&#
#产生了叶子形状
发生改变的突变体)#"*!这些突变体产生的原因多是
由于重离子辐照导致
JMG
发生了突变
目前评价和确认新的突变体常用的分子标记有
FGHJ
)
##
*
(
G]OH
)
#!
*
(
PEEF
)
#%
*和
EFGH
)
#)
*等重离
子辐照突变体利用分子标记技术进行鉴定的也很
多比如!)
D;
!B对日本扁柏"
20#3#4*
5/
#-%").$67
"#
#的茎芽原基辐照后!进行了
FGHJ
分析!以检验
不同突变体的
JMG
变化差异)#$*&空间重离子对水
稻"
8-
5
9#"#$%:#
#辐照后!利用
G]OH
分析突变体
基因组的变化特点)#*但是
FGHJ
的扩增结果重
复性较差!容易受各种因素的影响&
G]OH
对于反应
条件和
JMG
纯度要求过高&
PEEF
可能在特定基因
组
JMG
中没有配对区域
EFGH
是一种新型的基
于
HAF
的分子标记!为显性标记!是由美国加州大
学的
K@.<>/
等)#)*于
!""#
年在芸薹属作物中开发
出来的该标记对基因的开放阅读框的特定区域进
行扩增!重复性较好!步骤简洁!目前已成功地应用
于遗传图谱的构建(遗传多样性分析(重要性状相关
基因的克隆等方面!比如对于双齿围沙蚕"
;4-4%"
"6**%&4#
#的基因多样性分析)#,*和对花烛"
,&$06-%7
63#&-#4#&63
#遗传连锁图谱的建立)#1*因此!
研究第一次运用
EFGH
技术对于碳离子辐照突变
体进行了分析
为了培育含有高药效成分的菘蓝品系!本研究
利用剂量呈梯度递增的碳离子辐照菘蓝干种子!探
讨不同剂量辐照下菘蓝生理指标和药性质量的变
化!同时还首次运用
EFGH
(
EJE*HGC2
和蛋白磷酸
化染色分别从
JMG
水平(蛋白水平和蛋白修饰水
平系统评价了不同剂量碳离子辐照对菘蓝分子层面
的影响!这将对重离子辐照的突变特性研究和菘蓝
的分子生物学研究提供重要参考
#
!
材料和方法
<+<
!
种子辐照(种植和生长状况测定
本研究所采用的野生型菘蓝种子经中国农业科
学院兰州畜牧与兽药研究所药物研究室罗永江副研
究员鉴定为十字花科两年生草本菘蓝种子将野生
型的干种子在中国科学院近代物理研究所重离子加
速器上进行#!
A
B辐照诱变碳离子的能量为
!,"
V;^
%
@
!剂量比率是
!"C
8
%
3.0
!设
%"C
8
(
"C
8
(
&"C
8
和
#!"C
8
)
个剂量梯度野生型和辐照突变
体统一种植于辐照植物培养间!每个剂量采用
#"""
粒
V
#
种子统计成苗率&以繁殖
%
代以上稳定遗传
的辐照突变体为材料!培养
%
个月后进行指标测定!
至少
%"
棵植株统计根平均鲜重
<+=
!
靛玉红和
>
"
?D
#喹唑酮的样品制备和含量
测定
!
#
"靛玉红
!
将菘蓝根在
"_
水浴蒸干!残渣
用色谱级甲醇定容!
"+)$
"
3
滤膜过滤!滤液作为检
测样品含量检测使用高效液相色谱仪!流动相为
甲醇
`
水"
,$` !$
#!流速为
#+"3O
%
3.0
!检测波长
为
!1&03

!"
)
!
%D
"喹唑酮
!
将菘蓝根粉碎!用滤纸包好
,"&
$
期
!!!!!!!!!!!
阎
!
侃!等$碳离子辐照对菘蓝药性品质和分子水平的诱变效应
放入玻璃器皿中!加色谱级甲醇!于超声波清洗器中
超声
"+$6
!再重复
!
次后!合并
%
次滤液!
"+)$
"
3
滤膜过滤含量检测使用高效液相色谱仪!流动相
为乙腈
`
甲醇
`
水"
$`!"`,$
#!流速为
"+1
3O
%
3.0
!检测波长为
!!$03

<+?
!
总蛋白表达分析
<+?+<
!
总蛋白的提取
!
菘蓝根加液氮研磨至粉末!
