全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(４): ３９５￣４００(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０９￣２５ꎻ 修回日期: ２０１５￣０３￣１２
基金项目: 中国科学院院知识创新工程重要方向项目(ＫＳＣＸ２￣ＥＷ￣Ｎ￣０６)
通讯作者: 邱金龙ꎬ研究员ꎬ主要从事植物免疫的分子机理以及生物技术通用方法研究ꎻＴｅｌ:０１０￣６４８０７３９８ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｑｉｕｊｌ＠ ｉｍ.ａｃ.ｃｎꎮ
第一作者: 王程程ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物与病原微生物互作方面的研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｗａｎｇｃｈｅｎｇｃｈｅｎｇ９８７６＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０４.００８
电压依赖性阴离子通道 ＶＤＡＣ３参与拟南芥先天免疫
王程程１ꎬ 杜秋丽２ꎬ 伍 粲１ꎬ 郭 葳１ꎬ 邱金龙１∗
( １中国科学院微生物研究所ꎬ北京 １００１０１ꎻ ２ 济宁学院生命科学与工程系ꎬ曲阜 ２７３１５５)
摘要:线粒体外膜蛋白电压依赖性阴离子通道(ＶＤＡＣ)是动物细胞凋亡调控系统中的关键组分ꎬ但其在植物中的功能还不明
确ꎮ 拟南芥 ＶＤＡＣ家族有 ４个成员ꎬ它们都能被病原菌诱导ꎬＶＤＡＣ１在由病原菌所引起的超敏性细胞死亡中发挥作用已有
报道ꎬ但 ＶＤＡＣ家族其他成员是否参与植物免疫反应还未见报道ꎮ 本研究以拟南芥相关 Ｔ￣ＤＮＡ插入突变体为材料ꎬ研究了
ＶＤＡＣ３基因在植物抗病反应中的功能ꎮ 病原相关分子模式 ｆｌｇ２２诱导的活性氧产生和胼胝质沉积在 ＶＤＡＣ３突变体中都显著
增强ꎬ表明ＶＤＡＣ３参与了病原相关分子模式触发的免疫反应ꎮ 此外ꎬ效应因子激发的超敏性细胞死亡在 ｖｄａｃ３突变体中也更
明显ꎬ显示 ＶＤＡＣ３也参与了效应子触发的免疫反应ꎮ 以上结果说明ꎬＶＤＡＣ３在多个层面参与植物的抗病反应ꎮ
关键词:拟南芥ꎻ 电压依赖性阴离子通道ꎻ ＶＤＡＣ３ꎻ 先天免疫
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＶＤＡＣ３ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ 　 ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ￣ｃｈｅｎｇ１ꎬ Ｄｕ Ｑｉｕ￣ｌｉ２ꎬ
ＷＵ Ｃａｎ１ꎬ ＧＵＯ Ｗｅｉ１ꎬ ＱＩＵ Ｊｉｎ￣ｌｏｎｇ１∗ 　 ( １ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１ꎬ
Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ Ｊｉｎｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｑｕｆｕ ２７３１５５ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｏｌｔａｇｅ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ (ＶＤＡＣｓ) ｐｌａｙ ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅｓ
ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＶＤＡＣｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｓｔｉｌｌ ｎｅｅｄ ｔｏ ｂｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ. Ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ ｇｅｎｏｍｅ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｆｏｕｒ ＶＤＡＣ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ａｌｌ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ＶＤＡＣ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ. Ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｓｔｕｄｉｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＶＤＡＣ１ ａｎｄ ＶＤＡＣ４ ａｒｅ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉ￣
ｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ. Ｎｏｎｅｔｈｅｌｅｓｓꎬ ｗｈｅｔｈｅｒ ｏｔｈｅｒ ＶＤＡＣ ｍｅｍｂｅｒｓ ａｌｓｏ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｓ ｓｔｉｌｌ ｕｎ￣
ｃｌｅａｒ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＶＤＡＣ３ ｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｗｅｒｅ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ. Ｔｈｅ ＰＡＭＰ
ｆｌｇ２２￣ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＯＳ ｂｕｒｓｔｓ ａｎｄ ｃａｌｌｏｓｅ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｖｄａｃ３ ｍｕｔａｎｔｓ. Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇｌｙꎬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ￣
ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ａｌｓｏ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ ｖｄａｃ３ ｍｕｔａｎｔｓ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＶＤＡＣ３ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｂｏｔｈ ＰＡＭＰ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ (ＰＴＩ) ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ (ＥＴＩ) .
