全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(2): 149-156(2013)
收稿日期: 2012-07-25; 修回日期: 2012-12-10
基金项目: 国家高技术研究发展计划(863 计划)(2011AA10A205); 河北省财政专项(F12C10036)
通讯作者: 马 平,研究员,博士生导师,从事植物病害生物防治研究; Tel:0312-5915678, E-mail: pingma88@126. com
第一作者: 石 磊,女,黑龙江海伦人,硕士研究生,主要从事植物病害生物防治研究; E-mail: shilei19870918@163. com。
具分泌几丁质酶活性的生防细菌的筛选鉴定
及其几丁质酶基因的克隆和表达
石 磊1,2, 杜锦锦2, 郭庆港1, 李宝庆1, 鹿秀云1, 李社增1, 马 平1∗
( 1河北省农林科学院植物保护研究所, 河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心,
农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室, 保定 071000; 2 河北农业大学植物保护学院, 保定 071000)
摘要:本研究通过平板透明圈法筛选获得一株具有几丁质酶活性的生防细菌 CAB-1,该菌株对番茄灰霉病菌等多种病原真菌
表现较强的拮抗活性。 通过生理生化、16S rDNA和 gyrB基因序列测定,将菌株 CAB-1 鉴定为萎缩芽胞杆菌(Bacillus atro-
phaeus)。 对菌株 CAB-1全基因组序列进行分析和功能预测,发现该菌株存在 2 个几丁质酶编码基因 chit1 和 chit2。 通过
PCR技术从菌株 CAB-1中克隆出这两个几丁质酶的编码基因并在大肠杆菌中表达,其原核表达产物均表现几丁质酶活性,其
中 chit1的原核表达产物能够显著抑制灰霉菌分生孢子的萌发。 对其原核表达条件进行优化,发现在 30℃下振荡培养 24 h,
IPTG浓度为 0. 2 ~ 1. 0 mmol / L时,其蛋白表达量最高。
关键词:萎缩芽胞杆菌; 生防菌; 几丁质酶; 基因克隆; 原核表达
Screening and identification of an antifungal chitinolytic bacterium and its gene
cloning and expressing 　 SHI Lei1,2, DU Jin-jin2, GUO Qing-gang1, LI Bao-qing1, LU Xiu-yun1,
LI She-zeng1, MA Ping1 　 (1 Plant Protection Institute Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, IPM centre of
Hebei Province, Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture, Baoding 071000,
China; 2 College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China)
Abstract: Bacterial strain CAB-1 was isolated according to its chitinolytic activity and antifungal activities a-
gainst plant pathogens including Botrytis cinerea in virto. Strain CAB-1 was identified as Bacillus atrophaeus
based on the biochemical characters, sequences analysis of 16S rDNA and gyrB. Through sequence analysis and
function predicting based on it whole genome, two chitinase genes were located and cloned from strain CAB-1.
These two cloned chitinase genes were ligated into the prokaryotic expression vector and fusion proteins were in-
duced. Chitinase activities of the induced protein Chit1 and Chit2 were testified by plate transparent circle meth-
od. In the meantime, only Chit1 protein showed antifungal activity against B. cinerea. The expression condition
of Chit1 protein was optimized. The results showed that incubating at 30℃ for 24 hours in shaker and induced by
IPTG of 0. 2 mmol / L to 1. 0 mmol / L was recognized as the optimized condition for Chit1 protein production.