加入
!aEJE*HGC25>4W.0
:
Y@RR;<
"
#""33>5
%
O
Z<./*DA5
"
7
D+1
#!
)I EJE
!
"+!I \H!
!"I
甘
油!
$I
#
*
巯基乙醇#!在沸水浴
$3.0
!
#1"""
:
离心
#"3.0
!取上清加
)
倍体积的丙酮!
(!"_
沉淀过
夜后离心弃上清!加
1"I
的丙酮洗沉淀
#
$
!
遍!沉
淀干燥后加入
!aEJE*HGC25>4W.0
:
Y@RR;<
溶解
<+?+=
!
考马斯亮蓝染色和蛋白磷酸化染色
!
采用
\<4WR>法测定样品蛋白浓度后)#&*!加入
#aEJE*
HGC25>4W.0
:
Y@RR;8
;
上样于
#"I
的
EJE*
HGC2
胶中!待溴酚蓝刚刚跑出胶后!取胶于固定液
"
#"I
乙酸!
$"I
甲醇#中孵育
%"3.0
后!换新固定
液!孵育过夜去离子水漂洗
%"3.0a!
暗下于
稀释
%
倍的
7
<>*K
"
P0U.9<>
:
;0
公司#染液中孵育
!
6
!暗下脱色液"
$"33>5
%
O
乙酸钠"
7
D)+"
#!
"I
乙腈#脱色
%"3.0a)
!去离子水洗
!
次通过
T H^
凝胶成像系统成像之后把胶在考马斯亮蓝染液
"
#"I
磷酸!
"+#!I
考马斯亮蓝
C*!$"
!
!"I
甲醇!
#"I
硫酸铵#中孵育
!6
!脱色"
#"I
甲醇!
#"I
乙
酸#过夜后!扫描仪成像
<+>
!
基因表达分析
<@>@<
!
AB8
的提取
!
取幼嫩叶片!采用
JMG
提取
试剂盒"
G?
8:
;0
公司#提取基因组
JMG
!具体提取
方法参照试剂盒说明书
JMG
的总量和质量通过
040>W<>
7
!"""
和电泳来分析
<@>@=
!
AB8
扩增
!
EFGH
分子标记引物购于华大
基因公司!具体序列见表
#
扩增仪器为
\Pb*FGJ
的
E#"""
型号
HAF
仪通过前期正交分析获得的
最佳扩增体系为$
<<#
=
"
94c4<4
#
"+%
"
O
!
V
:
!B
#+$
"
O
!
WMZH
"
!+$33>5
%
O
#
+$
"
O
!
JMG
"
!"0
:
%
"
O
#
!+$
"
O
!引物"
#"
"
3>5
%
O
#
#+$
"
O
!
#"aY@RR;"
O
!
WD
!
b#%+,
"
O
扩增条件为$
&)_
预变性
)
3.0
&
)_%"/
!
%$_#3.0
!
,!_!3.0
!循环
$
次&
)_%"/
!
$!_#3.0
!
,!_!3.0
!循环
%$
次&
,!_#"3.0
产物在
#+$I
的琼脂糖凝胶中
电泳
<+C
!
数据分析
采用
EFGH
扩增出的条带来统计基因座!一个
表
<
!
菘蓝
DE8/F/+E
的引物序列
Z4Y5;#
!
M@=5;>9.W;/;
[
@;0=;/>R
7
<.3;<
!+%&%
(
)$%*#EFGH*HAF
引物
H<.3;<
序列
E;
[
@;0=;
"
$d*%d
#
V;# ZCGCZAAGGGAACCGZG
V;! ZCGCZAAGGGAACCGCA
V;% ZCGCZAAGGGAACCGGZ
V;) ZCGCZAAGGGAACCGAA
V;$ ZCGCZAAGGGAACCGGC
V; ZCGCZAAGGGAACCGAZ
V;, ZCGCZAAGGGAACCGCC
V;1 ZCGCZAAGGGAACCGCG
23# CGAZCACZGACGGZZGGZ
23! CGAZCACZGACGGZZZCA
23% CGAZCACZGACGGZZCGA
23) CGAZCACZGACGGZZZCG
23$ CGAZCACZGACGGZZGGA
23 CGAZCACZGACGGZZCAG
23, CGAZCACZGACGGZZAGC
条带即代表一个基因座!记为
#
!同一大小处突变体
或野生型中未出现该条带则表示该基因座发生改
变!记为
"
不同剂量的突变体分别与野生型进行
比较!用软件
H>
7:
;0;
计算多态性比率和
M;.*O.
