全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(３): ２６５￣２７５(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０３￣０４ꎻ 修回日期: ２０１４￣０１￣２２
基金项目: 国家公益性行业(农业)科研专项 ＮＹＨＹＺＸ３￣１６ꎻ山东省"泰山学者"建设工程专项经费资助
通讯作者: 李宝笃ꎬ教授ꎬ主要从事真菌与真菌病害研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｂｄｌｉ＠ ｌｙａｃ.ｅｄｕ.ｃｎ
郭泽建ꎬ教授ꎬ主要从事分子植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｇｕｏｚｊ＠ｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 张 眉ꎬ女ꎬ山东济南人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事真菌与真菌病害研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｚｈａｎｇｍｅｉ＿０１２０＠１２６.ｃｏｍꎮ
玉米纹枯病菌细胞核纯化与原生质体转化的探讨
张 眉１ꎬ２ꎬ３ꎬ 周善跃１ꎬ２ꎬ 陈旭君３ꎬ 李宝笃１ꎬ２∗ꎬ 郭泽建３∗
( １青岛农业大学农学与植物保护学院ꎬ 青岛 ２６６１０９ꎻ ２山东省植物病虫害综合防控重点实验室ꎬ 青岛 ２６６１０９ꎻ
３中国农业大学农学与生物技术学院ꎬ 北京 １００１９３)
摘要:引起玉米纹枯病的立枯丝核菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｋüｈｎ)多为多核杂核真菌ꎬ也难以通过有性态使其细胞核进行单一
化ꎮ 利用原生质体再生的方法对单核玉米纹枯病菌 ＪＮ的细胞核进行同核纯化ꎬ比较从单个原生质体再生菌获得的 ｒＤＮＡ￣
ＩＴＳ序列ꎬ发现序列间存在差异ꎬ说明其细胞核没有达到预期纯化的效果ꎮ 继而扩增了双核和多核玉米纹枯病菌的 ｒＤＮＡ￣
ＩＴＳ序列ꎬ发现它们自身的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列也存在差异ꎬ因此认为立枯丝核菌的这种 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列的差异可能是长期未经
过有性阶段的结果且与其细胞核数目无关ꎮ 使用转化丝状真菌的载体转化纹枯菌未获得稳定的转化子ꎬ进而对载体进行
了改造ꎬ用纹枯菌(ＡＧ￣３)ａｃｔｉｎ基因的启动子和终止子控制潮霉素基因构建了载体 ｐＲｓＡꎮ 利用 ＰＥＧ介导的原生质体转化
方法ꎬ实现了对单核纹枯菌的转化ꎬＰＣＲ验证得到 ３个转化子ꎮ 但在 ＰＤＡ培养基连续继代 ５代后ꎬ转化子的潮霉素抗性消
失ꎮ 结果对改进纹枯菌的转化方法有借鉴意义ꎮ
关键词:玉米纹枯病菌ꎻ 原生质体ꎻ ＰＥＧ介导的转化
Ａ ｇｌｉｍｐｓｅ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｈｏｍｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ｔｈｒｏｕｇｈ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　 ＺＨＡＮＧ Ｍｅｉ１ꎬ ２ꎬ ３ꎬ ＺＨＯＵ Ｓｈａｎ￣ｙｕｅ１ꎬ ２ꎬ ＣＨＥＮ Ｘｕ￣ｊｕｎ３ꎬ ＬＩ Ｂａｏ￣ｄｕ１ꎬ ２ꎬ ＧＵＯ Ｚｅ￣ｊｉａｎ３
( １ Ａｇｒｏｎｏｍｙ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｑｉｎｇｄａｏ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０９ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
Ｃｒｏｐ Ｐｅｓｔｓ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０９ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３Ａｇｒｏｎｏｍｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌ￣
ｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｋüｈｎꎬ ｔｈｅ ｃａｕｓａｌ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｃｏｒｎ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔꎬ ａｒｅ ｍｏｓｔｌｙ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ ｈｅ￣
ｔｅｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｆｕｎｇｉꎬ ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｓｉｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｎｕｃｌｅｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｆｅｃｔ ｓｔａｇｅ. Ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙꎬ ｔｈｅ
ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ｓｔｒａｉｎ ＪＮ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ ｅａｃｈ ｗａｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ. Ｓｉｎｃｅ ｔｈｅ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｉｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔꎬ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓ ｎｏｔ ｏｂｔａｉｎｅｄ.
Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｃａｒｙｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｋａｒｙｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ. Ｈｏｗ￣
ｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｉｒ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｏｂｓｅｒｖｅｄ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓꎬ ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｓｉ￣
ｄｅｒｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｅｒｆｅｃｔ ｓｔａｇｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｕｔ ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅｕｓ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ
ｏｆ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ｓｔｒａｉｎ ＪＮ ｗｅｒｅ ｕｎａｂｌｅ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ￣
ｔｉｏｎ. Ａ ｖｅｃｔｏｒ ｐＲｓＡ ｔｈａｔ ｈｐｈ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｏｆ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ＡＧ￣３
ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ. Ｔｈｅ ｐＲｓＡ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ｓｔｒａｉｎ ＪＮ ｂｙ
ＰＥＧ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｌｏｓｔ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｆｔｅｒ ｒｅｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｆｏｒ ｆｉｖｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ＰＤＡ ｍｅｄｉｕｍ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
　
植物病理学报 ４４卷
ｍｉｇｈｔ ｈａｖｅ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｏｎ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｋüｈｎꎻ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔꎻ ＰＥＧ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３２.１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０３￣０２６５￣１１
　 　 玉米纹枯病是一种由立枯丝核菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ
ｓｏｌａｎｉ Ｋüｈｎ)侵染玉米引起的土传病害ꎬ是世界上
玉米产区广泛发生、危害严重的世界性病害之
一[１]ꎮ 核糖体内转录间隔区 ( ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ
ｓｐａｃｅꎬ ＩＴＳ)在进化过程中承受的自然选择压力较
小ꎬ进化速率较快ꎬ因此在绝大多数的真核生物中
表现出了极为广泛的序列多态性ꎮ 由于 ＩＴＳ 区域
在种内菌株间相对保守ꎬ但在种间的差异较为明
显ꎬ这种特点使其常用于对真菌物种的分类鉴定以
及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统
发育关系分析ꎮ Ｋｕｎｉｎａｇａ 等[２]研究表明ꎬ ｒＤＮＡ￣
ＩＴＳ序列分析可应用于区分立枯丝核菌不同融合
群或亚融合群菌株ꎮ
　 　 对立枯丝核菌的致病机理的研究较少ꎬ若能得
到该菌的致病相关基因ꎬ则对解释其致病机理有重
要的意义ꎮ 近年来ꎬ随着分子生物学在植物病理学
科的应用ꎬ真菌的遗传转化也越来越受到重视ꎬ通
过转化引起突变是获得重要基因的有效方法ꎮ 人
们陆续开发了针对丝状真菌的转化方法ꎬ例如:聚
乙二醇(Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌꎬ ＰＥＧ)介导的遗传转
化、限制性内切酶介导的遗传转化(Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎ￣
ｚｙｍｅ￣Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎꎬ ＲＥＭＩ)和根癌农杆菌
介导的遗传转化(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ￣ｍｅｄｉ￣
ａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬ ＡＴＭＴ)等ꎮ ２００１年 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ
等[３]利用 ＰＥＧ介导对立枯丝核菌进行了转化ꎬ并
得到了一些转化子ꎬ但这些转化子不能正常生长ꎻ
２００９年Ｗｕ等[４]利用 ＡＴＭＴ方法尝试了对立枯丝
核菌 ３ 个融合群 ＡＧ￣３、ＡＧ￣４ 和 ＡＧ￣６ 的转化ꎬ仅
融合群 ＡＧ￣６的转化获得了成功ꎮ 国内ꎬＧｕｏ 等[５]
报导了利用 ＰＥＧ 介导的方法ꎬ构建了针对水稻立
枯丝核菌的原生质体遗传转化体系ꎻＹａｎｇ 等[６]对
水稻纹枯病菌(Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ＡＧ￣１ⅠＡ)进行 ＡＴＭＴ 遗
传转化ꎮ
　 　 尽管立枯丝核菌有转化成功的报导ꎬ但这些研
究中仍然存在着有待进一步商榷或不甚清楚的地
方ꎬ如缺少 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交验证[５ꎬ ６]、转化子不能正
常生长[３]、在高浓度筛选培养基上转化子生长速
率与对照野生型菌不相当[４]等ꎬ其原因可能与立
枯丝核菌为多核ꎬ甚至为杂核有关ꎬ也可能与 ＤＮＡ
难以整合到该真菌染色体有关ꎮ 因此ꎬ获得同核的
立枯丝核菌对其转化研究很有必要ꎮ 本文利用原
生质体再生的方法对立枯丝核菌的细胞核进行同
核纯化ꎬ研究认为用该方法难以达到完全纯化效
果ꎮ 另外ꎬ还利用 ＰＥＧ 介导的方法对单核丝核菌
原生质体进行转化ꎬ得到 ３个不能稳定遗传的转化
子ꎮ 研究结果为建立稳定的玉米纹枯病菌遗传转
化体系提供参考ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料　
１.１.１　 供试菌株及质粒　 立枯丝核菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ
ｓｏｌａｎｉ)单核 ＪＮ菌株、双核 ＬＹ１ 菌株(ＡＧ￣Ｂａ)、多
核 ＸＮ５ 菌株(ＡＧ１￣ⅠＡ)和立枯丝核菌 ＡＧ￣３ 菌
株ꎻ大肠杆菌 ＤＨ５α 菌株和质粒 ｐＣＳＮ４３ (含
ＡｍｐｒꎬｈｐｈＢｒ)ꎮ
１.１.２　 生化试剂及其他 　 潮霉素 Ｂ(Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