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａꎻ ｖｏｌｔａｇｅ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌꎻ ＶＡＤＣ３ꎻ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ
中图分类号: Ｓ４３２.４４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０４￣０３９５￣０６
　 　 植物在与病原微生物长期的共同进化过程中ꎬ
形成了一套比较完善的免疫体系[１]ꎮ 这一体系大
致可以分为两个层面ꎮ 第一个层面是病原相关分
子模式触发的免疫 (ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｐａｔｔｅｒｎ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙꎬＰＴＩ)ꎮ ＰＴＩ 是基于植物
细胞表面比较保守的模式识别受体(ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇ￣
ｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓꎬＰＲＲｓ)ꎬ它们可以识别病原微生物
表面保守的特定分子特征ꎬ即病原相关分子模式
(ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓꎬ ＰＡＭＰｓ)ꎬ
进而将信号传入胞内启动下游的一系列抗病反应ꎮ
ＰＴＩ可以阻止环境中绝大部分病原菌对植物细胞
的入侵ꎬ其标志性反应是活性氧的爆发和胼胝质沉
积等ꎮ 而为了自身的繁殖与生长ꎬ病原微生物进化
出效应蛋白(ｅｆｆｅｃｔｏｒ)ꎬ这些效应蛋白可以被分泌
　
植物病理学报 ４５卷
到植物细胞内抑制植物的 ＰＴＩ 反应ꎮ 而植物也相
应的进化出可以直接或间接识别这些效应蛋白的
抗性蛋白( ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ)即 Ｒ 蛋白ꎬ进而触发
植物第二个层面的免疫反应ꎬ称之为效应子触发的
免疫( ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙꎬＥＴＩ)ꎬ其标志性
反应是病原菌侵染部位植物细胞的程序性死亡ꎬ即
超敏性反应 (ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅꎬＨＲ) [１￣３]ꎮ
　 　 电压依赖型阴离子通道蛋白(ｖｏｌｔａｇｅ￣ｄｅｐｅｎｄ￣
ｅｎｔ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌꎬＶＤＡＣ)于 １９７５ 年首次被发现ꎮ
哺乳动物的 ＶＤＡＣ 主要定位于线粒体外膜上ꎬ它
不仅调控线粒体内外物质的进出ꎬ在能量代谢、细
胞凋亡、物质运输和维持胞内钙稳态等多个过程中
均起着重要作用[４￣６]ꎮ 而且ꎬＶＤＡＣ 还在线粒体诱
导的细胞凋亡中也起到了重要的作用[５]ꎬ研究发
现ꎬＶＤＡＣ一方面与 Ｂｃｌ￣２家族蛋白相互作用调控
细胞死亡ꎬ另一方面参与形成线粒体通透性转运孔
ＰＴＰ(ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｏｒｅ)来调控线粒体内
外物质的进出ꎬ进而介导细胞凋亡[７ꎬ８]ꎮ
　 　 现在已经从动物、植物、原生生物和真菌中均
分离到 ＶＤＡＣ 基因ꎬ它具有在真核生物中均高度
保守的一些性质ꎬ例如单通道传导性、选择性、电压
依赖性等ꎮ 与动物中的研究相比ꎬ植物 ＶＤＡＣ 的
研究相对滞后ꎬ之前的研究主要集中于 ＶＤＡＣ 在
生长发育中的作用ꎬ而已有的证据暗示ꎬＶＤＡＣ 可
能也参与了植物抗病反应[７]ꎮ 已有文献报道ꎬ当
病原菌菊苣假单胞菌侵染烟草时ꎬＮｂＶＤＡＣ 表达
量发生上调ꎻＮｂＶＤＡＣ 沉默时ꎬ抗病防卫反应被抑