+
/
距离指数蛋白条带和磷酸化蛋白条带的增减由软
件
K@409.9
8
b0;
进行分析
!
!
结果与分析
=+<
!
碳离子辐照对菘蓝出苗率和根鲜重的影响
随着#!
A
B辐照剂量从
%"C
8
逐渐增高到
#!"C
8
!
菘蓝种子成苗率也比野生型"
eZ
#下降了
#+I
$
+I
"图
#
!
G
#!同时
&"W
龄的
V
#
代植株的根平均
鲜重也不断下降!相比野生型对照降低了
!!+&%I
$
,#+!"I
!各辐照材料间均差异显著"图
#
!
#可见!
不同剂量碳离子辐照均不利于菘蓝种子成苗和幼苗
生长
=+=
!
碳离子辐照对菘蓝次生代谢产物含量的影响
DHOA
技术现已广泛运用于天然产物的分析和
测定!已有研究者成功利用醇浸提法提取了菘蓝叶
子的次生代谢产物!并用
DHOA
测定了其中靛蓝前
体的含量)!"*本研究表明!不同剂量的碳离子辐照
后!菘蓝根的醇浸出物量较野生型均显著下降!且有
随辐照剂量增加而逐渐降低的趋势"图
!
!
G
#同
时!辐照前后菘蓝根中两个主要药效成分靛玉红和
喹唑酮)*的
DHOA
检测结果显示$根靛玉红"图
!
!
#和根喹唑酮"图
!
!
A
#的含量均随着辐照剂量的增
1"&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
#
!
不同剂量碳离子辐照下菘蓝的
成苗率"
G
#和根平均鲜重"
#
eZ
为野生型!
%"C
8
(
"C
8
(
&"C
8
和
#!"C
8
分别
表示不同剂量辐照材料&不同字母表示不同
材料间在
"+"$
水平存在显著性差异&下同
].
:
+#
!
Z6;/;;W5.0
:
/@:
<49;
"
G
#
40W4U;<4
:
;
<>>9R<;/6X;.
:
69
"
#
>R!+%&%
(
)$%*#@0W;<
W.RR;<;09=40.>0.<<4W.49.>0W>/;/
eZ./X.5W9
87
;
!
X6.5;%"C
8
!
"C
8
!
&"C
8
40W#!"C
8
4<;
349;<.45/9<;49;WY
8
W.RR;<;09=40.>0.<<4W.49.>0W>/;/
&
J.RR;<;095;99;:
0.R.=409W.RR;<;0=;/43>0
:
9<;493;09/49"+"$5;U;5
&
96;/43;4/Y5>X
大先升高后下降!并均在
%"C
8
辐照时均达到了最
大值!此时分别比野生型对照显著升高了
!+%
倍和
!+!
倍&同时!两种活性成分含量在
"C
8
辐照时也
显著高于野生型!而在
#!"C
8
辐照时却显著低于野
生型以上结果说明碳离子辐照显著降低了菘蓝根
次生代谢产物含量!但适宜剂量辐照"
%"
和
"C
8
#
能显著提高其根中主要药效成分靛玉红和喹唑酮含
量!改良药物品质
=+?
!
碳离子辐照对菘蓝基因组的影响
为了分析辐照后菘蓝植株的变异情况!本研究
借助
EFGH
分析了样本在
JMG
水平的多样性采
用了
#$
条
EFGH
通用引物"表
#
#!组合形成了
$
对不同的引物!对野生型和不同剂量辐照后的菘蓝
JMG
分别进行扩增通过统计!野生型和突变体中
一共扩增出了
%1,
个基因座!其中
%"&
个具有多态
性每对引物扩增出的基因座数的统计结果见表
!
其中!不同引物对扩增产生的多态性基因座数从
)
个到
#%
个不等&引物组合
V;#23)
扩增最多达到
#%
个 基 因 座!而
V;!23)
(
V;$23!
(
V;$23%
(
V;$23)
和
V;$23,
引物组合只扩增出了
!
个基
因座通过软件
H>
7:
;0;
分析!
$
对引物的平均多
图
!
!
不同剂量的碳离子辐照下菘蓝根的
醇浸出物"
G
#(靛玉红"
#和喹唑酮"
A
#的含量
].
:
+!
!
Z6;=>09;09/>R45=>6>5;?9<4=9/
"
G
#!