Ｂ)购自 ＭＥＲＣＫꎬ氨苄青霉素(Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ)购自上
海 ＳａｎｇｏｎꎬＰＥＧ(Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ)购自 ＳＩＧＭＡ
公司ꎬ纤维素酶 ( Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ) 和离析酶 (Ｍａｃｅｒ￣
ｏｚｙｍｅ)购自 Ｂｌｏｄｅｅ公司ꎬ蜗牛酶(Ｓｎａｉｌａｓｅ)购自北
京经科宏达公司ꎬ各种限制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ 连
接酶、Ｔ４ ＤＮＡ 聚合酶以及 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体购自
ＴａＫａＲａ 公司 (大连 )ꎬ 普通 Ｔａｑ 酶购自上海
ＳａｎｇｏｎꎬＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自东盛公司ꎮ 其
他常规化学药品为分析纯试剂ꎮ ＰＣＲ 引物合成由
上海 Ｓａｎｇｏｎ合成ꎬＤＮＡ测序由中国农业科学院作
物科学研究所完成ꎮ
１.１.３　 培养基　 每升 ＰＤＢ液体培养基含 ２００ ｇ 马
铃薯和 ２０ ｇ葡萄糖ꎬ若加入 １８ ｇ琼脂粉为 ＰＤＡ培
养基ꎬ再加入 ０.８ ｍｏｌ 山梨醇为用于原生质体再生
的 ＰＤＳ培养基ꎮ
　 　 用于降解细胞壁的酶解液:每毫升含 ０. ７
ｍｍｏｌ ＮａＣｌꎬ１０ ｍｇ纤维素酶ꎬ２０ ｍｇ离析酶ꎬ１０ ｍｇ
蜗牛酶ꎬ待酶充分溶解后ꎬ以 ４℃ １２ ０００ ｒｐｍ 离心
１５ ｍｉｎꎬ取上清ꎬ过滤除菌ꎬ置于 ４℃保存备用ꎮ
６６２
　
　 ３期 张 眉ꎬ等:玉米纹枯病菌细胞核纯化与原生质体转化的探讨
　 　 用于转化的 ＳＴＣ 溶液:每升含 １ ｍｏｌ 甘露醇ꎬ
１００ ｍｍｏｌ Ｔｒｉｓ􀅰ＨＣｌ (ｐＨ ８.０)ꎬ１００ ｍｍｏｌ ＣａＣｌ２ꎬ
过滤除菌ꎻＰＴＣ 溶液:每升含 ４０％ ＰＥＧ ４ ０００ １００
ｍｍｏｌ Ｔｒｉｓ􀅰ＨＣｌ (ｐＨ ８.０)ꎬ１００ ｍｍｏｌ ＣａＣｌ２ꎬ过滤
除菌ꎬ现用现配ꎮ
１.２　 载体构建
　 　 根据立枯丝核菌 ＡＧ￣３ 的 ａｃｔｉｎ 基因序列ꎬ设
计 ＲｓＡｃｔ１ＰＫｐＦ ( ５′￣ＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＡ
ＧＣＣＴＡＴＴＡＴＧ￣３′) 和 ＲｓＡｃｔ１ＰＸｈＲ ( ５′￣ＴＴＣＴＣ￣
ＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＣＣＡ￣３′)ꎬ扩增
ａｃｔｉｎ启动子(命名为 Ａｃｔ１Ｐ)ꎻ ＲｓＡｃｔＴＢＩＦ(５′￣ＡＴ￣
ＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＧＴＡＧＧＣＴＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＣ￣３′) 和
ＲｓＡｃｔＴＳｃＲ ( ５′￣ＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＴＣＧＡＣＴＣ
ＡＣＣＡＧ￣３′)ꎬ扩增 ａｃｔｉｎ 终止子 (命名为 ＡｃｔＴ)ꎮ
然后以质粒 ｐＣＳＮ４３ 为母体ꎬ经过酶切连接ꎬ将
Ａｃｔ１Ｐ 和 ＡｃｔＴ 连接在潮霉素序列 ( ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅꎬ ｈｐｈ) (１ ０２３ ｂｐ)的两端ꎬ
构成转化载体 ｐＲｓＡꎮ
１.３　 玉米纹枯病菌原生质体的制备与再生
　 　 参考 Ｙａｎｇ等[７]的方法制备原生质体ꎬ并略加
改动ꎮ 玉米纹枯病菌在 ＰＤＡ 培养基平板上 ２８℃
培养 ４８ ｈꎬ用 ５ ｍｍ 打孔器在菌落边缘打取菌饼ꎬ
取 １０ 块菌饼放在 １００ ｍＬ ＰＤＢ 液体培养基中ꎬ
２８℃ １７０ ｒｐｍ 摇培 ３６ ｈꎬ用 ３ 层灭菌纱布过滤ꎬ收
集菌丝体ꎮ 用灭菌研钵将收集的菌丝体捣碎ꎬ然后
放入新的 １００ ｍＬ ＰＤＢ 液体培养基中ꎬ２８℃ １７０
ｒｐｍ摇培 １５ ｈꎬ用 ３ 层灭菌纱布过滤ꎬ再用 ０. ７
ｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ灭菌溶液冲洗菌丝 ３ 遍ꎬ最后用无菌
吸水纸吸干菌丝表面水分ꎮ
　 　 称量收集得到的菌丝ꎬ按照 １ ｇ 菌丝对 １０ ｍＬ
酶解液的比例混合ꎬ可以用剪去顶尖的枪头吸打ꎬ
使菌丝与酶解液充分混匀ꎬ混合液于 ５０ ｍＬ 三角
瓶或 ５０ ｍＬ离心管中 ２８℃ ８０ ｒｐｍ 酶解 ６ ｈꎮ 将 ３
层灭菌擦镜纸贴附于灭菌漏斗内壁ꎬ过滤酶解液ꎬ
去除菌丝碎段ꎬ用 １.５ ｍＬ 灭菌离心管在冰上收集
酶解滤液ꎬ然后 ４℃ ４ ０００ ｇ 离心 １０ ｍｉｎꎬ去上清ꎬ
沉淀即为原生质体ꎮ 加入适量的 ０.７ ｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ
灭菌溶液ꎬ用剪去顶尖的枪头轻轻吸打悬浮沉淀ꎬ
４℃ ４ ０００ ｇ 离心 １０ ｍｉｎꎬ去上清ꎬ用适量的 ０. ７
ｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ溶液悬浮原生质体ꎬ血球计数板计数ꎮ
　 　 将原生质体稀释至 １０３ ~ １０４个 / ｍＬꎬ取 ３０ ~ ５０
μＬ均匀地涂布在 ＰＤＳ再生培养基平板上ꎬ涂布时
动作要轻柔以防原生质体破裂ꎬ然后在超净工作台
内吹干ꎬ２８℃倒置培养 ２~３ ｄꎮ 挑取再生的单根菌
丝ꎬ接种到 ＰＤＡ 平板中央ꎬ一根菌丝接种一个
ＰＤＡ平板ꎬ２８℃培养ꎬ长出的菌落即为细胞核纯化
的一代纹枯菌ꎮ
　 　 通过此方法ꎬ以野生型单核丝核菌 ＪＮ为母本ꎬ纯
化的第 １代命名为 ＪＮＡ８ꎻ再以 ＪＮＡ８为母本ꎬ纯化的
第 ２代命名为 ＪＮＢ７ꎻ再以 ＪＮＢ７为母本ꎬ纯化的第 ３
代命名为 ＪＮＣ１ꎮ 双核丝核菌 ＬＹ１的纯化方法同上ꎬ
连续纯化 ２代分别命名为 ＬＹ１Ａ和 ＬＹ１Ｂꎮ
１.４　 ＰＣＲ扩增及序列分析
　 　 以 ＪＮ和 ＬＹ１各纯化后代以及野生型 ＬＹ１ 和
ＸＮ５的基因组 ＤＮＡ为模板ꎬ用引物 ＩＴＳ１Ｆ(５′￣ＴＣ￣
ＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ￣３′) 和 ＩＴＳ４Ｒ ( ５′￣ＴＣ￣
ＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３′)扩增 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序
列ꎮ ＰＣＲ扩增条件为 ９４℃ ４ ｍｉｎꎻ９４℃ ３０ ｓꎬ６０℃
３０ ｓꎬ７２℃ ４０ ｓꎬ２８个循环ꎻ７２℃ １０ ｍｉｎꎮ 切胶回收
目的条带ꎬ连接到 ｐＭＤ１８￣Ｔ载体ꎬ各菌株均随机挑
选 ５个样品进行测序ꎮ
　 　 通过 Ｃｌｕｓｔａｌｘ１.８３ 软件比对 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列ꎬ
利用 ＭＥＧＡ ５.０ 分析软件ꎬ采用 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ
分析法建立系统发育树ꎬ基于 Ｋｉｍｕｒａ ２￣ｐａｒａｍｅｔｅｒ