制[９]ꎮ 与此相似ꎬ拟南芥 ＶＤＡＣ 表达水平受到假
单胞杆菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ＤＣ３０００)侵染时
也大幅度提高ꎬ并伴随有 ＰＲ１蛋白的积累[１０]ꎮ
　 　 拟南芥 ＶＤＡＣ 家族有 ４ 个成员: ＶＤＡＣ１
( Ａｔ３ｇ０１２８０ )、 ＶＤＡＣ２ ( Ａｔ５ｇ６７５００ )、 ＶＤＡＣ３
(Ａｔ５ｇ１５０９０) 和 ＶＤＡＣ４ (Ａｔ５ｇ５７４９０) [１１]ꎮ 其中
ＶＤＡＣ１在由病原菌所引起的超敏性细胞死亡过程
(ＨＲ)中发挥作用已有报道ꎬ而且 ｖｄａｃ２ 和 ｖｄａｃ４
突变体中一些病程相关(ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄꎬＰＲ)
基因也组成型表达ꎬ所以推测它们也可能参与了植
物抗病反应[１２]ꎮ 此外ꎬＶＤＡＣ２ 参与水杨酸(ＳＡ)
的信号应答[１３]ꎮ 有趣的是 ｖｄａｃ１、 ｖｄａｃ２、ｖｄａｃ４ 突
变体和野生型相比都有生长迟缓ꎬ种子少且不饱满
等生长发育表型ꎬ然而 ｖｄａｃ３突变体却没有明显的
表型[１２]ꎬ这表明 ＶＤＡＣ３ 在植物中的主要作用可
能并不是参与了其生长发育方面的调控ꎮ 为了研
究基因 ＶＤＡＣ３是否参与了植物抗病反应ꎬ本研究
从拟南芥 ＶＤＡＣ３的 Ｔ￣ＤＮＡ插入突变体ｖｄａｃ３￣１和
ｖｄａｃ３￣２入手ꎬ研究了 ＶＤＡＣ３ 在植物免疫中的功
能ꎮ 最终结果表明 ＶＤＡＣ３ 在多个层面参与了植
物的抗病反应ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 实验材料
１.１.１　 植物材料　 本研究所用的拟南芥生态型均
为 Ｃｏｌ￣０ꎮ
１.１. ２ 　 试剂盒、工具酶及生化试剂 　 Ｔａｑ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等 ＰＣＲ相关试剂、Ｔｒｉｚｏｌ 均购自天根生
化科技(北京)有限公司ꎻ反转录试剂盒购自宝生
物工程(大连)有限公司ꎻＬｕｍｉｎｏｌ 和 Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ 购
自 Ｓｉｇｍａ￣Ａｌｄｒｉｃｈ 公司ꎻ ｆｌｇ２２ (ＱＲＬＳＴＧＳＲＩＮＳＡＫ￣
ＤＤＡＡＧＬＱＩＡ)由 ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ 公司合成ꎻ其他试剂均
为国产试剂分析纯ꎮ 引物合成以及测序工作均由
上海英骏生物技术有限公司完成ꎮ
１.２　 实验方法
１.２.１　 拟南芥生长条件　 拟南芥种植在营养土和
蛭石以及珍珠岩(１０ ∶ ４ ∶ １)混合的土壤上ꎬ置于
２１℃ꎬ７５％ 湿度ꎬ短日照(光照 ８ ｈꎬ黑暗 １６ ｈ)的温
室中生长ꎮ ４~６周大的植物用于实验ꎮ
１.２.２　 突变体基因型鉴定　 用 ＣＴＡＢ 法提取突变
体叶片的基因组 ＤＮＡꎬ根据数据库提供的基因组
序列ꎬ在 ＶＤＡＣ３ 基因上设计上下游引物 ＬＰ 和
ＲＰꎬ在 Ｔ￣ＤＮＡ插入序列上设计引物 ＬＢＰ(表 １)ꎬ
分别用 ＬＰ ＋ＲＰ 以及 ＬＢＰ ＋ＲＰ 为引物对基因组
ＤＮＡ进行 ＰＣＲ扩增ꎬＰＣＲ反应条件:９４℃预变性 ３
ｍｉｎꎬ９４℃ ３０ ｓꎬ６５℃ ３５ ｓꎬ７２℃ １ ｍｉｎ ( ３５ 个循
环)ꎬ７２℃ ８ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ产物用 １％琼脂糖凝胶电泳
分析ꎬ如果 ＬＰ＋ＲＰ 没有目的条带的扩增ꎬ而 ＬＢＰ＋
ＲＰ可以扩到大小正确的目的条带则说明突变体为
纯合突变体植株ꎮ
１.２.３　 ＲＴ￣ＰＣＲ 分析　 按照产品说明书提供的步
骤利用 Ｔｒｉｚｏｌ 提取拟南芥叶片总 ＲＮＡꎮ 取 ２ μｇ
总 ＲＮＡ以 ｏｌｉｇｏｄＴ 为引物进行反转录ꎬ反应体系
及反应程序按照 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ￣ＭＬＶ