.0W.<@Y.0
"
#
40W
[
@.0>?45.0>5
"
A
#
.096;<>>9>R!+%&%
(
)$%*#
@0W;0.>0.<<4W.49.>0W>/;/
态性基因座比率为
,&+1)I
图
%
!
G
$
A
分别展示
在
#+$I
的琼脂糖凝胶上
V;!23#
(
V;#23!
(
V;%23
这
%
对
EFGH
引物的扩增条带!其扩增产
物条带的大小在
!""
$
!"""Y
7
之间
多态性基因座占基因座总数中的比率称为多态
性基因座比率与野生型对照比较!在
%1,
个基因座
总数"表
!
#中!
%"C
8
(
"C
8
(
&"C
8
和
#!"C
8
辐照菘蓝
的多态性基因座比率分别为$
%%+$&I
(
%,+,%I
(
)"+%#I
和
)%+)#I
"表
%
#可见!碳离子辐照后的菘
蓝在
JMG
水平与对照表现出明显的不同!且其多
态性随着辐照剂量的增加而增强
另外!用
$
对引物组合扩增出的野生型和辐照
突变体得到的条带数据来确定
M;.*O.
+
/
距离指数
其中!最高的距离指数是
"+,!,%
!出现在
%"C
8
与
#!"C
8
辐 照 材 料 之 间!而 最 低 的 距 离 指 数 是
"+)"&%
!出现在
%"C
8
与
"C
8
辐照材料(
%"C
8
辐
照材料与野生型对照组之间&所有样品之间平均距
离指数为
"+$#1)
"表
)
#
进一步基于
EFGH
分子标记做出的
THCVG
的进化树将野生型和突变体分为了两个簇!一个簇
包括
"C
8
和
#!"C
8
辐照材料!另一个簇包括了其
他的辐照突变体和野生型对照组!含有对照组的簇
&"&
$
期
!!!!!!!!!!!
阎
!
侃!等$碳离子辐照对菘蓝药性品质和分子水平的诱变效应
表
=
!
菘蓝
DE8/
数据统计
Z4Y5;!
!
E949./9.=/R>R!+%&%
(
)$%*#
编号
M>+
引物对
H<.3;<
7
4.<
总基因座数
Z>945
5>=@/
多态性基因座数
H>5
8
3><
7
6.=
5>=@/
多态性比率
H>5
8
3><
7
6./3
%
I
# V;#;3# & , ,,+,1
! V;#;3! & , ,,+,1
% V;#;3% , , #""
) V;#;3) #% #! &!+%#
$ V;#;3$ ) +,
V;#;3 1 ,$
, V;#;3, & +,
1 V;!;3# $ ) 1"
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$" V;1;3# , $ ,#+)%
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$! V;1;3% #""
$% V;1;3) 1 1 #""
$) V;1;3$ $ $ #""
$$ V;1;3 #""
$ V;1;3, $ $ #""
合计
Z>945 %1, %"& ,&+1)
又包含了两个子簇!一个是
"C
8
!另一个是野生型
和
%"C
8
"图
)
#!这样就更加直观低展现出了不同剂
图
%
!
不同剂量的碳离子辐照下菘蓝的
EFGH
分析结果
G
$
A
分别为引物组合
V;!23#
(
V;#23!
(
V;%23
的
HAF
扩增结果
].
:
+%
!
EFGH4045
8
/./>R!+%&%
(
)$%*#@0W;<
W.RR;<;09=40.>0.<<4W.49.>0W>/;/
G(A4<;HAF<;/@59/43
7
5.R.;WY
87
<.3;<
7
4.!
V;#23!40WV;%23
!
<;/
7
;=9.U;5
8
表
?
!
不同剂量碳离子辐照下菘蓝的多态性基因座比率
Z4Y5;%
!
H>5
8
3><
7
6.=5>=@/<49.>>R!+%&%
(
)$%*#
@0W;0.>0.<<4W.49.>0W>/;/
材料
V49;<.45
多态性基因座
H>5
8
3><
7
6.=5>=@/
多态性比率
H>5
8
3><
7
6.=<49.>
%
I
eZ " "
%"C
8
#%" %%+$&
"C
8
#) %,+,%
&"C
8
#$ )"+%#
#!"C
8
#1 )%+)#
表
>
!
不同剂量碳离子辐照下菘蓝的
B0#F5#
!
9
距离指数
Z4Y5;)
!