距离模式计算各样品间的遗传距离ꎬ由 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ
(１ ０００次重复)检验各分支的置信度ꎮ
１.５　 玉米纹枯病菌对潮霉素 Ｂ敏感性的测定
　 　 采用十字交叉测量法ꎮ 将长满滤纸片(５ ｍｍ×５
ｍｍ)菌龄为 ２ ｄ 的玉米纹枯病菌 ＸＮ５、ＬＹ１ 和 ＪＮꎬ
接种到含有潮霉素 Ｂ 浓度分别为 ０ μｇ / ｍＬ、５ μｇ /
ｍＬ、１０ μｇ / ｍＬ和 ２０ μｇ / ｍＬ的 ＰＤＡ培养基平板中
央ꎬ有菌丝的一面朝下ꎬ２８℃倒置培养ꎬ每个处理重
复 ３次ꎬ每 ２４ ｈ用十字交叉法测量菌落直径ꎮ
１.６　 ＰＥＧ介导的原生质体转化
　 　 ＰＥＧ 介导的原生质体转化参照 Ｇｕｏ 等[５]和
Ｃｈｅｎ等[８]的方法并略有修改ꎮ 取 １００ μＬ 纹枯菌
ＪＮ的原生质体(浓度为 ５×１０７个 / ｍＬ)加入 ５ μｇ质
粒 ｐＲｓＡ轻轻混匀ꎬ冰浴 ３０ ｍｉｎꎬ逐滴加入 １ ｍＬ ＰＴＣ
溶液ꎬ室温放置 ２５ ｍｉｎꎬ４℃ ８ ０００ ｒｐｍ 离心 ５ ｍｉｎꎬ
去上清ꎬ用 ５００ μＬ ＳＴＣ溶液悬浮沉淀ꎬ将悬浮液加入
到 ５０ ｍＬ ＰＤＳ再生培养基中(融化后冷却至 ５０℃)ꎬ
轻轻摇匀ꎬ倒入灭菌培养皿ꎬ２８℃再生孵育 ２４ ｈꎮ
７６２
　
植物病理学报 ４４卷
　 　 将含有 １０ μｇ / ｍＬ潮霉素 Ｂ的 ＰＤＡ抗性培养
基覆盖在孵育后的再生平板上ꎬ每皿约倒入
１５ ｍＬꎬ２８℃倒置黑暗培养 ７ ｄꎬ初筛单菌落转化
子ꎮ 将得到的初筛单菌落转化子再转接到含 １０
μｇ / ｍＬ潮霉素 Ｂ的 ＰＤＡ平板上ꎬ２８℃复筛ꎮ
１.７　 转化子的 ＰＣＲ鉴定和遗传稳定性检测
　 　 提取野生型 ＪＮ 菌株和转化子菌株基因组
ＤＮＡ作为模板ꎮ 根据转化载体 ｐＲｓＡ 上的潮霉素
抗性基因(ｈｐｈ)为模板设计一对特异性引物ꎬｈｐｈＦ
( ５′￣ＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＴ
ＡＣＧ￣３′)和 ｈｐｈＲ ( ５′￣ＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＧＣＡＣＧＡ
ＧＧＡＣＧＡＧＴＡＧＡＡＧＧ￣３′)ꎮ ＰＣＲ 扩 增 条 件 为
９５℃ ５ ｍｉｎꎻ９５℃ ３０ ｓꎬ６０℃ ３０ ｓꎬ７２℃ ６０ ｓꎬ３０ 个
循环ꎻ７２℃ １０ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ 产物连接 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载
体ꎬ测序验证ꎮ
　 　 将验证正确的转化子接种到不含潮霉素的 ＰＤＡ
培养基平板上ꎬ２８℃培养ꎬ菌落长满全皿后ꎬ在菌落边
缘打取菌饼ꎬ再接种到不含潮霉素的 ＰＤＡ培养基平
板上ꎬ如此继代 ５次ꎬ然后提取基因组 ＤＮＡ作模板进
行 ｈｐｈ基因检测ꎬ扩增引物、扩增条件同上ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 玉米纹枯病菌原生质体制备
　 　 综合已报导的方法ꎬ使用不同的细胞壁降解酶
的组合和量ꎬ当采用 １０ ｍｇ / ｍＬ 纤维素酶ꎬ２０ ｍｇ /
ｍＬ 离析酶和 １０ ｍｇ / ｍＬ蜗牛酶组合ꎬ２８℃酶解 ６ ｈ
后ꎬ每克玉米纹枯菌菌丝可以获得 １~５×１０６个原生
质体(图 １)ꎮ 实验过程中还发现ꎬ酶解时间若超过
Ｆｉｇ. １ 　 Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ
ｓｔｒａｉｎ ＪＮ
６ ｈꎬ原生质体数反而会减少ꎬ这与 Ｎｉｎｇ[９]、 Ｆｕ
等[１０]、Ｑｕ等[１１]的结果相似ꎬ可能是因为酶液中的
蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶等杂酶破坏了原生质
体膜而导致了原生质体破裂ꎮ
２.２　 再生的玉米纹枯病菌 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列间存在
差异
　 　 将单核立枯丝核菌(ＪＮ)的原生质体稀释(１０３
~１０４个 / ｍＬ)后取 ３０ ~ ５０ μＬ 均匀地涂布在 ＰＤＳ
培养基上再生ꎬ挑取单根生长出来的菌丝ꎬ接种到
ＰＤＡ培养基ꎬ长出的菌落即为细胞核纯化的一代
纹枯菌ꎮ 在纯化第 １代中随机挑选一个再生菌ꎬ扩
增其 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列并任选 ５ 个单克隆测序ꎬ且以
该再生菌为母本进行纯化得到第 ２代再生菌ꎬ以此
类推ꎮ 分析 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列发现ꎬ可以将第 １ 代
ＪＮＡ的 ５条序列大致分成两类ꎬＪＮＡ￣７的 ＩＴＳ序列
为 ６７８ ｂｐ 不仅较其他 ４ 个少一个碱基ꎬ且实际上
碱基间存在很大差异ꎬ同源性约在 ９４％ꎬ差异主要
集中在 １２０ ~ ２００ ｂｐ 之间ꎮ 另外ꎬ ＪＮＡ￣１、 ＪＮＡ￣３、
ＪＮＡ￣５和 ＪＮＡ￣９的 ＩＴＳ序列间也有 １ ~ ３ 个碱基的
不同ꎮ 然后纯化得到第 ２ 代 ＪＮＢ 再生菌并获得了
４条ꎬ其中 ＪＮＢ￣１７有一个碱基缺失ꎮ 同样ꎬ纯化到
第 ３代也存在两种类型的 ＩＴＳ序列ꎮ 因此ꎬ无论是
各代之间还是各代内部ꎬ单核丝核菌的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ
序列都存在差异ꎮ
　 　 然后ꎬ我们又分析了双核立枯丝核菌 ＬＹ１ꎮ
经过 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ测序后发现ꎬ纯化第 １ 代和纯化第
２代的的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列长度都是 ６７８ ｂｐꎬ但是每
一代中都有一个样品发生变异ꎮ 同样ꎬ多核立枯丝
核菌 ＸＮ５ 的 ５ 条序列中ꎬＸＮ５￣２、ＸＮ５￣３和 ＸＮ５￣５
均为 ７１２ ｂｐꎬ其中 ＸＮ５￣２ 和 ＸＮ５￣３ 同源性为
１００％ꎬＸＮ５￣５与它们比对仅在第 ８４ 个碱基发生由
Ｃ→Ｔ的变异ꎻＸＮ５￣１和 ＸＮ５￣４缺失两个碱基且缺
失位点相同ꎬ全碱基序列也相同ꎬ它们与 ＸＮ５￣２相
比ꎬ仅存在碱基缺失的不同ꎬ其余碱基均相同ꎮ 此
外ꎬＸＮ５￣２ 与 ＪＮＡ￣３、 ＬＹ１￣１ 的同源性分别为
７９􀆰 ２５％和 ８０􀆰 ３３％ꎬ碱基缺失均主要在 ３０ ~ １００ ｂｐ
和 ４５０~５４０ ｂｐ区域ꎬ１４０~２３０ ｂｐ之间则存在大量
碱基差异ꎮ
８６２
　
　 ３期 张 眉ꎬ等:玉米纹枯病菌细胞核纯化与原生质体转化的探讨
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｔｒｅｅ ｏｆ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ￣ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ
ＸＮ５ꎬ ＬＹ１ ａｎｄ ＪＮ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｐｏｌｙｋａｒｙｏｎꎬ ｄｉｋａｒｙｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｏｃａｒｙｏｎ Ｒ􀆰 ｓｏｌａｎｉꎻ Ａꎬ Ｂ ａｎｄ Ｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｆｉｒｓｔꎬ ｓｅｃｏｎｄ ａｎｄ
ｔｈｉｒｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎꎻ ｆｉｇｕｒｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅ ｃｌｏｎｅｓ. Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｔｒｅｅ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｓ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ
ｉｎ ｔｅｒｍｓ ｏｆ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅ￣ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ ＸＮ５
ａｎｄ ＬＹ１ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ＬＹ１ ａｎｄ ＪＮ ｉｎ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ. Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｔ ｅａｃｈ ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｂａｓｅｄ ｏｎ １０００ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ. Ｔｈｅ ｓｃａｌｅ ｂａｒ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ０.０１ ｓｕｂｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ.
　 　 根据以上序列构建了系统发育树(图 ２)ꎬ除
ＪＮ的 ３ 个序列聚类在双核的 ＬＹ１ 类外ꎬ来源同一
菌株的序列聚类在同一组ꎬ说明了不同纹枯菌菌株
的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列存在差异ꎮ 此外ꎬ还可以看出单
核 ＪＮ与双核 ＬＹ１间的 ＩＴＳ序列遗传距离较近ꎬ而
与多核的 ＸＮ５ 序列较远ꎮ 偏离聚类的 ＪＮＡ￣７、
ＪＮＢ￣１７和 ＪＮＣ￣２都有一个碱基的缺失ꎬ且与其他
单核 ＪＮ再生菌( ＪＮＡ￣３)的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列有较大
差异ꎬ反而与双核 ＬＹ１￣１ 的同源性几乎相同(图
２)ꎬ这可能使得 ＪＮＡ￣７、ＪＮＢ￣１７ 和 ＪＮＣ￣２ 与其 ＩＴＳ
序列碱基数相同的双核纹枯病菌 ＬＹ１ 聚类在一
起ꎬ同时ꎬＬＹ１￣１与 ＪＮＡ￣３ 的碱基差异主要集中出
现在 １２０~ ２００ ｂｐ(图 ３)ꎬ这与 ＪＮＡ￣７ 和 ＪＮＡ￣３ 的
碱基差异集中位置相同ꎮ可见单核菌 ＪＮ中存在
９６２
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ３　 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ＪＮＡ￣３ ａｎｄ ＬＹ１￣１
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ＪＮＡ￣３ ａｎｄ ＬＹ１￣１ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ ＩＴＳ１Ｆ ａｎｄ ＩＴＳ４Ｒ
ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｓｅｄ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡＭＡＮ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ.
自身的 ＩＴＳ序列外还有与双核菌 ＬＹ１ 相同的 ＩＴＳ
序列ꎮ 因此ꎬ原生质体再生的方法难以对立枯丝核
菌细胞核进行同核纯化ꎬ可能需要更高代的原生质
体再生ꎻ序列之间存在较多的碱基变异有可能与立
枯丝核菌菌核的复杂有关联ꎮ
２.３　 核少的纹枯菌对潮霉素更敏感
　 　 为了确定筛选纹枯菌转化子的合适的潮霉素
浓度ꎬ通过十字交叉法测量菌落生长速率ꎮ 可以看
出ꎬ在不含潮霉素 Ｂ 的 ＰＤＡ 培养基上ꎬ纹枯病菌
ＸＮ５生长速率最快ꎬ两天即可长满全皿ꎬ而 ＬＹ１和
ＪＮ需要 ４ ｄꎬ同时从 １ ~ ３ ｄ 的菌落大小可以得出
ＪＮ比 ＬＹ１的生长速率稍快(图 ４)ꎮ 在含潮霉素 Ｂ
的平板上ꎬ纹枯病菌 ＸＮ５的生长受到抑制ꎬ潮霉素
浓度越高抑制越强烈ꎬ但是即使浓度为 ２０ μｇ /
ｍＬꎬ２ ｄ菌落直径仍可以达到约 ４０ ｍｍ(图 ４￣Ａ)ꎻ
纹枯病菌 ＬＹ１受到的抑制比 ＸＮ５ 更显著ꎬ虽然在
潮霉素浓度为 ５ μｇ / ｍＬ、１０ μｇ / ｍＬ 和 ２０ μｇ / ｍＬ
下均可以生长ꎬ但菌落较小只有 １１ ~ １８ ｍｍꎬ并且
２~４ ｄ内菌落大小没有明显变化(图 ４￣Ｂ)ꎻ纹枯病
菌 ＪＮ在潮霉素浓度为 ５ μｇ / ｍＬ 时第 １ 天与 ＬＹ１
相似但随后有些生长ꎬ不过当潮霉素浓度为 １０
μｇ / ｍＬ或者 ２０ μｇ / ｍＬ时 ＪＮ已基本不能生长(图
４￣Ｂꎬ Ｃ)ꎮ 可见ꎬ立枯丝核菌随着细胞核的数量增
加ꎬ对潮霉素 Ｂ的敏感有降低的趋势ꎮ
２.４　 ＰＣＲ检测确证得到转化子
　 　 在使用多种转化载体而无法得到转化子的情
况下ꎬ开始对转化载体进行了改造ꎬ构建了与单核
纹枯病菌 ＪＮ具有同源启动子和终止子的载体 ｐＲ￣
ｓＡ(图 ５)ꎮ 将该载体通过 ＰＥＧ介导的方法转入纹
枯病菌ＪＮ的原生质体中ꎬ经过抗性初筛和复筛ꎬ
０７２
　
　 ３期 张 眉ꎬ等:玉米纹枯病菌细胞核纯化与原生质体转化的探讨
Ｆｉｇ. ４　 Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ＰＤＡ ｐｌａｔｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ
Ａ ｔｏ Ｃ: Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ ＸＮ５ꎬ ＬＹ１ ａｎｄ ＪＮ ｆｒｏｍ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ｗｅｒｅ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ＰＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
０ꎬ ５ꎬ １０ꎬ ２０ μｇ / ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ ｂｒａｃｋｅｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｅｖｅｒｙ ２４ ｈ.