(ＲＮａｓｅ Ｈ￣)产品说明书进行ꎮ 反转所得的 ｃＤＮＡ
进行稀释后用 ＶＤＡＣ３ 基因特异引物和拟南芥的
６９３
　
　 ４期 王程程ꎬ等:电压依赖性阴离子通道 ＶＤＡＣ３参与拟南芥先天免疫
内参 Ａｃｔｉｎ７引物(表 １)进行 ＰＣＲ 扩增ꎬＰＣＲ 反应
条件是:９４℃预变性 ３ ｍｉｎꎬ９４℃ ３０ ｓꎬ５８℃ ３０ ｓꎬ
７２℃ ４５ ｓ (３０个循环)ꎬ７２℃ ８ ｍｉｎꎮ
１.２.４　 ＲＯＳ的测定 　 用打孔器取直径为 ４ ｍｍ 的
拟南芥叶圆片放入 ９６孔板中ꎬ每个孔加入去离子水
２００ μＬꎬ室温下避光静止过夜ꎮ 轻轻吸去去离子水ꎬ
加入 ２００ μＬ 的 ＲＯＳ 测定溶液ꎬ然后用酶标仪按 ２
ｍｉｎ一个单位ꎬ测量 ３０ ｍｉｎ 记录相关吸光值ꎮ ＲＯＳ
测定溶液:Ｌｕｍｉｎｏｌ(１ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１)４ μＬ、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
(１ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１) ２ μＬ最后加去离子水至 ２００ μＬ ꎮ
１.２.５　 胼胝质沉积　 用 １ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ ｆｌｇ２２ 注射处理
５周的拟南芥叶片ꎮ １６ ｈ 后将处理叶片用 ９５％酒精
浸泡 ２ ｈꎬ然后用 ７０％的酒精浸泡至完全脱色ꎬ用蒸馏
水清洗并浸泡过夜ꎮ 再将脱色叶片置于含有 １％苯胺
蓝的 １５０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ Ｋ２ＨＰＯ４溶液中避光处理 ３０ ｍｉｎ~
１ ｈꎬ最后将处理好的叶片放在有６０％的甘油醇的载玻
片上ꎬ在荧光显微镜下用紫外线照射观察ꎬ并用 Ｉｍａｇｅ
Ｊ (ｈｔｔｐ: / / ｉｍａｇｅｊ.ｎｉｈ.ｇｏｖ / ｉｊ / )对图像进行统计处理ꎮ
１.２.６　 超敏反应(ＨＲ) 　 将培养过夜携带有无毒
基因的丁香假单胞菌 ＤＣ３０００ (ａｖｒＲｐｔ２)、ＤＣ３０００
(ａｖｒＲｐｓ４)、ＤＣ３０００ ( ａｖｒＲｐｍ１)用 １０ ｍｍｏｌ􀅰 Ｌ￣１
ＭｇＣｌ２悬浮并分别调至 ＯＤ６００ 为 ０. ００５、 ０. ０１、
０.０５ꎬ然后注射在短日照条件下生长 ４ 周的拟南芥
叶片ꎬ４８ ｈ后观察叶片超敏死亡反应ꎮ
１.２.７　 Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ 染色　 用丁香假单胞菌无毒菌
株(ＯＤ６００＝０.２)注射短日照条件下生长 ４ 周的拟
南芥叶片ꎬ４８ ｈ 后取注射过的叶片放入 １５ ｍＬ 管
中ꎬ加入 Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ至完全浸泡ꎬ然后煮沸 ５ ｍｉｎꎬ
常温下放置过夜ꎬ用水合氯醛溶液处理至脱色完
全ꎬ最后保存于 ５０％的甘油中ꎬ显微镜观察ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＶＤＡＣ３基因 Ｔ￣ＤＮＡ插入突变体的获得及鉴定
　 　 为了研究拟南芥 ＶＤＡＣ３(ＡＴ５Ｇ１５０９０)基因是否
参与抗病反应ꎬ我们从美国的拟南芥生物资源库
(Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＣｅｎｔｅｒꎬＯｈｉｏ)订
购了 ＶＤＡＣ３的 Ｔ￣ＤＮＡ插入突变体 ｖｄａｃ３￣１(ＳＡＬＫ＿
１２７８９９Ｃ)和 ｖｄａｃ３￣２(ＣＳ８７２３７４)ꎬ它们的 Ｔ￣ＤＮＡ插入
方式分别是在 ＶＤＡＣ３基因的 ５′ＵＴＲ(ｖｄａｃ３￣１)和第 ３
个外显子上(ｖｄａｃ３￣２)(图 １￣Ａ)ꎮ 我们通过 ＰＣＲ对购
买来的突变体进行基因型鉴定ꎬ以基因特异的引物
(ＬＰ和 ＲＰ)以及 ＬＢＰ 配对对突变体基因组 ＤＮＡ进