Z6;M;.40WO.
+
/W./940=;.0W;?>R!+%&%
(
)$%*#
@0W;0.>0.<<4W.49.>0W>/;/
材料
V49;<.45 eZ %"C
8
"C
8
&"C
8
%"C
8
"+)"&% ( ( (
"C
8
"+),% "+)"&% ( (
&"C
8
"+$#" "+$$#% "+$,1$ (
#!"C
8
"+$&) "+,!,% "+$#" "+)%%"
"#&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
量的辐照突变体之间基因组变异度的关系
=+>
!
碳离子辐照对菘蓝总蛋白表达水平的影响
碳离子辐照不仅会导致
JMG
水平的突变!也
会导致蛋白水平的变化突变体的蛋白水平变化
"条带的增加或缺失#可以用
EJE*HGC2
方法检
测)!#*本研究中野生型和碳离子辐照菘蓝总蛋白
表达水平使用
EJE*HGC2
进行了检测!再经考马斯
亮蓝
C*!$"
染色后"图
$
#!通过软件
K@409.9
8
b0;
利用蛋白
V4c;<
估算了所有条带的分子量!并分析
了同一分子量处条带的增减结果发现!野生型和
突变体菘蓝中一共分离出了
#&
个条带!其中
&
条具
有多态性!具体统计结果见表
$
&与野生型相比!辐
射突变体均出现了新增或消失的条带!
%"C
8
(
"C
8
(
&"C
8
和
#!"C
8
辐照菘蓝的多态性比率分别为
)!+##I
(
%+1)I
(
%+1)I
和
)!+##I
"表

#这说
明各剂量碳离子辐照对菘蓝的蛋白质表达水平造成
了不同程度的影响!而辐照突变体总蛋白的表达水
平与基因组的变化程度并不呈正相关关系
=+C
!
碳离子辐照对菘蓝磷酸化蛋白表达水平影响
磷酸化是一种蛋白质的翻译后修饰形式!参与
调控了很多生命过程!因此检测蛋白质的磷酸化状
态可以有效反映辐照对植物的生长发育的影响
图
)
!
不同剂量碳离子辐照的菘蓝基于
M;.*O.
+
/
距离指数的进化树
].
:
+)
!
Z6;
7
6
8
5>
:
;0;9.=9<;;>R=40.>0
"
W.RR;<;09
W>/;/
#
.<<4W.49;W!+%&%
(
)$%*#Y4/;W
>0M;.40WO.
+
/W./940=;.0W;?
图
$
!
不同剂量的碳离子辐照下菘蓝的
考马斯亮蓝染色
EJE*HGC2
胶图
].
:
+$
!
EJE*HGC2
:
;5>R=40.>0.<<4W.49;W
"
W.RR;<;09W>/;/
#
!+%&%
(
)$%*#/94.0;WY
8
A\H<>*K
是一种特异的磷酸化蛋白荧光染料!它可对
磷酸化基团特异性地着色野生型和各剂量辐照菘
蓝的
EJE*HGC2
胶经
H<>*K
染色后"图

#!通过软
件
K@409.9
8
b0;
分析!野生型和突变体中一共有
#"
个条带被着色!其中
1
条具有多态性!具体统计结果
见表
,
与野生型相比!各剂量 "
%"
(
"
(
&"
和
#!"C
8
#辐照菘蓝突变体条带多态性比率分别为
"I
(
"I
(
,"I
和
$"I
"表
1
#由此可见!碳离子
辐照对菘蓝蛋白磷酸化水平产生了影响!也就意味
表
C
!
不同剂量的碳离子辐照下菘蓝的
总蛋白条带统计
Z4Y5;$
!
E949./9.=/R><9>945
7
<>9;.0Y40W/>R!+%&%
(
)$%*#
@0W;0.>0.<<4W.49.>0W>/;/
蛋白分子量
V>5;=@54<
X;.
:
69
%
cJ
eZ %"C
8
"C
8
&"C
8
#!"C
8
#")+,! B B B B B
#"#+# B ( ( ( (
&"+"% B B B B (
1#+$" B B B B B
,,+,$ B ( ( ( (
%+$% B ( ( ( (
$$+1, B ( ( ( B
)&+1! B B B B B
)+&! B B B B B
)#+&1 B B B B B
%&+"$ B B B B B
%+$1 B B B B B
%%+&& B B B B B
%#+,, B ( B B (
!1+! B B B B B
!+1$ B ( ( ( (
!!+#! B B B B B
!#+"$ ( B B B B
#&+$, ( B B B B
!!