Key words: Bacillus atrophaeus; biocontrol bacteria; chitinase; gene cloning; prokaryotic expression
中图分类号: S432　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)02-0149-08
　 　 随着植物病原菌抗药性和农药残留等问题的
日益突出,利用微生物杀菌剂防治植物病害已成为
研究热点之一。 几丁质酶能够有效降解高等真菌
细胞壁中的几丁质成分,从而抑制或杀死多种植物
病原菌,因此,对能产生几丁质酶生防菌的研究及
利用将为植物病害生物防治提供新的研究思路。
　
植物病理学报 43 卷
近年来,国内外学者相继从哈茨木霉菌(Trichoder-
ma harzianum) [1]、绿粘帚霉菌 (Gliocladium vi-
rens) [2]以及枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) [3]中
分离纯化得到几丁质酶,同时发现这些几丁质酶对
灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和尖孢镰刀菌(Fu-
sarium oxysporum)的菌丝生长具有明显的拮抗活
性。 Xiao等[4]发现地衣芽胞杆菌(Ba. lichenifor-
mis)MY75 菌株中的几丁质酶异源表达产物能够
抑制小麦赤霉菌(F. graminearumt)和黑曲霉菌
(Aspergillus niger)的孢子萌发;Huang等[5]从百合
上分离获得具有壳多糖分解活性的蜡样芽胞杆菌
(Ba. cereus)菌株 28-9,从中克隆获得几丁质酶基
因 ChiCW并实现了该基因的原核表达,诱导表达
的几丁质酶对百合灰霉菌(Bo. elliptica)孢子的萌
发具有明显的抑制作用。 Kern 等[6] 从绿僵菌
(Metarhizium flavoviride)中克隆出几丁质酶基因
chit1,该基因可异源表达内切几丁质酶,将该基因
转入烟草中,转基因植株增强了对立枯病的抗病能
力;Zhu等[7]发现转几丁质酶基因和葡聚糖酶基因
棉花植株可增强其对棉花黄萎病的抗性。 Zhang
等[8]将枯草芽胞杆菌中的几丁质酶基因转入越南
伯克氏菌 P418 中,重组菌株显著增强了对小麦纹
枯病、棉花黄萎病和番茄灰霉病的防效。 因此,筛
选具有几丁质酶活性的拮抗微生物,一方面可以直
接利用抑制植物病原菌的正常生长,另一方面可以
通过克隆几丁质酶基因,为转基因植物和构建生防
工程菌株提供抗病基因资源。
本研究通过对目标生防细菌进行大量定向筛
选,获得一株既具有明显几丁质酶活性,又对多种
植物病原菌具有较强抑菌活性的生防细菌菌株
CAB-1,温室实验表明菌株 CAB-1 对番茄灰霉病
防治效果高达 85%以上(未列出结果)。 因此,本
研究首先对菌株 CAB-1 进行了鉴定,同时根据其
产几丁质酶的特点,开展了几丁质酶基因的克隆和
原核表达,检测了原核表达产物对番茄灰霉病菌的
抑菌活性,最后对几丁质酶基因 chit1 原核表达的
条件进行了优化,为进一步明确该菌株的生防机制
及其实际应用奠定基础。
1　 材料与方法
1. 1　 供试菌株及质粒
用于几丁质酶活性筛选的生防菌株和番茄灰
霉菌(Bo. cinerea)均由河北省农林科学院植物保
护研究所植物病害生物防治实验室保存。 克隆所
需大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3)购自北京全式金
公司;原核表达载体 pET-28a由河北农业大学生命
科学学院朱宝成教授惠赠。
1. 2　 具几丁质酶活性的生防菌株筛选
利用平板透明圈法[9]筛选具有几丁质酶活性
的生防菌株。 将供试菌株用灭菌牙签接种到胶体
几丁质培养基上,37℃静置培养 5 d,根据菌落周围
是否形成透明圈确定生防菌株是否具有几丁质酶
活性。 通过测量透明圈直径大小确定几丁质酶活
性的强弱;每个待测菌株重复检测 3 次。