行扩增(图 １￣Ｂ)ꎮ 结果显示ꎬ在野生型中ＬＰ＋ＲＰ有目
的条带的扩增ꎬ大小约 １ １００ ｂｐꎬＬＢＰ＋ＲＰ未有目的条
带扩增ꎬ而在突变体中正相反ꎬＬＰ＋ＲＰ未有目的条带
扩增ꎬＬＢＰ ＋ＲＰ 扩增到了大小正确的目的片段ꎬ
ｖｄａｃ３￣１扩到约 ５００ ｂｐ 大小的带ꎬ而 ｖｄａｃ３￣２扩到约
７００ ｂｐ大小的条带ꎬ这表明 ｖｄａｃ３￣１和 ｖｄａｃ３￣２均为
Ｔ￣ＤＮＡ插入的纯合突变体ꎮ 我们进一步检测了这些
突变体中 ＶＤＡＣ３基因的表达水平ꎮ 用位于 Ｔ￣ＤＮＡ
插入位点下游的 ＶＤＡＣ３ 基因一对特异性引物
ＶＤＡＣ３￣Ｆ和 ＶＤＡＣ３￣Ｒ进行 ＲＴ￣ＰＣＲꎮ ＲＴ￣ＰＣＲ结果
显示ꎬ以 ＡＣＴＩＮ７基因为表达丰度参照ꎬ在 ｖｄａｃ３￣１和
ｖｄａｃ３￣２中 ＶＤＡＣ３转录水平较野生型均显著下调(图
１￣Ｃ)ꎬ该结果表明 ｖｄａｃ３￣１ 和 ｖｄａｃ３￣２ 为基因抑制
(ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ)或为截断(ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ)突变体ꎮ
２.２ 　 病原相关分子模式 ｆｌｇ２２ 诱导的反应在
ｖｄａｃ３突变体中显著增强
　 　 多肽 ｆｌｇ２２ 是鞭毛蛋白氮端一段保守的 ２２个
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＰＣＲ
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′￣３′)
ｖｄａｃ３￣１￣ＬＰ ＴＧＡＡＴＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＴＡＡＴＣＣＣＴＧ
ｖｄａｃ３￣１￣ＲＰ ＡＧＡＧＴＡＣＡＣＧＧＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＴＧ
ｖｄａｃ３￣１￣ＬＢＰ ＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＣＴＣＡＡＣＣＣＴＡＴＣ
ｖｄａｃ３￣２￣ＬＰ ＡＴＴＴＣＴＡＴＣＧＧＴＣＡＣＧＣＴＴＡＧＧＴＣＧＴＴＧ
ｖｄａｃ３￣２￣ＲＰ ＧＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧ
ｖｄａｃ３￣２￣ＬＢＰ ＧＴＣＣＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＡＧＴＴＧＴＣＴＡＡＧ
ＶＤＡＣ３￣Ｆ ＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＣＡＡＡＧ
ＶＤＡＣ３￣Ｒ ＣＡＡＣＣＴＴＧＧＣＡＣＴＣＴＴＡＴＣＧＡＴＣ
Ａｃｔｉｎ￣Ｆ ＧＧＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＧＴＣＴＧ
Ａｃｔｉｎ￣Ｒ ＴＧＴＧＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＡＴＣ
７９３
　
植物病理学报 ４５卷
氨基酸ꎬ是被广泛证明的分子模式(ＰＡＭＰ)ꎮ 为了
检测 ＶＤＡＣ３是否参与了植物抗病的 ＰＴＩ 过程ꎬ我
们用 ｆｌｇ２２去处理拟南芥野生型和 ｖｄａｃ３突变体植
物叶片ꎮ 我们首先检测了 ｆｌｇ２２ 激发的活性氧
(ＲＯＳ)的产生ꎬ与野生型相比较ꎬ在 ｖｄａｃ３￣１ 和
ｖｄａｃ３￣２突变体中 ｆｌｇ２２ 诱导的活性氧的爆发都明
显增强(图 ２￣Ａ)ꎬ以 ｖｄａｃ３￣１突变体更为明显ꎮ 活
性氧爆发是植物细胞一个早期的应对ＰＡＭＰ的反
Ｆｉｇ. １　 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＶＤＡＣ３ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｌｉｎｅｓ
Ａ: Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＶＤＡＣ３ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ. Ｆｉｌｌｅｄ ｂｏｘｅｓꎬ ｅｘｏｎｓꎻ ｏｐｅｎ ｒｅｇｉｏｎｓꎬ
ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓꎻ ｂｌａｃｋ ｌｉｎｅｓꎬ ｉｎｔｒｏｎｓ. Ｂ. Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＶＤＡＣ３ ｍｕｔａｎｔｓ. Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ
ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＬＰ＋ＲＰ ａｎｄ ＬＢＰ＋ＲＰ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ. Ｃ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＶＤＡＣ３ ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ｂｙ ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｉｎ ＶＤＡＣ３ ｍｕｔａｎｔ ｌｅａｖｅｓ. Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＡＣＴＩＮ７ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ.
Ｆｉｇ. ２　 ＰＡＭＰ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｖｄａｃ３ ｍｕｔａｎｔｓ
Ａ. ＲＯＳ ｂｕｒｓｔｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｆｌｇ２２ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｅａｆ ｄｉｓｃｓ ａｒｅ ｓｈｏｗｎ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ (ＲＬＵ) . Ｂ. Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ
ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓ ｏｆ ｆｌｇ２２￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｌｌｏｓｅ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｅａｖｅｓ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａｎｉｌｉｎｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ.
Ｃ. Ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｃａｌｌｏｓｅ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｐｅｒ ｍｍ２ . Ｂａｒ＝ １ ｍｍ. Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＤ. ∗∗Ｐ<０.０１ ( ｔ￣ｔｅｓｔ) .
８９３
　
　 ４期 王程程ꎬ等:电压依赖性阴离子通道 ＶＤＡＣ３参与拟南芥先天免疫
Ｆｉｇ. ３　 Ｅｆｆｅｃｔｏｒ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｖｄａｃ３ ｍｕｔａｎｔｓ.