注$同一分子量蛋白大小处!
B
代表该处有条带!
(
代表没有条带
M>9;
$
G996;/43;3>5;=@54:
69
!
B<;
7
<;/;09/Y40W/;?./9
!
(<;
7
<;*
/;09/0>Y40W/+
表
G
!
不同剂量的碳离子辐照下菘蓝的
多态性蛋白条带比率
Z4Y5;
!
H>5
8
3><
7
6.=
7
<>9;.0Y40W/<49.>>R!+%&%
(
)$%*#
@0W;0.>0.<<4W.49.>0W>/;/
材料
V49;<.45
总条带
Z>945
Y40W
多态性条带
H>5
8
3><
7
6.=
Y40W
多态性比率
H>5
8
3><
7
6.=
<49.>
%
I
eZ #& " "
%"C
8
#& 1 )!+##
"C
8
#& , %+1)
&"C
8
#& , %+1)
#!"C
8
#& 1 )!+##
##&
$
期
!!!!!!!!!!!
阎
!
侃!等$碳离子辐照对菘蓝药性品质和分子水平的诱变效应
图

!
不同剂量的碳离子辐照下菘蓝的
H<>*K
染色
EJE*HGC2
胶图
].
:
+
!
EJE*HGC2
:
;5>R=40.>0.<<4W.49;W
"
W.RR;<;09W>/;/
#
!+%&%
(
)$%*#/94.0;WY
8
H<>*K
表
H
!
不同剂量的碳离子辐照下菘蓝的
磷酸化蛋白条带统计
Z4Y5;,
!
E949./9.=/R><9>945
7
6>/
7
6>
7
<>9;.0Y40W/>R
!+%&%
(
)$%*#@0W;0.>0.<<4W.49.>0W>/;/
蛋白分子量
V>5;=@54<
X;.
:
69
%
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8
"C
8
&"C
8
#!"C
8
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&$+"1 B B B B (
+,1 ( B ( B (
$&+&$ ( B B B (
$"+!" B B B B B
)!+," ( ( B B B
%$+"" B B B B B
!&+)$ B ( ( ( (
!+", ( B B B B
!%+)" B ( ( ( B
!!
注$同一分子量蛋白大小处!
B
代表该处有条带!
(
代表没有条带
M>9;
$
G996;/43;3>5;=@54:
69
!
B<;
7
<;/;09/Y40W/;?./9
!
(<;
7
<;*
/;09/0>Y40W/+
表
I
!
不同剂量的碳离子辐照下菘蓝的
多态性磷酸化蛋白条带比率
Z4Y5;1
!
H>5
8
3><
7
6.=
7
6>/
7
6>
7
<>9;.0Y40W/<49.>>R
!+%&%
(
)$%*#@0W;0.>0.<<4W.49.>0W>/;/
材料
V49;<.45
总条带
Z>945
Y40W
多态性条带
H>5
8
3><
7
6.=
Y40W
多态性比率
H>5
8
3><
7
6.=
<49.>
%
I
eZ #" " "
%"C
8
#" "
"C
8
#" "
&"C
8
#" , ,"
#!"C
8
#" $ $"
着碳离子辐照对调控菘蓝生长发育的分子机制产生
了影响!而这种变化跟其总蛋白表达水平一样!与其
基因组的变化程度并不呈正相关关系
%
!
讨
!
论
磷酸化是蛋白质翻译后修饰中很重要的一种!
磷酸化修饰会改变蛋白质的活性!完成蛋白激酶在
激活态和失活态之间的转变!如胰岛素受体)!!*根
据目前的研究!调控植物和动物生长发育的各大主
要途径几乎都有蛋白激酶的参与!如第六大类植物
激素油菜素内酯的受体
\FP#
)
!%
*
!通过一系列磷酸
化修饰将信号从细胞外转导至细胞内)!)*!从而调节
植物的细胞伸长(光形态建成(育性等至关重要的生
命过程)!$*!*可见!蛋白质的磷酸化状态可以从宏
观调控水平有效地反映生物的生长发育状态是否受
到影响因此!本研究使用了磷酸化染料
H<>*K
对
梯度剂量的碳离子辐照突变体进行了分析!这在重
离子诱导突变体的特性研究中还未见报道结果发
现!碳离子辐照对菘蓝的蛋白表达以及蛋白磷酸化
水平均造成了较大的改变!这些改变可能是因为辐
照造成的基因突变或者表观遗传学改变同时!本
研究还发现基因组突变频率与辐照强度呈正相关!