几丁质培养基的制作,FeSO4·7H2O 0. 004 g、
K2HPO4 0. 28 g、KH2PO4 0. 12 g、MgSO4 ·7H2O
0． 2 g、ZnSO4 0. 0004 g、琼脂 6 g,溶解在 200 mL
超纯水中,与等体积的 1%胶体几丁质混合后分装
到 250 mL 三角瓶中,100 mL /瓶,121℃高压灭菌
30 min。
1%胶体几丁质的制作:2 g几丁质溶于 35 mL
浓盐酸,搅拌 4 ~ 6 h,4℃放置过夜,过滤后用去离
子水洗涤至 pH = 7,定容至 200 mL,分装到 250
mL三角瓶中,4℃避光保存[10]。
1. 3　 目标生防菌株的鉴定
利用 API50 CHB 试验条(法国梅里埃公司)
对 CAB-1 菌株进行生理生化测定。 根据获得的 50
个生理生化指标在 API 菌株鉴定数据库进行检
索,明确 CAB-1 菌株的分类地位。
以新活化的 CAB-1 菌株单菌落为模板,分别
利用 16S rDNA 的保守引物 F27 / R1492[11]和细菌
DNA促旋酶 B 亚基(gyrB)基因的保守引物 gyrB-
F / gyrB-R[12]进行菌落 PCR 扩增。 50 μL PCR 扩
增体系包含:5 μL 10 × Taq DNA 聚合酶 buffer、5
μL dNTPs、2 μL 正向引物(10 μmol / L)、2 μL 反
向引物(10 μmol / L)、1 μL Taq DNA聚合酶(5 U /
μL),无菌水 34 μL。 PCR 扩增反应条件为:95℃
预变性 5 min;94℃变性 45 s,56℃复性 45 s,72℃
延伸 1 min,35 个循环;72℃ 充分延伸 10 min。
PCR产物经试剂盒纯化后连接到 pEASY-T3 载体
上,转化大肠杆菌 DH5α,经 PCR 验证后挑选阳性
克隆送交北京华大基因组研究中心测序。 利用
DNAStar软件对测序结果进行拼接,利用 Clustal X
051
　
　 2 期 　 　 石 磊,等:具分泌几丁质酶活性的生防细菌的筛选鉴定及其几丁质酶基因的克隆和表达
1. 8 和 MEGA 4. 0 软件绘制细菌的系统发育树,计
算不同菌株之间的遗传距离。
1. 4　 几丁质酶基因克隆及原核表达载体的构建
通过对菌株 CAB-1 全基因组序列进行测序及
功能预测分析,获得 2 个编码几丁质酶基因(chit1
和 chit2)的序列。 在 2 个基因上、下游分别设计引
物,进行几丁质酶基因 chit1 和 chit2 的克隆。 chit1
基因上游引物:5′-CGCGGATCC ATG AAAAAA-
GTGTTTTC-3′, 下游引物:5′-ACACTCGAG TTA -
TTTGCAATCACCAATTA-3′; chit2 基因上游引
物:5′-CCGGGATCCA ATG AATGAAGTGAAA-
AGAA-3′,下游引物:5′-ACACTCGAG TCA CT-
GGCCTTTCAGACTG-3′,下划线分别为 BamHⅠ
酶切位点和 EcoRⅠ酶切位点,方框分别是起始密
码子和终止密码子。 50 μL PCR 扩增体系包含:5
μL 5 × Primer STAR buffer、5 μL dNTPs、2 μL 正
向引物(10 μmol / L)、2 μL 反向引物(10 μmol /
L)、1 μL Primer STAR DNA聚合酶(2. 5 U / μL),
无菌水 34 μL。 PCR扩增反应条件为:95℃预变性
5 min;94℃变性 45 s,56℃复性 45 s,72℃延伸 1. 5
min,35 个循环;72℃充分延伸 10 min。 PCR 产物
经 EcoR I 和 BamH I 酶切处理后插入到相同酶切
处理的 pET-28a 载体,转化到 DH5α,构建的表达
载体分别为 pET-chit1 和 pET-chit2。 通过测序对
构建好的表达载体进行验证。
1. 5　 目的基因的生物信息学分析
利用 SignalP 4. 0 Server 软件 ( http: / / www.