Ｍｅａｎ ａｎｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ.
Ｆｉｇ. ５　 Ｔｈｅ ｓｋｅｔｃｈ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＲｓＡ
Ａｃｔ１Ｐ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｇａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ＲｓＡｃｔ１ＰＫｐＦ / ＲｓＡｃｔ１ＰＸｈＲ
ｉｎ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ＡＧ￣３ꎬ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｒｉｖｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｐｈ ｇｅｎｅꎻ ＡｃｔＴ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ＲｓＡｃｔＴＢＩＦ / ＲｓＡｃｔＴＳｃＲ ｉｎ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ＡＧ￣３. Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ (ｈｐｈ) ｇｅｎｅ
ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｏｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＳＮ４３ ａｄｊａｃｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ＸｈｏⅠａｎｄ ＢａｍＨⅠｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ.
Ａｃｔ１Ｐ ａｎｄ ＡｃｔＴ ａｒｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｂｏｔｈ ｅｎｄｓ ｏｆ ｈｐｈ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＲｓＡ.
１９ ｄ后在含 １０ μｇ / ｍＬ潮霉素 Ｂ的抗性平板上ꎬ有
３个转化子长满培养皿ꎬ而野生型 ＪＮ 菌株却几乎
不能生长ꎮ 将这 ３个转化子分别记作转化子 ４、转
化子 ９和转化子 １４ꎬ观察它们的菌落形态ꎬ转化子
９在菌落表面形成白色近球形菌核(图 ６￣Ｂ)ꎬ转化
子 ４ 和转化子 １４ 的菌落淡褐色ꎬ菌丝厚密呈棉絮
状ꎬ无菌核(图 ６￣Ａ、 Ｃ)ꎮ 这些生长表型都有异
于野生型ＪＮ菌株ꎬ在ＰＤＡ培养基上ＪＮ菌落可见
１７２
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ６　 Ｓｅｃｏｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｏｎ ＰＤＡ ｐｌａｔｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０ μｇ / ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ
Ａ ｔｏ Ｃ: Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ４ꎬ ９ ａｎｄ １４ꎻ Ｄ: Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｉｓｏｌａｔｅ(ＪＮ) .
Ａ ｔｏ Ｃ: Ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ＰＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
１０ μｇ / ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ａｆｔｅｒ ｇｒｏｗｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ. Ｄ: Ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ＪＮ ｇｒｏｗｎ ｏｎ
ＰＤＡ ｐｌａｔｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０ μｇ / μＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ. Ｐｈｏｔｏｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ａｆｔｅｒ １９ ｄａｙｓ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｔ ２８℃. Ｂａｒｓ ＝ １ ｃｍ.
Ｆｉｇ. ７　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｂｙ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ ｈｐｈＦ / ｈｐｈＲ
Ａ: Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｈｐｈ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｓｅｃｏｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｎ ＰＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０ μｇ / ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
Ｂꎻ Ｂ: Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｈｐｈ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｆｉｖｅ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ｎｏｎ￣ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
ＰＤＡ ｐｌａｔｅｓ. Ｍ: ＤＬ２ ０００ꎻ Ｌａｎｅｓ ４ꎬ ９ ａｎｄ １４: Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓꎻ Ｌａｎｅ “ ￣￣”: Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｉｓｏｌａｔｅ (ＪＮ)ꎻ Ｌａｎｅ “＋”: ｐＲｓＡ.