Ａ. Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｐｓｔ ＤＣ３０００ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｅａｖｅｓ. Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ
ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｗｅｒｅ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｅｄ ａｔ ４８ ｈ ａｆｔｅｒ ｌｏｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｐｓｔ ＤＣ３０００(ａｖｒＲｐｔ２ꎬａｖｒＲｐｓ４ꎬａｖｒＲｐｍ１)
Ｂａｒ＝ １ ｃｍ. Ｂ. Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅａｖｅｓ ｉｎ Ａ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ. Ｂａｒ＝ ０.３ ｍｍ.
应ꎬ而胼胝质沉积( ｃａｌｌｏｓｅ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ)则是一个相
对晚期的 ＰＴＩ 反应ꎮ 为了进一步验证 ＶＤＡＣ３ 参
与了拟南芥抗病反应的 ＰＴＩ过程ꎬ我们检测了胼胝
质沉积ꎮ 用 ｆｌｇ２２ 处理植物后ꎬ大约 １６ ｈ 后取叶
片ꎬ用苯胺蓝染色ꎬ荧光显微镜下紫外照射观察其
胼胝质沉积的情况ꎬ与野生型相比ꎬ在 ｖｄａｃ３￣１ 和
ｖｄａｃ３￣２中 ｆｌｇ２２ 诱导的胼胝质沉积都显著增多
(图 ２￣Ｂ)ꎬ与活性氧爆发相同ꎬ以 ｖｄａｃ３￣１ 突变体
最为明显(图 ２￣Ｃ)ꎮ 以上结果说明ꎬＶＤＡＣ３ 参与
了拟南芥的 ＰＴＩ过程ꎮ
２.３　 拟南芥 ｖｄａｃ３ 突变体中无毒菌株所引起的
超敏反应加剧
　 　 我们进一步研究了 ＶＡＤＣ３ 是否也参与了植
物的 ＥＴＩ反应ꎮ 用携带有无毒基因的丁香假单胞
菌 Ｐｓｔ ＤＣ３０００ ( ａｖｒＲｐｔ２ )、 ＤＣ３０００ ( ａｖｒＲｐｓ４ )、
ＤＣ３０００(ａｖｒＲｐｍ１)注射在短日照条件下生长 ４ 周
的拟南芥野生型以及 ｖｄａｃ３￣１、ｖｄａｃ３￣２ 突变体叶
片ꎬ４８ ｈ 后观察注射部位的超敏性细胞死亡ꎮ 结
果显示ꎬ与野生型相比ꎬ在 ｖｄａｃ３￣１和 ｖｄａｃ３￣２突变
体中三种非致病菌诱导的超敏性细胞死亡都加速
了(图 ３￣Ａ)ꎮ 台盼蓝用于对死细胞染色ꎮ 通过对
接菌 Ｐｓｔ ＤＣ３０００ (ａｖｒＲｐｍ１)后的叶片进行台盼蓝
染色ꎬ进一步验证了 ｖｄａｃ３￣１ 和 ｖｄａｃ３￣２ 突变体中
细胞死亡的程度较野生型更加严重(图 ３￣Ｂ)ꎮ 由
此可见ꎬＶＤＡＣ３也参与了植物的 ＥＴＩ过程ꎮ
３　 讨论
　 　 植物与病原菌长期进化过程中形成了 ＰＴＩ 和
ＥＴＩ两个层面的较为完善的免疫防卫体系ꎮ 越来越
多的证据表明阴离子通道在其中起着十分重要的作
用ꎮ 阴离子外流(ａｎｉｏｎ ｅｆｆｌｕｘ)是植物抗病早期反应
之一[１４~１６]ꎬ与一系列抗病早期反应如质膜去极化、钙
离子内流、活性氧爆发等相关ꎮ 另外发现使用阴离子
通道抑制剂可明显降低烟草悬浮细胞液泡加工蛋白
的转录水平ꎬ并显著抑制细胞超敏死亡[１７]ꎮ 笔者在之
前的工作中也发现拟南芥的先天免疫中 Ｒ型(ｒａｐｉｄ
ａｃｔｉｖｅｄ ｔｙｐｅ)和 Ｓ型(ｓｌｏｗ ａｃｔｉｖｅｄ ｔｙｐｅ)的阴离子通道
起着相反的作用ꎬ抑制 Ｒ型阴离子通道可以增强 ＰＴＩ
和 ＥＴＩ反应ꎬ而抑制 Ｓ型阴离子通道则抑制这两个反
应[１８]ꎮ 此外ꎬ研究证明拟南芥中氯离子通道 ＣＬＣｄ负
调控其 ＰＴＩ反应ꎬ为阴离子通道参与植物免疫提供了
直接证据[１９]ꎮ 研究发现除了氯离子通道 ＣＬＣ外ꎬ电压
９９３
　
植物病理学报 ４５卷
依赖性阴离子通道(ＶＤＡＣ)也是非常重要的阴离
子通道家族ꎮ 在动物中 ＶＤＡＣ参与线粒体诱导的
细胞死亡ꎬ而最近发现植物 ＶＤＡＣ 不仅参与了植
物生长发育过程ꎬ也参与了植物抗病免疫方面的调
控[１２]ꎮ 本研究以拟南芥 ＶＤＡＣ３ 的两个 Ｔ￣ＤＮＡ
插入突变体为材料ꎬ发现 ＰＴＩ和 ＥＴＩ反应在 ｖｄａｃ３￣