cbs. dtu. dk / services / SignalP / )在线预测蛋白质的
信号肽序列;利用 DNAMAN软件对目标基因进行
蛋白质翻译,同时预测蛋白质的分子量、pI 值及酸
碱性等。
1. 6　 原核产物诱导表达及几丁质酶活性测定
将构建好的表达载体转入大肠杆菌感受态细
胞 BL21(DE3)中,经 PCR 验证后挑取阳性克隆
BL21(pET-chit1)、BL21(pET-chit2)到 5 mL 含 50
μL / mL卡那霉素的 LB 中,37℃,180 r / min 培养
过夜;次日再以 1∶ 100 转接到 100 mL 的 LB 培养
基中 37℃,180 r / min培养至 OD600 =0. 5,加入 0. 5
mmol / L IPTG后继续在 37℃振荡培养 24 h。
取上述培养液 1 mL,12 000 r / min,4℃离心 2
min,PBS(磷酸盐)缓冲液(pH = 7. 0)洗涤菌体沉
淀,最终用 1 mL PBS悬浮。 利用超声波进行细胞
破碎,超声条件为:超声 10 s,间歇 10 s,重复 5 次。
破碎后的细胞 12 000 r / min 4℃离心 5 min,收集上
清液,用 0. 22 μm 细菌过滤器过滤后得到诱导表
达的粗蛋白液。
定性检测:在胶体几丁质平板上用直径 5 mm
打孔器打孔,在孔中注入 50 μL上述方法制成的诱
导表达的粗蛋白液,根据透明圈的形成,检测上清
液中所表达蛋白的几丁质酶活性,以空载体细胞破
碎后上清液为对照。
定量检测:参照 Xie 等[13]的方法测定诱导表
达蛋白的活性。 取 0. 5 mL 破碎细胞上清液,加
0． 5 mL 1%胶体几丁质和 0. 5 mL 磷酸盐缓冲液
(pH = 0. 7),在 37℃混匀反应 1 h 后,沸水浴 10
min,10 000 r / min离心 3 min取上清液 1. 3 mL,加
ddH2O定容至 2 mL,然后加入等体积的 3,5-二硝
基水杨酸在沸水中显色 6 min,最后在 540 nm波长
下检测吸光值,计算几丁质酶酶活。 以同等条件
下,梯度浓度的 N-乙酰氨基葡萄糖绘制标准曲线。
酶活力单位(U)以每 1 min产生 1 μmol / L 还原糖
所需的酶量计算。 用 Excel 对所得数据进行处理
分析。
1. 7　 原核表达产物抑菌活性的检测
采用牛津杯法[4]检测表达产物的抑菌效果:
在含有 1%琼脂(W/ V)PDA培养基上放置无菌牛
津杯,每个牛津杯内注入 150 μL 过滤的粗蛋白液
(约 1 mg)和 50 μL 番茄灰霉菌分生孢子悬浮液
(1 ×106个孢子 / mL)。 对照 1 为同样处理的空载
体周质蛋白加番茄灰霉菌分生孢子悬浮液,对照 2
为无菌水加番茄灰霉菌分生孢子悬浮液,25℃下培
养 3 d后观察番茄灰霉菌的生长情况。
1. 8　 诱导蛋白表达条件优化
将构建的携带有 pET-chit1 质粒的重组菌株
BL21(chit1)按照 1. 5 中的方法培养至 OD600 =
0． 5,加入不同浓度 IPTG (0、0. 2、0. 5、1 和 1. 5
mmol / L),然后分别置于不同温度下(15℃、20℃、
25℃、30℃和 35℃)诱导培养。 以相同处理的空载
体转化子 BL21(pET-28a)为对照。 培养液同样用
超声波处理,12 000 r / min 4℃离心 5 min 后,用
151
　
植物病理学报 43 卷
0． 22 μm 细菌过滤器过滤获得粗蛋白,利用 SDS-
PAGE检测诱导所得蛋白的表达情况。
2　 结果
2. 1　 目标生防菌株的筛选
通过对 162 株拮抗细菌的筛选,获得 9 株具有
几丁质酶活性的菌株,表 1 列出了这 9 株菌的几丁
质酶活性。 其中菌株 CAB-1 几丁质酶活性最强,
并且该菌株的发酵液能有效防治番茄灰霉病和黄
瓜白粉病(结果未列出)。 因此,本研究选用 CAB-
1 菌株进行后续研究。
2. 2　 生防菌株 CAB-1 的鉴定
从 CAB-1 菌株中克隆出 1. 05 kb的 16S rDNA
序列(GenBank登录号:JN571112. 1),序列比对发
现,该序列与萎缩芽胞杆菌(Ba. atrophaeus)菌株
1942 的 16S rDNA序列同源性最高,为 99. 5% ,其
次为枯草芽胞杆菌模式菌株 168 和解淀粉芽胞杆
菌模式菌株 FZB42,同源性均为 98. 7% 。 利用
API50 CHB测试条对 CAB-1 菌株进行生理生化鉴
定,结果显示,CAB-1 菌株为枯草芽胞杆菌的鉴定