环状生长圈ꎬ只在菌落边缘与培养皿相接处有片状
黑褐色菌核ꎬ有时可沿培养皿连成一圈ꎮ 综上ꎬ我
们认为这 ３个转化子可能是转入潮霉素抗性基因
的玉米纹枯病菌转化子ꎮ
　 　 为了进一步确定这 ３个转化子的可靠性ꎬ又分
别提取了它们的基因组ꎬ并以质粒 ｐＲｓＡ ＤＮＡ 和
野生型 ＪＮ菌株基因组 ＤＮＡ 作正、负对照ꎬ以潮霉
素基因的上下游引物 ｈｐｈＦ 和 ｈｐｈＲ 进行 ＰＣＲ 扩
增ꎮ 通过 ＰＣＲ 电泳图可以看出ꎬ３ 个转化子和质
粒 ｐＲｓＡ均能扩增出一条大小约 １ ｋｂ 的潮霉素条
带ꎬ而野生型 ＪＮ菌株没有扩增条带(图 ７￣Ａ)ꎬ并将
ＰＣＲ产物进行了测序验证ꎮ 由此可见ꎬ３ 个转化子
中确实转入了潮霉素抗性基因ꎮ
２.５　 转化子无遗传稳定性
　 　 为了检测这 ３个转化子是否具有遗传稳定性ꎬ
将它们分别接种到无潮霉素压力的 ＰＤＡ培养基中
央ꎬ连续继代培养 ５代ꎮ 然后在第 ５代菌落边缘打
取菌饼ꎬ重新接种到含 １０ μｇ / ｍＬ潮霉素浓度的平
板上培养ꎬ野生型 ＪＮ菌株作对照ꎬ结果这 ３个转化
子与对照都明显受到抑制ꎬ几乎不能生长ꎮ 然后提
取了无压力第 ５次继代后的转化子基因组作模板ꎬ
扩增 ｈｐｈ 基因ꎬ检测潮霉素抗性基因是否已丢失ꎮ
从 ＰＣＲ电泳图可以看出ꎬ转化载体 ｐＲｓＡ可以扩增
出一条约 １ ｋｂ的条带ꎬ但 ３ 个转化子和野生型 ＪＮ
菌株均没有扩增条带(图 ７￣Ｂ)ꎮ 因此可以得出ꎬ经
过无潮霉素压力连续继代培养 ５ 代后ꎬ３ 个转化子
中的潮霉素抗性基因均已丢失ꎬ该基因在转化子中
的遗传表达并不稳定ꎮ
３　 结论与讨论
　 　 原生质体在现代分子生物学中发挥着日益重
要的作用ꎬ如原生质体融合技术、转基因工程技术
等都与原生质体密切相关ꎬ因此原生质体的制备是
２７２
　
　 ３期 张 眉ꎬ等:玉米纹枯病菌细胞核纯化与原生质体转化的探讨
这些技术的关键所在ꎬ因而也成为一个重要的研究
课题[１２]ꎮ 目前ꎬ制备原生质体多采用酶解法以各
种破壁酶溶解细胞壁ꎮ 本研究在制备玉米纹枯病
菌原生质体时ꎬ未使用现在广泛应用于制备病原真
菌原生质体的裂解酶(Ｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ)、崩溃酶
(Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ) [９]ꎬ而是使用了纤维素酶、离析酶和蜗
牛酶的组合酶解液ꎮ 真菌因种类不同其细胞壁成
分也有很大差别[１３]ꎬ因此使用何种酶解液也有所
不同ꎮ 玉米纹枯病菌作为一种担子菌ꎬ其细胞壁主
要成分是几丁质和葡聚糖ꎮ 蜗牛酶是一种复合酶ꎬ
含有几丁质酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶、纤维素酶、
酯酶等 ３０多种酶ꎬ是制备真菌原生质体有效的工
具酶之一[１１]ꎬ适合含葡聚糖较多的真菌[９]ꎮ 在研
究中发现ꎬ纤维素酶与离析酶共同使用比仅用一个
效果好ꎬ且离析酶对原生质体的产率影响更大ꎬ这
与 Ｈｕ等[１３]的研究结果基本一致ꎮ 使用本实验中
的酶解液裂解每克鲜重菌丝得到 １０６个原生质体ꎬ
可以满足转化要求[１０]ꎬＺｈａｎｇ 等[１４]在原生质体量
为 １０６个左右时成功得到了转化子ꎬ而且该酶解液
成本相对较低ꎬ使用更为经济ꎮ 在研究中ꎬ我们选
用 ０.７ ｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ 作为原生质体的稳渗剂ꎬ在制
备原生质体时其效果比蔗糖、ＭｇＳＯ４等物质好ꎬ这
与 Ｆｕ等[１０]的结果基本一致ꎬ但在 Ｈｕ等[１３]、Ｚｈａｎｇ
等[１５]的研究中使用 ＭｇＳＯ４作为稳渗剂可以获得
较高的原生质体量ꎮ 因此ꎬ使用哪种稳渗剂取决于
真菌本身的特性ꎮ
　 　 目前ꎬ关于立枯丝核菌遗传转化的研究已经有
些报道ꎬ但使用的菌多为多核菌ꎬ这些都会影响到
转化效果ꎮ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ[１６]研究认为ꎬ利用原生质体再
生的方法可以使杂核的立枯丝核菌纯化为同核体ꎮ
因此本研究首先利用原生质体再生的方法ꎬ对这株
单核立枯丝核菌 ＪＮ 进行细胞核纯化ꎬ然后扩增其
３个连续纯化后代的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列ꎬ进行序列比
对ꎬ结果表明各代之间以及各代内部均存在差异ꎮ
因此ꎬ说明原生质体再生的方法可能需要很高代数
的再生才有可能得到细胞核纯化ꎮ 这种杂核现象
之后ꎬ我们又扩增了双核丝核菌 ＬＹ１ 和多核丝核
菌 ＸＮ５ 的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列ꎬ结果出现了同样的情
况ꎬ碱基序列并不能完全一致ꎮ 这表明ꎬ无论是单
核、双核还是多核立枯丝核菌ꎬ它们自身的 ｒＤＮＡ￣
ＩＴＳ序列都是有所不同的ꎬ也就是说立枯丝核菌的
ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列与其细胞核数目是没有必然关联
的ꎬ而这种差异可能是该菌在自然条件下长期未经
过有性阶段的结果ꎮ 所构建的系统发育树中ꎬ单核
丝核菌和双核丝核菌分在同一个大分支内(图 ３)ꎬ
从这些结果可以推测ꎬ单核丝核菌与双核丝核菌的
亲缘关系可能更近ꎮ 更有趣地是ꎬ单核丝核菌中的
ＪＮＡ￣７、ＪＮＢ￣１７ 和 ＪＮＣ￣２ 与双核丝核菌 ＬＹ１(Ｒｈｉ￣
ｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ＡＧ￣Ｂａ)在一个分支内ꎬ并且它们的
ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列同源性可以高达 ９９. ８０％ꎮ 通过