但总蛋白和磷酸化蛋白多态性并不如此!说明植物
在抵抗重离子辐照造成的伤害时有着补偿性的应对
机制!这其中的分子机理有待进一步的研究
利用碳离子辐照培育植物新品种有广泛的应用
前景相比一般低传能线密度的辐照!比如
Q
射
线(伽马射线等!碳离子辐照具有高传能线密度和强
生物学效应!能获得很多其他诱变源难以获得的表
型),*1*据统计!到目前为止已通过辐射诱变的方法
获得了
%#""
多种植物突变体)!,*此类研究还主要
集中在花卉观赏性表型的培育)&*和抗胁迫的农作物
的育种!如抗旱)!#*(抗盐)!1*等利用碳离子辐照进
行药用植物诱变育种的研究目前还相对较少本研
究利用碳离子辐照对药用植物菘蓝进行了诱变!首
先对最佳的辐照剂量进行了选择!其选择应该由处
理后的生长参数决定)!&*已有报道表明!高剂量的
伽马射线会导致甘蔗"
>#**0#-63"%&4&"4
#高比率的
突变率!但是同时甘蔗的成活率也下降了)%"*诱变
育种必须综合考虑突变率和成苗率之间的关系本
次研究发现!菘蓝种子成苗率和
%
个月时的根鲜重
均随碳离子辐照剂量增加而明显降低&相对其他剂
量处理!
%"C
8
对菘蓝生长抑制最小!实际突变率已
处于较高水平!是一个相对较好的诱变剂量另外!
靛玉红和喹唑酮是菘蓝中最重要的药用成分!前者
具有抗病毒功效)#*!后者具有良好的抗癌功效)%*
DHOA
的检测发现
%"C
8
的辐照剂量导致菘蓝根中
!#&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
喹唑酮和靛玉红含量分别比野生型升高了
!+!
倍和
!+%
倍!相比其他剂量也含量最高!且差异均达到显
著水平!这也进一步说明了
%"C
8
是菘蓝辐照育种
最佳的诱变剂量而更大剂量如
&"C
8
和
#!"C
8
辐
照处理!两种有效成分的含量并没有大幅度的改变!
可能是因为高突变率导致多种调控途径受影响!启
动了反馈抑制调节
本研究还使用了
EFGH
分子标记分析了菘蓝
辐照突变体基因组的变化!目前对碳离子辐照突变
体使用
EFGH
分析还未见报道不同于其他分子
标记的是!
EFGH
的上游引物特异结合外显子区域!
下游引物特异结合内含子区域或启动子区域!因不
同个体内含子(启动子与间隔区长度不同而产生多
态性!因此
EFGH
是对基因开放阅读框的扩增!能
够通过遗传作图更有效定位到有利性状的主效基
因)#)*作者前期通过正交实验建立起了菘蓝进行
EFGH
分析的最佳条件!并对辐照突变体进行扩增
后数据稳定可信!这为以后的研究中菘蓝有利基因
座的图位克隆提供了技术参考本研究中最佳条件
下
EFGH
数据显示!碳离子辐照菘蓝突变率在
%"
$
#!"C
8
剂量范围内随着辐照剂量的增强而增加!这
也与其他重离子辐照植物的基因组变化趋势相符!
且结果重复性较好!说明
EFGH
是一个很好的研究
重离子诱变特性指标
综上所述!本研究采用不同剂量"
%"
$
#!"C
8
#
碳离子辐照对传统中药材菘蓝进行诱变处理!发现
%"C
8
是最佳辐照剂量&
%"C
8
碳离子辐照后!导致菘
蓝根中主要的活性成分喹唑酮和靛玉红含量提高了
!+!
倍和
!+%
倍!且相比于其他剂量处理!
%"C
8
对
菘蓝根的产量影响最小同时!
EFGH
分子标记分
析结果表明!碳离子辐照后的菘蓝在
JMG
水平与
对照表现出明显的不同!且其多态性随着辐照剂量
的增加而增强&诱变后的菘蓝植株在蛋白水平和蛋
白修饰水平也有较大的改变本研究将为菘蓝在医
药行业中的大规模应用提供基础!也对其他药用植
物的诱变育种产生示范作用
参考文献"
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