ID( identification)为 92. 9% 。 进一步采用 gyrB 基
因序列对 CAB-1 菌株进行鉴定 (CAB-1 菌株的
gyrB基因 GenBank登录号:JQ713568),结果表明,
CAB-1 菌株的 gyrB 基因序列与萎缩芽胞杆菌的
gryB基因序列同源性最高,为 99% ,其次为枯草芽
胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌,同源性分别为 79%和
81% 。 根据 16S rDNA 序列和 gyrB 序列构建了
CAB-1 菌株的系统发育树(图 1)。 综合上述试验
结果,将菌株 CAB-1 鉴定为萎缩芽胞杆菌(Ba. at-
rophaeus)。
2.3　 CAB-1菌株中几丁质酶基因克隆及异源表达
通过对 CAB-1 菌株的全基因组序列进行分
析,获得 2 个几丁质酶编码基因( chit1 和 chit2),
chit1 基因全长为 1 791 bp,编码 596 个氨基酸,预
测分子量为 65. 8 kDa,其中包括含 N端 36 个氨基
酸的信号肽序列,pI 值为 4. 74,为酸性氨基酸;
chit2 基因全长为 2 091 bp,编码 696 个氨基酸,预
测分子量为 77. 8 kDa,前 32 个氨基酸序列为信号
肽序列,pI值为 4. 93,也是酸性氨基酸。 两个几丁
质酶基因序列间隔 64 bp。 通过序列对比发现,几
丁质酶基因 chit1 的核苷酸序列与萎缩芽胞杆菌菌
株 1942(CP002207. 1)和枯草芽胞杆菌 168 菌株
(AF069131. 1)中的几丁质酶基因序列同源性均达
到 99% ;几丁质酶基因 chit2 与短小芽胞杆菌
(Ba. pumilus)中几丁质酶基因序列的同源性为
96% 。 以 CAB-1 菌株基因组 DNA为模板,在几丁
质酶基因上下游设计特异性引物,扩增分别获得 2
个目的基因的 PCR 产物 (图 2-A),扩增片段用
BamHⅠ和 EcoR I处理后连接到 pET-28a载体上,
构建 2 个表达载体 pET-chit1 和 pET-chit2。 通过
对阳性克隆测序分析,证明表达载体中几丁质酶基
因序列正确。 将表达载体转入大肠杆菌 BL21
(DE3) 感受态细胞,分别进行诱导表达, SDS-
PAGE检测(图 2-B)。
Table 1　 Chitinase activity of bacterial strains
Strain Diameter of clony R1 / mm Diameter of transparent circle R2 / mm (R2 / R1) Ratio
CAB-1 4. 3 ± 0. 58 23. 0 ± 2. 64 5. 34
HMB12 2. 7 ± 1. 15 6. 3 ± 0. 58 2. 33
HMB50 7. 3 ± 0. 58 11. 3 ± 1. 15 1. 55
HMB73 5. 0 ± 1. 00 7. 3 ± 0. 58 1. 46
HMB94 4. 7 ± 0. 58 20. 0 ± 1. 73 4. 26
HMB95 8. 3 ± 0. 58 13. 0 ± 1. 00 1. 57
HMB101 4. 3 ± 0. 58 6. 7 ± 1. 15 1. 56
HMB128 4. 0 ± 1. 15 20. 0 ± 0. 58 5. 00
HMB157 9. 7 ± 1. 52 15. 3 ± 0. 58 1. 58
251
　
　 2 期 　 　 石 磊,等:具分泌几丁质酶活性的生防细菌的筛选鉴定及其几丁质酶基因的克隆和表达
Fig. 1　 The phyligenetic trees constructed based on 16S rDNA and gryB gene sequences
Fig. 2　 PCR products of chit1 and chit2 and SDS-PAGE analysis
of the expression products of Chit1 and Chit2
A: M: 250 bp DNA ladder; 1: chit1 PCR product; 2: chit2 PCR product
B: M: Protein molecular weight marker; Chit1: Expressed product of pET-chit1; Chit2: Expressed product of pET-chit2.