ＮＣＢＩ进行 ＢＬＡＳＴ分析ꎬ发现单核丝核菌 ＪＮ 与双
核丝核菌 ＹＲ２７０(Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ. ＡＧ￣Ｂａ)的亲
缘关系最近ꎬ两者同源性为 ９９％ꎮ 同时参照 Ｋｕｎｉ￣
ｎａｇａ等[２]的研究ꎬ我们进一步推测单核丝核菌 ＪＮ
与属于 ＡＧ－Ｂａ 融合群的双核丝核菌之间可能存
在着一定的进化关系ꎮ 并且两者对潮霉素 Ｂ 都很
敏感(图 ４)ꎬ也许是对这一推测的另一种证明ꎮ
　 　 本研究还利用 ＰＥＧ介导的方法对单核立枯丝
核菌 ＪＮ菌株进行转化ꎬ得到了 ３ 个可以长满含 １０
μｇ / ｍＬ潮霉素抗性平板的转化菌落ꎮ 潮霉素对野
生型真菌有毒性ꎬ因此在含有潮霉素的抗性培养基
上长出的菌落一般都是转化菌落[１７]ꎮ 从菌落形态
来看ꎬ３个转化菌落与野生型 ＪＮ 菌株都有所不同ꎮ
基因发生突变后ꎬ突变体的表型性状会出现某些变
化[１０ꎬ １４ꎬ １８]ꎮ 因此我们断定潮霉素抗性基因已转入
这 ３个转化子中ꎮ 用 ＰＣＲ扩增 ｈｐｈ 基因进一步确
证 ３个转化子内均有一条潮霉素扩增条带ꎮ 因此ꎬ
正如在其他丝状真菌中的应用一样ꎬＰＥＧ 介导的
遗传转化方法同样适用于玉米纹枯病菌ꎬ而且采用
本实验的转化方法可以将外源 ｈｐｈ 基因成功转入
玉米纹枯病菌ꎮ 但是 ３个转化子在 ＰＤＡ培养基继
代培养五代后ꎬ潮霉素抗性与 ｈｐｈ 基因全部丢失ꎬ
所以说它们都没有遗传稳定性ꎮ Ｗｕ 等[４]、Ｚｈａｎｇ
等[１５]研究中也出现了相似的情况ꎬ经 ＰＣＲ 验证的
阳性转化子在非选择培养基继代后ꎬ潮霉素抗性消
失ꎮ Ｗｕ等[４]认为这可能是外源基因在宿主染色
体中出现了转录沉默的结果ꎮ 在 Ｚｈａｎｇ 等[１５]研究
中ꎬ只有 ３１.６％的转化子在重新接种到选择培养基
上可以继续生长ꎬ而且这些转化子均为质粒线性化
转化得到的ꎬ质粒非线性化得到的转化子全部流
产ꎮ 因此认为ꎬ在转化时质粒线性化更利于外源基
因整合到宿主的染色体中[１０ꎬ １４ꎬ １５]ꎮ 进而我们利用
ＲＥＭＩ 的方法进行转化ꎬ结果却不同于前人的研
３７２
　
植物病理学报 ４４卷
究ꎬ只能在初筛培养基得到转化菌落ꎬ复筛时转化
菌落生长缓慢或不再生长ꎬＰＣＲ 扩增没有目的条
带ꎬ可能是转化载体没有整合到宿主基因组中ꎬ只
是发生了瞬时转化ꎬ最终外源基因丢失导致了转化
子流产[４]ꎬ另外ꎬＷｕ 等[４]还认为这可能是由于菌
丝簇的存在掩盖了潮霉素的抑制作用ꎮ 根癌农杆
菌介导的遗传转化(ＡＴＭＴ)方法已经成功的应用
于丝状真菌[１９ꎬ ２０ꎬ ２１]ꎬ包括立枯丝核菌[４ꎬ ６]ꎬ然而我
们在尝试使用该方法时ꎬ却没有成功ꎮ 因此ꎬ本研
究表明ꎬ在玉米纹枯病菌 ＪＮ 菌株转化时ꎬ仅有
ＰＥＧ介导的方法可以适用ꎮ
　 　 在真菌的遗传转化中潮霉素抗性基因(ｈｐｈ)
已被广泛的应用[２２]ꎬ而以潮霉素抗性作为选择标
记转化真菌时ꎬ必须要有一个能在宿主真菌中起作
用的启动子来调控 ｈｐｈ 基因的编码[２３]ꎮ 目前ꎬ在
真菌转化中常使用 ｇｐｄ、ＴｒｐＣ 启动子调控潮霉素
抗性基因ꎬ并获得了成功[４ꎬ ８ꎬ １４ꎬ ２４]ꎮ 所以在此前我
们也使用过多个由 ｇｐｄ 启动子或 ＴｒｐＣ 启动子与
ｈｐｈ基因相连的转化载体ꎬ但都没有得到转化子ꎮ
这时就需要把 ｈｐｈ 基因与宿主真菌同源的强启动
子相连[８]ꎬＺｈａｎｇ 等[１５]的研究中对转化质粒进行
了同源启动子的改造ꎬ并成功得到转化子ꎮ 因此在
本研究中ꎬ将转化载体的启动子进行替换ꎬ从同源
纹枯菌 ＡＧ－３中扩增出 ａｃｔｉｎ 基因的启动子ꎬ使之
与 ｈｐｈ基因相连构成新的转化载体 ｐＲｓＡꎮ 实验结
果表明ꎬ该载体可以在单核丝核菌 ＪＮ 中调控 ｈｐｈ
基因的表达ꎬ即能够获得转化子ꎮ 此外ꎬ有研究报
导[４ꎬ ２５]ꎬ在 ｈｐｈ 基因的 ５′和 ３′端的非翻译区添加
内含子可以获得稳定的担子菌转化子ꎬ这是因为内
含子提高了 ｍＲＮＡ 的稳定性ꎮ Ｓｃｈｏｌｔｍｅｉｊｅｒ 等[２６]
研究还表明ꎬ将 ｈｐｈ 基因编码区 ５′末端的 Ａ / Ｔ 碱
基替换为 Ｃ / Ｔ 碱基ꎬ可以提高转化率ꎮ 这与 Ｗｕ
等[４]的研究结果一致ꎬ表明经过这种改造的载体
可以在 Ｒ. ｓｏｌａｎｉ中有较高的表达ꎮ
　 　 目前已经有 １００ 多种丝状真菌成功的实现了
遗 传 转 化[２７]ꎬ 如 稻 瘟 菌 ( Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ
ｇｒｉｓｅａ ) [２８ꎬ ２９]、 尖 孢 镰 刀 菌 ( Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ￣
ｒｕｍ) [２９ꎬ ３０]等ꎬ但作为担子菌的立枯丝核菌却鲜有
转化成功的报道ꎬ这极大地制约了对该菌遗传信息
的研究ꎮ 本文所采用的转化体系可以获得玉米纹
枯病菌的转化子ꎬ虽然转化子的抗性遗传不稳定ꎬ
但还是可以为以后的研究提供一些有价值的参考
依据ꎬ在建立稳定的立枯丝核菌转化体系过程中有
一定的研究意义ꎮ
　 　 致谢　 本实验中所使用的玉米纹枯病菌 ＸＮ５
菌株(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ＡＧ１￣ⅠＡ)为四川省农业
科学院植保所李晓研究员惠赠ꎬ在此作者表示衷心
地感谢ꎻ本文还要感谢国家公益性行业(农业)科
研专项 ＮＹＨＹＺＸ３￣１６三大作物纹枯菌种类与寄主
抗性的鉴定技术和山东省“泰山学者”建设工程专
项经费资助ꎮ
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责任编辑:曾晓葳　 　
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