１、ｖｄａｃ３￣２ 突变体中均显著增强ꎬ表明拟南芥
ＶＤＡＣ３负调控植物免疫ꎮ 这为 ＶＤＡＣ３ 阴离子通
道参与植物抗病免疫提供了证据ꎮ
　 　 本研究初步表明 ＶＤＡＣ３在 ＰＴＩ 和 ＥＴＩ 两个层
面上参与了拟南芥先天免疫ꎬ但其具体的作用机理
仍需进一步的探索和研究ꎮ 已有研究发现 ＶＤＡＣ３
可以与拟南芥类驱动蛋白 ＫＰ１ 互作共同调控低温
下种子萌发过程中的呼吸作用[２０]ꎬ而且 ＶＤＡＣ３ 与
ＡＢＡ受体蛋白 ＲＣＡＲ１、ＲＣＡＲ３也均相互作用ꎬ推测
其可能参与了 ＡＢＡ 信号途径[２１]ꎬ这些都为研究
ＶＤＡＣ３调控植物抗病反应的机制提供了线索ꎮ
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ｃｒｙｐｔｏｇｅｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎ￣
ｓｅｓ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ [ Ｊ] . Ｔｈｅ
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[１８] Ｇｕｏ Ｗꎬ Ｗａｎｇ Ｃꎬ Ｚｕｏ Ｚꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ａｎｉｏｎ
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＆Ｂｅｈａｖｉｏｒꎬ ２０１４ꎬ ９: ２９２３０.
[１９] Ｇｕｏ Ｗꎬ Ｚｕｏ Ｚꎬ Ｃｈｅｎｇ Ｘꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ
ｆａｍｉｌｙ ｇｅｎｅ ＣＬＣｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ａｓｓｏ￣
ｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ (ＰＡＭＰ) ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ
ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙꎬ
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[２０] Ｙａｎｇ Ｘꎬ Ｃｈｅｎ Ｚꎬ Ｘｕ Ｔꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｋｉｎｅｓｉｎ
ＫＰ１ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＶＤＡＣ３ꎬ ａ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉ￣
ａｌ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉ￣
ｎａｔｉｏｎ ａｔ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ [ Ｊ] . Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２０１１ꎬ
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[２１] Ｌｉ Ｄꎬ Ｚｈａｎｇ Ｌꎬ Ｐｅｎｇ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉ￣
ｎａｒｙ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＡＢＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ＲＣＡＲ１ / ＰＹＬ９( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ) [四川大学学报
(自然科学版)]ꎬ ２０１１ꎬ ４８(２): ４８６￣４９０.
责任编辑:曾晓葳
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