2. 4　 原核表达产物的活性检测
通过几丁质平板检测,chit1 和 chit2 原核表达
产物均具有几丁质酶活性。 根据 DNS 法(3,5-二
硝基水杨酸法)测得 Chit1 粗蛋白的几丁质酶酶活
力为 0. 39 U / mL,Chit2 的为 0. 17 U / mL,说明
Chit1 蛋白比 Chit2 蛋白的几丁质酶活性更强
(图 3)。
采用牛津杯法检测了 chit1 和 chit2 原核表
达产物对番茄灰霉菌分生孢子萌发的抑制作
用。 结果发现,只有 chit1 原核表达产物对灰霉
病菌孢子萌发和菌丝生长具有明显的抑制作用
(图 4) ,而几丁质酶 Chit2、空载体破碎后所得
粗蛋白和空白对照对孢子萌发和菌丝生长均没
有抑制作用。
351
　
植物病理学报 43 卷
Fig. 3　 Chitinase activity test of induced pro-
teins
Chit1: Periplasmic proteins of BL21(pET-chit1);
Chit2: Periplasmic proteins of BL21(pET-chit2);
CK: Periplasmic proteins of BL21(pET-28a) .
Fig. 4 　 Effect of Chit1 on conidial germina-
tion of Botrytis cinerea
Each cup was filled with 50 μL of spore-containing fluid (106
spores / mL) and 150 μL of different samples. Chit1: Culture
supernatant of the sonic-disrupted BL21 ( pET-chit1) cells;
CK1: Culture supernatant of sonic-distupted BL21(pET-28a)
cells; CK2: Sterile water.
2. 5　 几丁质酶 chit1 基因异源表达条件的优化
培养的重组菌株 BL21 ( pET-chit1)加入 0. 5
mmol / L IPTG 后,在 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃
下 180 r / min 振荡培养,诱导 24 h 后离心收集菌
体,菌体经超声波破碎后进行 SDS-PAGE 检测。
电泳结果显示获得了与预测蛋白大小一致的条带,
且从 15℃到 30℃表达量逐渐增加,到 30℃时表达
量达到最高随后表达量又呈下降趋势。 对照 BL21
(pET-28a)并未检测到相应蛋白。 研究结果表明
几丁质酶基因 chit1 的诱导表达最适温度为 30℃
(图 5)。
将重组菌株 BL21(pET-chit1)在 30℃下培养,
待菌液 OD600 = 0. 5 时分别加入不同浓度的 IPTG
(0、0. 2、0. 5、1. 0 和 1. 5 mmol / L)进行蛋白的诱导
表达。 电泳结果表明,在不加 IPTG 诱导条件下,
克隆的几丁质酶蛋白会有少量的本底表达,加入
IPTG会明显增加目的蛋白的表达量。 当 IPTG 浓
度为 0. 2、0. 5 和 1. 0 mmol / L 时诱导效果较好(图
6),而当浓度增加到 1. 5 mmol / L 时表达量下降。
空质粒对照 BL21 ( pET-28a)没有目的蛋白的表
达。 结果说明,IPTG 诱导 Chit1 几丁质酶表达的
最适浓度为 0. 2 ~ 1. 0 mmol / L。
3　 讨论
以往对细菌的鉴定主要采用 16S rDNA 序列
比对结合生理生化指标检测。 但国内外研究发现,
枯草芽胞杆菌及其近缘种(如解淀粉芽胞杆菌、萎
缩芽胞杆菌及摩加夫芽胞杆菌等)之间存在较高
的 16S rDNA序列同源性( >98% ),并且具有极为
相似的生理生化反应指标,因此,利用 16S rDNA
序列和生理生化指标检测无法准确地区分枯草芽
胞杆菌及其近缘种 [14]。 Wang 等[15]研究证实,利
用 gryB基因序列能准确区分枯草芽胞杆菌及其近
缘种。 本研究通过对 CAB-1 菌株进行生理生化测
定,证明 CAB-1 菌株为枯草芽胞杆菌,进一步利用
16S rDNA基因序列和 gryB 基因序列对 CAB-1 菌
株进行了分子鉴定,结果证明 CAB-1 菌株为萎缩
芽胞杆菌。
几丁质酶能够水解几丁质多聚体的 β-1,4 糖
苷键,最终将几丁质酶降解为 N-乙酰-β-D-葡萄糖
胺。 由于几丁质是除卵菌外植物病原真菌细胞壁
的重要组成成分,通过几丁质酶降解真菌细胞壁的
几丁质可达到抑制或杀死植物病原真菌的目的。
有些几丁质酶甚至对生防菌的防病作用起到了决
定性的作用,如缺失几丁质酶基因的粘质沙雷氏菌
菌株突变株,丧失了野生菌株对豌豆镰刀菌枯萎病
的防病能力[16];产几丁质酶的聚团肠杆菌(Enter-
obacter agglomerans)对棉花立枯病有显著的防病
451
　
　 2 期 　 　 石 磊,等:具分泌几丁质酶活性的生防细菌的筛选鉴定及其几丁质酶基因的克隆和表达
Fig. 5　 SDS-PAGE analysis of the expression product of Chit1 at different temperatures
M: Protein molecular weight marker; CK: Expressed product of pET-28a; 1 to 5 lanes:
Expressed product of pET-chit1 at different temperatures (15℃, 20℃, 25℃, 30℃ and 35℃) .
Fig. 6　 SDS-PAGE analysis of the expression product of Chit1 at different concentrations of IPTG
M: Protein molecular weight marker; CK: Expressed product of pET-28a; 1 to 5 lanes:
Expressed product of pET-chit1 at different concentrations of IPTG (0, 0. 2, 0. 5, 1. 0 and 1. 5 mmol / L) .
效果,其缺失几丁质酶突变株则无防病作用[17]。
因此,筛选具有几丁质酶活性的生防菌将有助于提
高生防菌的防病效果。
本研究中几丁质酶基因 chit1 和 chit2 的原核
表达产物均具有降解胶体几丁质的活性,序列比对
发现, Chit1 蛋白的氨基酸序列与 Ba. subtilis
(AAC23715. 1)和 Bacillus sp. DAU101(ABC66095. 1)
中的几丁质酶氨基酸序列相似性都高达 99% ,
Chit2 蛋白氨基酸序列与 Ba. pumilus SG2 chitinase
large(ABF50676. 1)的同源性为 97% 。 进一步研
究发现,只有 chit1 基因的表达产物对灰霉病菌孢
子萌发和菌丝生长具有显著的抑制作用。 许多研
究报道从哈茨木霉(T. harzianum)、粘质沙雷氏菌
(Serratia marcescens) 和苏云金芽胞杆菌 ( Ba.
thuringiensis)中克隆出的几丁质酶基因的原核表
达产物均对真菌生长表现抑制作用[18,19],而关于
萎缩芽胞杆菌中几丁质酶基因的原核表达产物的
抑菌活性还属首次报道。 研究表明,并非所有几丁
质酶都有抑菌活性,如环状芽胞杆菌的几丁质酶并
无抑菌活性[15]。 本研究中 chit2 原核表达产物对
番茄灰霉病菌的孢子萌发和菌丝生长也没有明显
的拮抗活性,其原因有待进一步探讨。
本研究中的生防菌株 CAB-1 对番茄灰霉病原
菌具有较强的拮抗活性(结果未列出),且原核表
达的几丁质酶 Chit1 对灰霉孢子萌发有显著的抑
制作用,说明几丁质酶是菌株 CAB-1 具有抑菌活
性的因素之一。 由于菌株 CAB-1 同时能产生多种
脂肽类抗生素,如 fengycin、surfactin 和 bacillomy-
cin D等物质(数据未列出),因此,几丁质酶 Chit1
是否与这些脂肽类抗菌物质具有协同增效的作用
还需进一步验证。
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责任编辑:曾晓葳
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